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关键词： 小鼠胚胎干细胞   基因编辑   神经分化   多梳抑制复合物1   RYBP  

摘要： PcG蛋白复合物在胚胎干细胞(ESCs)多能性维持及分化过程具有重要的调控作用,主要发挥基因抑制的作用。PcG蛋白复合物主要分为PRC1和PRC2两个蛋白复合物,它们分别催化组蛋白H2A赖氨酸119位点的单泛素化(H2AK119ub1)和组蛋白H3赖氨酸27位点的三甲基化(H3K27me3)。RING1和YY1结合蛋白(RYBP)是非经典PRC1复合物的一个亚基,能与PRC1的核心催化亚基RING1B相互作用,并具有增强RING1B催化酶活性。我们发现RYBP的表达水平在ESCs向神经细胞分化过程中逐步降低,但RYBP在干细胞神经分化过程中的作用尚不清楚。为了研究RYBP在ESCs向神经分化过程中的生物学功能,本论文通过CRISPR/Cas9介导的同源重组,将Rybp的4号和5号外显子中的115个氨基酸编码序列替换为PGKpuro序列,实现对m ESCs中Rybp基因的敲除。通过基因组PCR并测序表明编辑序列无误,并通过Western blot和RT-q PCR分别从蛋白水平和RNA水平对Rybp的敲除效果进行了验证。通过免疫荧光和流式细胞分析检测m ESCs的多能性标记基因OCT3/4,NANOG和SSEA1的表达,发现敲除Rybp后不影响m ESCs的多能性。流式细胞分析发现敲除Rybp对m ESCs的细胞周期以及细胞凋亡也没有显著影响。诱导m ESCs进行拟胚体(EB)分化,通过RT-q PCR检测分化第9天三胚层标记基因的表达,揭示敲除Rybp导致ESCs向中内胚层分化受到一定的影响,使ESCs向外胚层分化受到抑制。N2B27定向诱导ESCs向神经前体细胞分化结果表明,免疫荧光染色和RT-q PCR检测分化第6天神经干细胞标记基因表达,发现敲除Rybp抑制了m ESCs向神经干细胞的分化。RNA-seq测序发现敲除Rybp抑制了ESCs向神经干细胞分化相关基因的表达。进一步转录组分析和RT-q PCR检测,发现敲除Rybp后Wnt信号通路相关基因在神经分化过程中异常激活,揭示敲除Rybp通过调控Wnt信号通路进而影响胚胎干细胞向神经干细胞分化。

关键词： 小桐子   茉莉酸合成酶基因   花发育   产量形成   分子调控机制  

摘要： 茉莉酸(jasmonic acid)是一种在植物生长发育和胁迫响应中发挥重要功能的植物激素，主要调控雄花育性、性别决定、种子成熟、根伸长、侧根形成、叶片衰老以及对生物和非生物胁迫的应答反应。DEFECTIVE IN ANTHER DEHISCENCE1(DAD1)催化茉莉酸合成途径的最初步骤，可利用半乳糖脂(galactolipid，C18∶3)生成亚麻酸(linolenic acid,C18∶3)。小桐子(Jatropha curcas)是大戟科麻风树属多年生木本植物;其种子油含量较高(30％-40％)，油脂的流动性较好，化学特性与柴油相似，可加工成优质的生物柴油和航空燃油，是一种潜在的生物质能源植物。然而，小桐子雌花较少，种子产量较低，严重制约其产业化应用。因此，应用基因工程技术解析小桐子花发育的分子调控机制对提高其产量至关重要。　　本研究中，通过RNA干扰技术在小桐子中抑制与拟南芥DAD1同源的茉莉酸合成酶基因JcDAD1的表达，解析茉莉酸合成途径在小桐子花发育和产量形成过程中的作用。发现JcDAD1基因主要在茎、根和雄花中表达。JcDAD1-RNAi转基因小桐子的内源茉莉素含量降低，雌雄花增大，花序分枝级数、单个花序上雌花数和雄花数均明显增加，单个花序花芽开放时间延长，部分雌花败育，但花药和花粉发育正常;此外，单个果序上果实数量增加，但种子变小，重量减轻，含油率降低。为探究茉莉酸含量增加对小桐子花发育的影响，应用第二代高通量测序方法，对1.0mM茉莉酸处理24小时后的小桐子早期花序芽进行转录组测序分析，观测茉莉酸对花发育及相关基因转录的影响。结果显示，外源茉莉酸处理导致早期花序芽中1259个基因上调表达，695个基因下调表达;其中，10个与成花转变相关，8个与花器官发育相关以及18个与茉莉酸合成和信号转导途径相关的拟南芥同源基因表达发生了显著变化，但是花器官表型并未有显著的改变。差异表达基因的GO注释显示，“响应茉莉酸”功能分类基因在上调表达基因群中富集，表明在小桐子中存在可以响应外源茉莉酸处理的信号途径。茉莉酸处理后，与拟南芥花器官发育相关的同源基因JcFUL、JcSRS、JcSEP1、JcAGL61、JcWOX1、JcTPR4和JcSEU表达下调，然而小桐子花器官表型没有明显改变，说明在小桐子中这些基因的下调表达不足以改变小桐子花器官的发育。结果表明，JcDAD1基因通过调控茉莉酸合成途径影响小桐子花和果实的发育，但对花药和花粉的发育无明显影响;茉莉酸处理可诱导小桐子花序芽中茉莉酸合成和信号转导基因以及成花转变和花器官发育基因的表达。研究结果初步探讨了茉莉酸调控小桐子花器官发育和产量形成的分子机制，发现了小桐子中茉莉酸含量的变化对花器官发育有重要影响。这些结果对小桐子分子设计育种和高产优质品种的培育具有一定的参考价值。

关键词： 大肠杆菌   还原性甘氨酸途径   代谢工程   进化工程   甲酸钠   13C标记  

摘要： 近年来,一碳化合物作为化工行业和生物领域中的理想原料,受到越来越多的关注。通过使用过剩的能量合成一碳化合物,然后将其作为碳源维持微生物的生长及化学品的合成,这将是生物制造领域的新趋势。甲酸盐作为下一个新的一碳底物具有巨大的应用潜力,它可以通过电化学或光化学催化CO2生成,并且理论上可以作为微生物生产增值化学品的唯一碳源,因此在微生物中构建高效的甲酸盐同化途径对于廉价、可再生的一碳化合物的利用至关重要。本文的研究内容主要主要分为四个内容:第一部分是在大肠杆菌中构建还原性甘氨酸途径,首先敲除ser A（L-丝氨酸羟甲基转移酶）来构建丝氨酸营养缺陷型菌株,再通过引入三个来自Clostridiuml jungdahlii（杨氏梭菌）的fhs（甲酸-THF连接酶）,fol D（5,10-亚甲基-THF脱氢酶）和fch A（5,10-次甲基-THF环化水解酶）的基因来同化甲酸钠,由甲酸钠提供重要的一碳单位-亚甲基四氢叶酸从而合成丝氨酸来弥补生长缺陷,验证还原性甘氨酸途径在体内的成功构建。第二部分是采取理性的代谢工程策略,通过敲除参与甘氨酸和丝氨酸合成相关途径的基因,使一碳单位尽可能的来源于甲酸钠的同化;在敲除ser A的基础上,相继敲除kbl和lta E以阻断苏氨酸生成甘氨酸,同时敲除ace A使得乙醛酸循环失活,以阻止异柠檬酸及其后形成的乙醛酸通过隐性的转氨酶产生甘氨酸。在此基础上,因为gcv R基因编码甘氨酸裂解系统中GCV操纵子的负调控子,为了增强反向甘氨酸裂解系统的活性,故而敲除gcv R,成功构建了一株连续敲了除5个基因且包含甲酸盐同化基因的工程菌株MG9。第三部分是基于进化工程策略,针对MG9菌株生长状况较差,对甲盐酸的利用率低的情况,通过定向进化逐步降低菌株对于甘氨酸的依赖性,直至甘氨酸添加量为零时,对比发现进化菌株的最大OD600提高了约47%。第四部分是通过在培养基中添加13C标记的甲酸钠,证明甲酸钠通过还原性甘氨酸途径同化到中心碳代谢,并通过对比发现进化菌株的丝氨酸13C标记含量较出发菌株增加了约16%,进一步证明定向进化提高了工程菌株对甲酸钠的利用率。

关键词： 纳米孔测序   原始电流   DNA序列   神经网络模型   评价标准  

摘要： DNA序列测序技术在遗传信息和基础生物研究上有着重要作用。自20世纪70年代第一代DNA序列测序技术问世以来,经过近40年的快速发展,DNA测序技术取得了重大的进步。基于纳米孔的DNA序列测序是当前最新一代DNA测序技术,因其测序速度快、高通量、成本低等特点得到了科学研究者的广泛关注。DNA分子在通过纳米孔时,四种碱基分子所产生的感应电流各有不同,通过对产生的电流的分析得到DNA分子的序列,这就是纳米孔DNA序列测序技术的理论基础。而影响纳米孔测序技术发展的主要因素是基于纳米孔的DNA测序算法的好坏。本文根据对纳米孔测序基本原理的分析,提取碱基的电流改变量和持续时间作为DNA分子的特征向量进行基于纳米孔的DNA测序算法的研究。论文主要内容如下:首先,根据基于纳米孔DNA序列测序的基本原理,分析DNA分子通过纳米孔时诱导电流的变化情况,将DNA分子通过纳米孔时所引起的电流改变量和电流改变的持续时间作为描述DNA分子信息的特征向量。同时,由于纳米孔测序过程中会产生各种噪声干扰,本文在对噪声来源与产生机制分析后,采用小波去噪方法对所得实验数据进行去噪处理,减少噪声对真实信息的干扰。然后,根据深度学习理论,本文建立了基于隐马尔可夫模型的隐马尔可夫DNA序列测序模型,同时针对模型中出现的一些问题,本文优化了该模型,建立了优化隐马尔可夫DNA测序模型。同时,在进一步探究中,本文建立了基于RNN神经网络模型的RNN神经网络DNA序列测序模型,并通过仿真实验确定合适的模型参数。再进一步对纳米孔测序DNA序列测序原理分析的同时结合现有测序算法,提出了新的基于RNN神经网络的负反馈RNN神经网络DNA序列预测模型,通过对该模型训练效果的分析,确定合适的模型参数。最后,本文使用三种评价标准:测序准确率、Hamming loss(汉明损失)系数和Kappa系数对隐马尔可夫DNA序列测序模型、优化隐马尔可夫DNA序列测序模型、RNN神经网络DNA序列测序模型和负反馈RNN神经网络DNA序列测序模型的DNA序列测试结果进行评价分析,结果显示负反馈RNN神经网络DNA序列测序模型预测准确度有着明显的提高,其模型对DNA分子的分类能力强于其余三种模型。

关键词： 传承中华优秀传统文化   改革创新   融合发展   全媒体战略平台  

摘要： 中国西部青少年中华文化基因工程项目以纸媒和新媒体等多种传播渠道,通过新技术手段,对出版内容进行数字化处理、多元应用,实现西部地区少先队组织全覆盖。本项目的初心是尊重和传承中华优秀传统文化,创新社会管理服务体系,搭建协同平台,提高服务水平,竭诚为西部青少年快乐阅读、健康成长服务;通过项目实施,进一步加强西部地区青少年爱国主义教育工作,团结带领各族青少年为促进中国西部地区特别是民族地区的稳定、和谐、发展和繁荣作出贡献。

关键词： DNA测序条形码   插入/删节   动态规划法   隐马尔科夫模型   前向-后向算法  

摘要： 随着高通量测序技术测序能力的不断增加,例如,Illumina测序仪Hi Seq X,能够在每轮测序中产生1.8 Tb的数据量,多路复用测序技术成为有效利用其测序能力的关键策略。在多路复用测序中,将多个DNA样本混合进行单次并行测序,使用不同的样本标签—DNA测序条形码(Barcode)区分混合物中的样本。然而,由于DNA合成、扩增和测序过程中引入的插入、删节和替代错误,导致测序条形码错误译码,从而引起样本误配,严重影响测序效率。本文针对测序过程中的插入、删节和替代错误,提出了一种新的测序条形码构造方法,进一步提出高鲁棒性的测序条形码识别方法,具体工作包括:首先,针对多路复用测序中的高插入、删节和替代错误以及测序条形码译码复杂度高的问题,提出一种基于循环分组码和伪随机序列的测序条形码构造方法。进一步,提出一种低复杂度的测序条形码识别方案。该方案首先利用循环移位和动态规划结合的方法标记插入/删节位置;然后根据标记位置修正损坏码字;最后执行纠错纠删译码纠正剩余错误。仿真结果表明,提出的方法可以灵活构造不同长度、不同纠错能力的测序条形码,尤其对于包含各类错误较多的长条形码具有高鲁棒性。然后,为进一步提高测序条形码抵抗插入、删节和替代错误的能力,提出一种基于一般分组纠错码和伪随机序列的测序条形码构造方法,进一步,提出了一种具有更高鲁棒性的基于软信息的测序条形码识别方法。该方法首先利用已知伪随机序列,建立用于碱基插入/删节估计的隐马尔科夫模型。然后,通过对经典的前向-后向算法进行修正,输出分组码逐比特软信息。最后,执行分组码软判决译码。仿真结果表明提出方案对测序条形码上发生的高插入、删节和替代错误具有很高鲁棒性。此外,在测序条形码嵌入DNA文本时的两种错误场景下,均具有优越的纠错性能,这表明其在实际测序中应用的可靠性。

关键词： 无翅型MMTV整合位点家族成员5A (Wnt5a)   shRNA   慢病毒载体   鸡胚胎干细胞  

摘要： 本课题组前期通过高通量测序发现无翅型MMTV整合位点家族成员5A (winglesstype MMTV integration site family member 5A, Wnt5a)介导的Wnt/β-catenin信号在鸡(Gallus gallus)雄性生殖细胞形成过程中被显著富集,为研究Wnt5a基因介导的Wnt/β-catenin信号通路在鸡胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)向雄性生殖细胞分化过程中的功能,本研究通过慢病毒(Lentivirus)介导的RNA干扰技术,建立稳定干扰Wnt5a基因的鸡胚胎干细胞系。针对Wnt5a基因设计3个干扰靶点序列和1个阴性对照序列,与p GMLV-SC5慢病毒载体重组;将慢病毒重组载体分别转染鸡DF-1细胞,通过q RT-PCR检测Wnt5a基因的表达,以确定各干扰载体的干扰效率,并对干扰效果最好的重组载体进行慢病毒包裹。利用包裹干扰载体的慢病毒感染鸡ESCs,采用q RT-PCR及Western blot检测不同组别Wnt5a及Wnt信号通路下游关键基因轴抑制蛋白2(axis inhibition protein 2, Axin2)、β-链蛋白(beta catenin,β-catenin),磷酯酶C(phospholipase C, PLC)及泛素特异性肽酶54基因(ubiquitin specific peptidase 54, USP54)的表达量变化。同时构建Wnt5a过表达载体(p CDNA3.0-Wnt5a)进行Wnt5a基因的拯救实验。成功构建3条靶向Wnt5a的慢病毒干扰表达载体,分别为Wnt5a-sh RNA1、Wnt5a-sh RNA2和Wnt5a-sh RNA3,Wnt5a-sh RNA2重组质粒对Wnt5a基因的抑制效果最为明显,干扰效率可达80%,将Wnt5a-sh RNA2重组质粒包裹慢病毒,病毒滴度:5×108TU/m L;将Wnt5a-sh RNA2慢病毒转染鸡ESCs后,q RT-PCR和Western blot结果表明,干扰组Wnt5a m RNA表达和蛋白表达水平较对照组显著降低(0.16±0.03 vs 1.03±0.02)(P<0.05),Wnt信号通路下游关键基因Axin2和β-catenin的表达量发生了显著下调(0.41±0.08 vs 1.03±0.05; 0.25±0.04 vs 1.03±0.05)(P<0.05);同时对干扰组转染Wnt5a过表达载体(PCDNA3.0-Wnt5a),结果发现干扰组Wnt5a的表达水平能够恢复(1.19±0.07 vs 1.03±0.02)。本研究成功构建了靶向鸡Wnt5a的sh RNA慢病毒表达载体,可有效沉默Wnt5a基因在鸡DF-1细胞和胚胎干细胞中的表达,并且稳定表达Wnt5a-sh RNA2的胚胎干细胞系可干扰Wnt信号转导,该结果将为进一步在细胞水平开展Wnt5a基因及其介导的Wnt信号通路的功能研究提供理论依据。

关键词： 高中生物   核心素养   策略  

摘要： 生物学是高中学习时期的一门重要科目,学习好生物学对学生认识生物、认识社会都有很大的帮助.生物学描述着精彩的世界,让学生学好生物学,能够培育学生生命观、理性思维、科学探究观、社会责任等核心素养,对学生全面的发展有很大的帮助.

关键词： 乳腺癌   甲基化   TCGA   循环游离DNA   液体活检  

摘要： 第一部分 基于TCGA数据库的乳腺癌DNA甲基化分析目的近年来,DNA甲基化已成为生物医学研究领域的热点之一,尤其是其与肿瘤的关系,DNA甲基化或许可以作为一种检测手段来诊断肿瘤甚至是预测肿瘤的发生。本研究利用公共数据库TCGA上乳腺癌患者及健康对照者的甲基化数据进行差异性分析,尝试解读乳腺癌患者的DNA甲基化谱与正常人的差异所在,并通过进一步的分析和筛选,甄选出有利于乳腺癌诊断、监测的甲基化基因。方法从TCGA下载乳腺癌样本和乳腺癌旁组织样本的Illumina Human Methyla-tion 450芯片甲基化数据,使用R语言筛选乳腺癌组织样本与癌旁组织样本中差异甲基化位点,并参考Illumina Human Methylation 450 hg19的芯片注释文件进行基因注释。然后使用DAVID在线工具进行GO(Gene Ontology)功能富集分析和 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析。最后结合下载数据的临床信息对部分选择的基因进行cox回归分析,筛选出与生存相关的甲基化基因。结果于TCGA下载共得到791个乳腺癌组织样本和96个癌旁样本甲基化测序数据以及相应的临床资料。通过R语言对其进行差异性分析,可以得到共28710个差异甲基化位点(Differentially Methylated Site,DMS)。之后,通过基因注释,我们得到与这28710个DMS相关的共有6623个基因。我们对位点及基因进行了结构注释和功能注释,结果我们可以看到,大部分的DMS都落在CpG岛,并且以高甲基化为主;而gene body则以低甲基化为主。同样,我们利用DAVID工具对前面得到的6623个乳腺癌甲基化相关基因进行了 KEGG通路分析,DMS所在的基因统共涉及到61个通路,我们将其中常见的肿瘤通路中的基因提取出来,并取其与包含10个DMS以上的基因的交集,得到22个基因,根据β平均值进一步过滤后,通过Cox回归分析显示,其中和生存时间相关的基因有7个,包括 CTNNA2、APC、RASSF1、SOX17、TNXB、EDNRB、CREB5。结论1.基于TCGA等生物信息数据库的数据资源,能够进行疾病的基因差异性分析、生存分析等。2.乳腺癌组织与癌旁组织的DNA甲基化谱具有明显差异;乳腺癌组织的DNA高甲基化主要发生在CpG岛,而低甲基化主要发生在gene body。3.乳腺癌组织DNA甲基化涉及各种各种生物过程,我们结合常见的肿瘤分子通路和TCGA下载的临床信息文件,筛选出CTNNA2、APC、RASSF1、SOX17、EDNRB、TNXB、CREB5 7个基因,其有潜力作为乳腺癌诊断、监测的甲基化标志物。第二部分利用高通量甲基化测序对乳腺癌患者循环游离DNA进行检测分析我们的研究通过采集、提取乳腺癌患者外周血中的循环游离DNA,并利用高精确性的全基因组甲基化测序大范围地来描绘乳腺癌患者cfDNA甲基化图谱,探索其潜在的甲基化特征。本部分研究是第一部分研究的延伸、拓展和验证,在二代测序的基础上,比较乳腺癌患者身上组织DNA与cfDNA的甲基化差异。并检验cfDNA甲基化对辅助乳腺癌早期诊断的价值,借此寻找外周血中可用于乳腺癌筛查的潜在甲基化标志物。方法选择于2017年3月至2017年7月间在南方医科大学南方医院乳腺中心住院10例早期乳腺癌女性患者入组本研究,另外纳入10例健康女性作为对照组。术前采取约10ml静脉血并分离血清,采用磁珠法提取cfDNA后,先进行全基因组甲基化建库,再使用Illumina测序平台对捕获的cfDNA进行高通量测序。结果在提取cfDNA的过程中,我们发现乳腺癌组的cfDNA浓度与健康对照组无统计学差异(乳腺癌组0.908 ng/ul,健康对照组0.883 ng/ul,p=0.399);此外,在乳腺癌组内,cfDNA浓度与患者的年龄、肿瘤大小、分期以及淋巴结转移与否无明显相关性。通过构建全基因组甲基化高通量测序文库,并有效、充分地应用高通量测序技术,能准确地获得全基因组甲基化位点信息,我们发现了乳腺癌组cfDNA与对照组cfDNA中的4052个差异甲基化位点,并且通过与第一部分的组织DNA甲基化数据的横向比较,显示乳腺癌患者cfDNA的甲基化情况与乳腺癌组织DNA存在差异性。在临床相关性分析中,我们发现DUSP5P1包含11个与肿瘤分期相关的甲基化位点,其中包括有3个高甲基化位点和8个低甲基化位点。结论1.乳腺癌女性患者与健康女性的cfDNA浓度并无统计学差异,此外,乳腺癌患者的cfDNA浓度与患者的年龄、肿瘤大小、分期以及淋巴结转移与否无明显相关性。2.乳腺癌患者cfDNA甲基化情况有异于乳腺癌组织DNA甲基化情况。3.乳腺癌患者cfDNA甲基

关键词： 人源化小鼠   胚胎干细胞   主要组织相容性复合体   免疫治疗   肿瘤微环境  

摘要： 限制胚胎干细胞应用的瓶颈在于同种异体免疫排斥,而主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC,人类 MHC 即 HLA)被认为是引起免疫排斥主要因素;而在肿瘤治疗中,肿瘤细胞通过降低MHC的表达而达到免疫逃逸,由此可见,MHC的表达可能在干细胞移植和肿瘤免疫治疗中起到关键作用,然而在基础研究中却缺乏一个有效的动物模型来研究MHC的重要性。为了解决上述问题,我们首先通过对重度免疫缺陷小鼠移植人胸腺组织和CD34+胎肝细胞来重建人的免疫系统;流式细胞术检测人源化鼠体内重建的人源免疫细胞,如T细胞,B细胞等。我们使用CRISPR/Cas9基因编辑系统对胚胎干细胞MHC Ⅰ和MHC Ⅱ分子进行敲除,并将敲除的细胞系移植到人源化鼠中,观察畸胎瘤的形成并使用免疫荧光检测畸胎瘤中T细胞的浸润情况;我们将MHC敲除的胚胎干细胞分化成平滑肌细胞以及心肌细胞,移植到体内,通过免疫荧光染色来评价移植物的存活以及T细胞的浸润。我们在人源化鼠中移植肿瘤细胞,通过q-PCR来检测肿瘤组织免疫微环境相关的基因表达,并通过流式细胞术和q-PCR来检测T细胞的表型。我们构建了 CAR-T治疗实体瘤模型,通过比较CAR-T治疗效果以及流式和q-PCR检测浸润CAR-T细胞的相关基因,来验证人源化鼠肿瘤的免疫抑制微环境。我们发现,MHC敲除,特别是MHC Ⅰ敲除后,有助于畸胎瘤的形成,而在分化的平滑肌和心肌细胞移植物,MHC Ⅰ和MHC Ⅱ同时敲除不能保障移植物的存活;在人源化鼠肿瘤中,由于存在MHC不相容的移植排斥压力,肿瘤细胞能产生强烈的免疫微环境,抑制浸润的T细胞和CAR-T细胞来产生耐受。移植免疫和肿瘤免疫存在一个共同核心问题,即是免疫耐受。移植免疫旨在建立移植物的免疫耐受,而肿瘤免疫治疗则在于打破免疫耐受微环境。由于敲除MHC亦不能完全避免免疫排斥,所以营造一个免疫抑制微环境有利于胚胎干细胞移植,而消除免疫抑制微环境则可以增强免疫疗法的疗效。我们利用人源化鼠由能够研究免疫系统与胚胎干细胞移植的免疫排斥,以及免疫系统和肿瘤的相互作用,因此人源化鼠是一个用于移植免疫和肿瘤免疫的的理想模型。