关键词：
脱细胞
细胞外基质
胚胎干细胞
诱导分化
肝细胞
摘要：
肝脏是体内最大的“化工厂”,承载着合成、代谢、解毒、分泌四大重要功能。肝脏疾病是困扰人类健康的一类顽疾,其发生发展情况复杂,疾病谱广泛。各类肝病进展至终末阶段均会导致肝功能失代偿、肝纤维化,甚至诱发肝脏的恶性肿瘤。迄今为止,肝移植仍是公认的唯一有效的终末期肝病的治疗手段。但供体肝脏来源的严重短缺、肝移植手术创伤导致的影响、移植后的免疫排异反应等诸多问题限制了肝移植术的开展。随着技术的革新,肝细胞移植以及生物人工肝代替治疗得到了一定的发展,可以作为肝移植的辅助方式,部分解决上述问题。但是,人源的肝细胞的来源同样十分紧张,分离困难,且分离所得的原代肝细胞只有部分增殖活力,难以实现规模化的生产应用。同时,肝细胞的功能在体外难以维持,随时间进展会发生体外去分化,并伴随着肝细胞相关功能的大幅下降。因此,寻得合适的肝细胞来源十分关键。理想的候选细胞应易于体外大量扩增,所分化的细胞应具备完善的肝功能,且免疫原性较弱,便于长期保存及运输,移植后能参与肝脏组织重建。近年来,干细胞技术的飞速发展为功能性肝细胞的来源提供了新的思路。一方面,干细胞具有无限的自我增殖能力,能够满足细胞数量上的需求;另一方面,干细胞具有分化为肝细胞和胆管细胞的潜能,进一步满足细胞种类的需求。因此,国内外多个团队探索和优化了人胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)向肝样细胞诱导分化的方案,并通过在培养皿上包被基底膜提取物(Matrigel)、层粘连蛋白(Laminin)、纤维连接蛋白(Fibronectin)等细胞外基质成分为干细胞分化提供良好的微环境,以提高诱导分化效率,获得功能更完善的肝样细胞。但尽管如此,肝样细胞仍只能具备部分肝功能,仅达到人类胎肝的阶段,若要应用于临床的移植,需要进一步成熟。细胞的发育成熟以及功能发挥十分依赖于细胞外微环境的支持,而细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM),是最为重要的细胞外微环境。这些由细胞分泌至胞外组织间隙的大分子物质以不同的空间分布特点和动态变化规律,构成了适合于不同组织、细胞类型的微环境。ECM是具备物理、化学、生物属性的微环境,除了能为细胞提供机械性的支撑连接作用外,还可与细胞表面的受体发生相互作用,并向胞内传递信号,调节细胞的生长、发育、成熟、代谢等生理活动,影响细胞的命运。然而,ECM是复杂的分子网络系统,而非一种或几种相互独立的可溶性成分,其功能的发挥依赖于多种分子网络的联合作用,通过人工合成的方式难以复制。天然生物组织去细胞化后获得的脱细胞支架富含大量本土原生细胞分泌的活性分子,丰度与原生组织相当,是组织特异性ECM最为可靠的来源。至此,本课题旨在运用“四步灌注法”获得高质量的大鼠肝脏脱细胞支架(Liver Biomaterial Scaffold,LBS),将其粉末化处理后运用于人胚胎干细胞肝向诱导分化过程中,促进肝样细胞成熟并提高其功能。本课题分为以下三方面内容:一:大鼠肝脏脱细胞支架的制备及质量评估通过“四步灌注法”,即依次使用脱细胞液、浓氯化钠溶液、核酸酶溶液、生理盐水对大鼠肝脏进行原位灌注去细胞化,所获得的大鼠LBS,包膜结构完整,血管脉络清晰。通过组织染色、DNA定量、胶原(Collagen)定量、氨基葡聚糖(Glycosaminoglycans,Gags)定量可从组织学水平及分子水平证实了“四步灌注法”可以获得高质量的LBS,其中细胞成分被除净,胶原、Gags、Fibronectin等基质成分得以大量保留。二:基于肝脏脱细胞支架粉末的胚胎干细胞肝向诱导将“四步灌注法”获得的高质量的LBS冷冻粉末化处理后,作为培养基底成分添加于人ESC肝向诱导分化过程中,以商品化基质胶Matrigel为对照,进行肝向诱导分化。通过免疫荧光染色、实时荧光定量PCR检测细胞肝向分化各阶段谱系标记物的表达,肝细胞成熟标志证明,LBS能加快ESC肝向分化的进程,并且肝样细胞的表型更接近于成熟肝细胞。三:肝样细胞的成熟程度及功能的评估收集诱导获得的肝样细胞,提取RNA进行实时荧光定量PCR检测功能相关基因的表达(包括尿素合成、白蛋白合成、药物代谢酶、转运蛋白、核受体),并从分子水平检测尿素、白蛋白的合成能力及代谢酶活力。结果显示,在LBS的作用下,前述功能均呈现不同程度的上调。至此,我们成功地利用大鼠LBS促进人ESC肝向诱导分化,并检测了肝样细胞的相关功能。实时荧光定量PCR、免疫荧光染色以及细胞色素酶活力检测结果从转录水平、分子水平分别证明:经LBS作用后,ESC诱导至肝样细胞阶段的速度更快,比例更多,肝样细胞更接近成熟肝细胞的表型,并且具有更强的合成、代谢等功能。
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