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关键词： 非小细胞肺癌   帕博利珠单抗   循环肿瘤DNA   肿瘤突变负荷  

摘要： 目的:近年来,免疫检查点抑制剂帕博利珠单抗(Pembrolizumab)被广泛用于转移性程序性死亡配体1(PD-L1)阳性的非小细胞肺癌(NSCLC)患者。然而,免疫检查点抑制剂的疗效通常是由肿瘤的影像学的变化评估的。研究发现,循环肿瘤DNA(ct DNA)可用于非侵袭性监测肿瘤动态,并已被证明是监测靶向治疗反应的生物标志物。在本研究中,通过动态监测ct DNA来探究其与Pembrolizumab单药治疗晚期NSCLC患者的疗效和耐药的关系。方法:收集2016年4月至2018年6月由江苏省苏北人民医院收治并经基因检测示表皮生长因子受体(EGFR)、间变性大细胞淋巴瘤激酶(ALK)阴性,免疫组化示PD-L1阳性[定义为肿瘤比例评分(TPS)≥1%]的晚期NSCLC患者共9例,所有患者接受Pembrolizumab(2 mg/kg)单药免疫治疗,每三周给药一次。通过包含425个癌症基因板块的靶向下一代测序(NGS)技术,对患者在基线、治疗后3周、6周和耐药时进行ct DNA基因突变分析。在基线时计算组织肿瘤突变负荷(t TMB)和血液肿瘤突变负荷(b TMB)。在基线、治疗开始后每9周进行一次计算机断层扫描(CT)检查,比较肿瘤病灶大小的改变以评价患者的疗效,疗效以无进展生存期(PFS)评价。PFS定义为从治疗开始到进展期疾病(PD)或因任何原因的死亡之间的时间。结果:1.在治疗期间,依据实体瘤疗效评价标准1.1版,所有患者每9周进行一次肿瘤疗效评估,其中4名患者(44%)疗效评价为部分缓解(PR),2例(22%)疗效评价为疾病稳定(SD),3例(33%)疗效评价为疾病进展(PD),客观缓解率(ORR)为44%。患者的m PFS为4个月(95%CI:2.5～5.5个月)。中位随访时间为20个月(范围为3～38个月)。2.我们对5例患者的配对基线组织和血浆中的基因进行测序,发现血浆中检测到的分子突变与肿瘤之间的一致性高达65%(37/57)。因此,血浆标本在很大程度上可以作为组织标本基因突变分析的补充或替代。Spearman相关分析显示,b TMB与t TMB之间存在一定的相关性(r=0.45)。PFS<3个月的患者TMB最低,PFS>3个月的患者TMB相对高。随着PFS的增加,b TMB有逐渐增加的趋势。3.有2例PFS>8个月的患者,ct DNA突变等位基因频率(MAF)在3周和6周时持续下降;5例PFS≤4个月的患者,3、6周时MAF呈上升趋势。在耐药期间,一些获得性耐药突变会随之发生,ct DNA中的MAF不断增加。在第9周CT疗效评估为部分缓解(PR),或最佳疗效为疾病稳定(SD)>6个月的患者早在第6周就发现ct DNA中MAF约≤1%;而9周CT疗效评估为(SD)并随后疾病进展的患者,6周ct DNA的MAF均高于1%。结论:1.b TMB水平与Pembrolizumab单药治疗的PFS相关。*** DNA中MAF基因的改变也可以预测其敏感性和耐药性。ct DNA作为监测NSCLC患者免疫治疗反应的敏感生物标志物,显示出了巨大的应用前景。

关键词： 转录调控   顺式调控元件   Self-PromotingEnhancers   真核生物基因  

摘要： 在真核生物中，启动子和增强子广泛参与基因表达的转录调控。近年来表观遗传修饰等一系列新的转录调控机制被发现，对细胞命运决定、疾病发生机制等方面的研究具有重要意义。经典的转录调控研究认为，启动子和增强子属于两种独立的顺式作用元件，具有多种不同的特征并在转录调控中发挥不同的作用。但近期的研究发现，启动子和增强子元件在特征和功能方面具有很高的相似性，部分启动子能够作为增强子远程调控其它基因的启动子;而部分增强子可作为启动子，起始长链非编码RNA的转录。鉴于启动子和增强子在特征和功能上的相似性，基因组上可能存在一类具有启动子和增强子双重功能的顺式调控元件，但在大部分时间内仅表现启动子或增强子活性。基于该假设，本研究提出并系统研究了一种新的顺式作用元件——SPEs(Self-PromotingEnhancers)。SPE元件同时具有启动子和增强子的活性和特征，能够独立起始SPE转录本的转录。本论文建立了基于多种组学数据的SPE转录本鉴定方法，在小鼠胚胎干细胞中鉴定了154个SPE元件及受其调控的SPE转录本，通过分子生物学方法和细胞生物学方法，我们分别验证了SPE转录本的表达和SPE元件的转录活性。并系统分析了SPE元件的组蛋白修饰、蛋白结合、转录方向性和序列特征，证明了SPEs同时具有启动子和增强子特征。此外我们发现SPE转录本的表达具有细胞特异性，并对其功能进行了预测。对SPE元件的研究有助于揭示一种新的启动子和增强子协同作用关系，为深入理解真核生物基因调控网络的组成与功能提供帮助。

关键词： 纳米孔   纳米孔荧光检测技术   高通量纳米孔阵列   DNA测序   单分子生物传感   RNA三级结构   tRNA  

摘要： 自1996年Kasianowicz等人首次利用膜通道蛋白传感单链DNA以来,纳米孔技术便以其简单灵敏等优势和单分子测序的潜在应用前景获得了广泛的关注,并逐渐发展成为一种体系完整的单分子生物物理学手段,在基础化学、生命科学、临床诊断和环境监测等诸多领域发挥了重要作用。2014年,牛津纳米孔公司所开发的商用化纳米孔测序仪问世,并将纳米孔领域的发展推向高潮。随后,纳米孔测序技术凭借其长读长、免扩增等优势在表观遗传学和新物种基因组测序等应用领域展现独特优势,是第三代测序技术的重要代表。随着大数据和云计算的快速发展,基因组、转录组、表观组和结构基因组成为研究潮流,人们对高通量纳米孔测序技术的需求愈发迫切。然而受限于现有的微电子和微电极加工技术,依赖于膜片钳的传统纳米孔电流检测技术难以在不显著提高成本和装置体积的提前下大幅提高其检测通量。与电流分析方法相比,光学成像技术在通量上具有无可比拟的优势。受到光学膜片钳技术的启发,Bayley等人提出了基于钙离子荧光的纳米孔荧光检测技术,将电化学信号转化为荧光信号,通过荧光标记钙离子流束实时监测单个纳米孔内单分子行为。该技术将纳米孔的理论检测通量提高至10～4/mm2,同时兼具单分子传感能力和低检测成本,具有广泛的产业化应用价值。本论文研究重点在于解决纳米孔荧光检测技术的现有问题,降低技术性壁垒,建立有限元模型提供理论指导,构建操作简单、性能稳定、成本低廉和通量极高的纳米孔荧光检测芯片,推动临床检测和产业化应用。本论文主要包括以下四部分:1.渗透压驱动的生物纳米孔运动精准调控生物纳米孔是一种天然的膜通道蛋白,其在磷脂双分子层上是随机运动的,不利于荧光信号的采集和数据分析。我们通过荧光标记穿过生物纳米孔的钙离子流束,观测单个生物纳米孔在磷脂双分子层上的横向运动。我们发现通过简单的调节磷脂双分子层两侧的渗透压可以有效的控制纳米孔的运动并且最终实现纳米孔的固定。该方法对于常用的金黄色葡萄球菌毒素蛋白α-溶血素（α-hemolysin,α-HL）和耻垢分枝杆菌孔蛋白A（Mycobacterium smegmatis porin A,MspA）纳米孔都适用,具有广泛的通用性。荧光恢复光漂白（fluorescence recovery photobleaching,FRAP）实验进一步证明,调节渗透压可以间接改变磷脂双分子层和琼脂糖水凝胶基底之间的相互作用,从而有效调控磷脂双分子层的运动,最终影响纳米孔的运动。荧光单通道记录（optical single channel recording,oSCR）表明,与运动的纳米孔相比,固定后的纳米孔具有高信噪比（signal to noise ratio,SNR）的荧光读出,同时依然兼具单分子传感能力。进一步的有限元模拟（finite element modelling,FEM）为相关实验结果提供理论支持。这种简单高效无标记的纳米孔固定策略保证了长时间稳定的荧光信号读出,将促进高通量纳米孔阵列化的实现。2.无电极纳米孔单分子分析芯片启发于自然界的跨膜运输过程,我们首次开发无需任何外部电子元件的无电极纳米孔荧光检测技术,并将其命名为Diffusioptophysiology（DOP）。通过有限元模拟和环糊精的单分子传感从理论和实验上论证无电极纳米孔技术的可行性。通过引入渗透压、增加钙离子浓度和使用大孔径生物纳米孔,进一步优化无电极纳米孔传感性能,提高分子自发过孔效率,增加荧光信号信背比（signal to background ratio,SBR）,实现高效的小分子、高聚物和生物大分子传感。最后构建了一个指尖型多组分微液滴阵列检测芯片,实现了低成本和高通量的纳米孔检测,为使用可抛式纳米孔传感器进行临床诊断提供了一个新技术。3.钙离子流束调控的纳米孔单分子核酸传感在纳米孔荧光检测技术的研究过程中,我们发现核酸通过α-HL纳米孔的时间显著延长,这有效补偿了荧光检测体系时间分辨率的不足,但该现象的机理尚无深入研究。通过系统的KCl/CaCl2缓冲组合下的实验,我们发现水凝胶中作为荧光信号源的钙离子流束是造成RNA过孔减速的关键因素。我们进一步证明这个规律对于不同序列的核酸和不同的孔道都适用,这表明该规律是与核酸序列和孔道无关,因此我们认为钙离子流束造成核酸减速的原因是过孔钙离子流束与核酸骨架上的磷酸根结合,屏蔽了核酸的负电荷使得核酸受到的电泳驱动力下降,从而造成了核酸的减速过孔。在钙离子流束的存在下,我们实现了三种RNA均聚物,poly（rA）23、poly（rC）23和poly（rU）23的直接区分,并且发现钙离子流束的存在可以稳定核酸分子的结构,提供更丰富的过孔细节,有助于复杂核酸分子的结构检测。4.机器学习辅助的纳米孔RNA三级结构分析RNA的灵活性使其结构生物学解析极

关键词： 基因工程   细胞工程   中医药   中草药  

摘要： 近年来,生物技术的发展十分迅猛.利用生物技术,可以对分子或细胞进行有目的的改造,改变其生长和繁殖特性,从而提高生物制品的产量和质量,满足人类日益增长的需求技术.生物技术包括细胞工程、发酵工程、酶和蛋白质工程、基因工程等.生物技术在许多领域都有着十分广泛的应用.在中草药的生产和研究领域,运用生物技术可以更高效地保存和繁殖野生资源,快速生产大量安全性较高的药材,减小中药材中部分成分对机体的刺激.本文介绍了几种主要的生物技术,并分析了其在中医药领域的应用前景,以期为研究人员提供参考.

关键词： 胚胎发育   端粒延长   端粒酶非依赖机制   Dcaf11基因  

摘要： 端粒可通过端粒酶和端粒酶非依赖机制（Alternative lengthening of telomeres，ALT）进行修复和延长。小鼠的早期胚胎发育过程中ALT机制是小鼠囊胚阶段前进行端粒延长的主要方式。胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ESC）的ALT机制与早期胚胎ALT机制有很多相似的特性。过往的研究利用ESC细胞作为研究模型，鉴定了参与ALT过程的基因，这些基因在早期胚胎ALT过程中也有特异的表达，其中Zscan4(zinc finger and SCAN domain containing4)是参与ALT过程的重要基因，当Zscan4基因被敲除时，ESC端粒快速缩短并发生凋亡。ESC中过表达Zscan4可以延长端粒。几乎所有的ESC都处于Zscan4基因的关闭和开启的动态平衡中，但是在同一时间仅有部分的ESC激活了Zscan4的表达，然而，激活Zscan4的分子机制还尚不明确。　　为进一步探索Zscan4的激活机制，我们在ESC中进行了筛选。我们发现在ESC中，Dcaf11是激活Zscan4所必需的重要基因。Dcaf11敲除引起Zscan4阳性ESC比例显著降低，端粒明显缩短，但是不影响端粒酶活性。这些结果表明Dcaf11是通过ALT机制来影响端粒长度的。　　为进一步探究Dcaf11调控Zscan4的机制，我们利用质谱技术分析ESC中Dcaf11相互作用蛋白，筛选出Kap1作为可能的Dcaf11作用的底物。通过Co-IP方法验证了Kap1、Dcaf11在ESC中特异的相互作用。此外，我们的结果发现Dcaf11可促进Kap1泛素化。CHX（蛋白合成抑制剂）处理后，Dcaf11过表达可显著缩短Kap1的半衰期。我们的进一步研究表明过表达Dcaf11引起ESC细胞内Kap1蛋白水平的显著下降，H3K9me3修饰水平下降。这些结果表明Dcaf11通过泛素化修饰Kap1引起其降解。　　我们的研究表明Dcaf11是ESC中激活Zscan4的重要基因，为进一步研究早期胚胎端粒ALT机制提供了重要的线索。

关键词： 富马酸   辅因子   富马酸酯   酰基连接酶   酰基转移酶  

摘要： 柠檬酸合成酶、顺乌头酸酶对柠檬酸循环强度影响较大,因此克隆两酶的基因,导入产富马酸菌StrainABCDIA,使富马酸产量在前人基础上进一步提高;然后,为了探究胞内NAD+/NADH 比值对富马酸积累的影响,在产富马酸菌StrainABCDIA内分别导入异源NADH氧化酶基因及自源转氢酶基因,富马酸单位质量产量为0.54 g/g菌体和0.67 g/g菌体,虽然生物量不及StrainABCDIA,但菌体自身的产酸能力得到增强,说明辅因子的调节有利于富马酸的积累。后对之前的研究进行整合优化,得到EcS、EcN、CgS、CgN四株菌。以改良的M9培养基进行重组菌的摇瓶发酵,在生物量和富马酸产量上,四株菌都比对照菌StrainABCDIA高,但是整体相差不大。其中CgS富马酸产量较高,达到0.511 g/L。但由于生长情况较差,这个产量没有达到预期。但对比菌体单位质量产量,CgS富马酸产量可以达到0.937 g/g菌体,与对照菌株StrainABCDIA单位产量相比提高20%,与其他菌株相比优势较为明显。从细胞内的辅因子NAD+/NADH来看,CgS比StrainABCDIA提高了40.24%,说明虽然多基因的表达加重了菌体生长负担,但对柠檬酸循环和辅因子的调节确实增强了菌体的产富马酸能力。对生物法产富马酸酯进行探索,异源表达对富马酸特异性的酰基连接酶和酰基转移酶。用ELLMAN法对测定BafX蛋白酶活,根据体系中辅酶A的减少量进行计算,测得酶活力较低,但整体呈现为具有活力的趋势,接着用同样的方法对BafX的最适反应条件进行探究,得到的结果是在反应温度为25℃,pH为8.0,ATP浓度为0.2 mmol/L时,酶促反应速率最优。

关键词： 基因工程  

ISBN: (纸本)9787305231285

摘要： 本书是作者在多年教学经验的基础上精心编写的，主要内容包括：基因工程的基本原理与基本技术、基因工程用于功能基因组学研究的技术、基因工程在工农业生产和医学研究中的应用。内容新颖，逻辑主线清晰，紧跟学科前沿热点。每章的后面都附有习题，供读者练习，书后附有缩略语表和索引。本书适合高等院校生物科学、生物技术专业和农林、医院校相关专业学生的本科生、研究生及科研人员学习教材和参考书，也可作为对转基因技术和基因工程感兴趣的其他领域人士科普学习用书。

关键词： ICE1   低温胁迫   竹子育种   基因工程  

摘要： 竹子在我国南方广泛分布,是一种多年生禾本科竹亚科植物。作为我国南方重要的林业资源,竹子在国民经济中扮演非常重要的角色,我国竹子相关产业经济价值超过2000亿元,对经济社会的发展有重要贡献。温度对于竹子的地理分布和生长发育等有至关重要的影响,竹子主要分布于我国年平均温度10℃以上的南方,而很难在北方生长主要是由于温度条件的限制。温度成为南竹北移工程的关键性限制因素,通过进行竹子抗寒的相关研究提高竹子的抗冷性,扩大竹子的地理分布范围有着重要意义。Inducer of CBF Expression 1(ICE1)介导的信号途径是模式植物中最重要的低温响应信号通路,ICE1作为该通路的核心转录因子,通过促进下游的CBF基因在转录水平上的表达提高植物的抗冷性。但竹子中冷胁迫相关的通路仍不清晰,关键基因功能也从未通过遗传转化体系得以验证。本研究通过转录组数据分析,分离到了竹子中受冷胁迫诱导的ICE1基因,进而对其功能进行研究,取得了以下结果:(1)通过对野生型毛竹进行冷胁迫处理,并进行了一系列生理生化指标的测定,明确了离子渗透率,丙二醛含量等生理指标可作为反映竹子中冷胁迫严重程度的标志物。(2)对冷处理前后的野生型毛竹进行转录组数据分析,筛选到多个参与竹子冷胁迫响应的基因,其中包括模式植物抗冷信号通路中的关键转录因子ICE1。(3)通过基因克隆得到Pe ICE1基因,并对其进行生物信息学分析,确定Pe ICE1和大麦、水稻等作物中的ICE1具有高度同源性,都具有相同的保守结构域—HLH结构域,暗示Pe ICE1可能具有与这些作物中的ICE1基因类似的功能。(4)分别对野生型的毛竹进行了冷胁迫处理、ABA胁迫处理、干旱胁迫处理以及盐胁迫处理,通过实时荧光定量PCR得到Pe ICE1在各种胁迫条件下的表达图谱。Pe ICE1的表达图谱表明Pe ICE1会快速正向响应冷胁迫、ABA胁迫和干旱胁迫,但是Pe ICE1会持续负向响应盐胁迫。并且与根和叶相比,茎秆中的Pe ICE1的表达量更高,证明Pe ICE1主要在茎秆中表达。(5)以毛竹的原生质体为材料,将Pe ICE1转入毛竹的原生质体中,通过显微镜观察确定Pe ICE1的亚细胞定位在细胞核内。通过双荧光素酶报告基因系统确定Pe ICE1具有转录抑制活性。(6)通过花粉管转化法,在拟南芥中过量表达Pe ICE1,并对转基因拟南芥进行了鉴定。发现转基因拟南芥和野生型相比存在晚花的现象。对过表达拟南芥进行冷胁迫处理,发现在拟南芥中过量表达Pe ICE1基因可以提高拟南芥的抗冷性。(7)以本小组前期建立农杆菌介导的麻竹遗传转化体系为基础,将Pe ICE1基因在麻竹中过量表达,成功得到了转基因竹子。(8)对转基因竹子和野生型竹子进行低温胁迫处理,发现相较于野生型麻竹,转基因麻竹表现出更强抗冷性,我们测量了冷处理前后的离子渗透率、丙二醛含量以及叶绿素含量,发现转基因竹子在冷胁迫处理后的生理生化指标都明显优于野生型竹子,并测量了冷处理前后ICE1下游基因CBF3的表达量,发现在冷处理后野生型竹子与转基因竹子中的CBF3基因的表达量都有所提高,但转基因竹子中的CBF3表达量的提高程度明显高于野生型。说明Pe ICE1过量表达能够提高竹子的抗冷性。综上所述,本研究分离并鉴定毛竹冷胁迫相关基因Pe ICE1的相关功能,提供了通过基因工程的方法来提高竹子的抗冷性的可能,也为竹子的育种提供了理论的基础。

关键词： 研究型实验   高中生物   生物教学   互联网+实验教学   基因工程实验  

摘要： 在高中生物教学中开展研究型实验是培养学生实践能力和创新能力的重要途径。教师可结合学校的实验条件,开发综合型、连贯性强的研究型实验项目,采用互联网+实验教学的授课模式解决课时不足的问题,让学生最大限度地经历完整的实验过程,从而提高实验教学质量,促进学生核心素养的形成。

关键词： 胚胎干细胞   剪接因子   细胞全能性   逆转录转座子   分子机制   动物模型  

摘要： 细胞全能性是指单个细胞具有产生个体所有类型细胞的能力，包括胚胎和胚外组织。到目前为止，我们对全能性的分子机制还知之甚少。体外培养的小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)会有一小部分激活逆转录转座子MERVL(murine endogenous retrovirus with leucine tRNA primer)及部分胚胎2细胞时期(2-cell state，2C state)特异表达基因的转录，这些细胞被称为“2细胞样干细胞(2-cell-like cells，2CLCs)”。由于与2细胞期的小鼠胚胎共享部分转录程序，且比胚胎易于培养和操作，所以近年来被用作模型解析合子基因组激活的分子机制。通过构建2C报告细胞系，进行基于CRISPR-Cas9基因编辑技术的高通量筛选，我们发现剪接因子的敲除能够促进2CLCs比例的提高。经过验证，我们发现剪接因子Rnps1、Snrpd1、U2af1、U2af2、Sf3b1的缺失及剪接抑制剂PladienolineB处理显著促进2C特异基因的激活。机制研究表明，剪接因子的敲低及剪接抑制剂的处理不会导致逆转录转座子LINE1(long interspersed nuclear element 1)转录本的减少。机制研究表明，剪接因子的敲低及剪接抑制剂通过激活ATR激酶，导致双同源盒蛋白Dux(double homeobox)的激活，从而促进合子转录程序的激活。通过分析已发表的转录组测序(RNA-seq)数据，我们发现人和小鼠剪接因子在合子基因组激活的早期相对的低表达，提示RNA剪接抑制可能也是合子基因组激活的关键机制。因此，我们的工作有利于更好地理解早期胚胎发育过程中合子基因组激活的调控。