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关键词： 基因工程   《植物研究》  

摘要： 《植物研究》1959年创刊,是由东北林业大学主办,科学出版社出版的植物学专业刊物,是国内外公开发行的学术期刊。2006年变更为双月刊,后成为以植物分类、基因工程、植被生态、数量遗传学等为核心的多学科综合性学术期刊。其刊载内容为植物新种、分子生物学、基因工程、植物细胞学、植物化学、植物遗传学、植物生理学、群落生态学等基础理论研究方面

关键词： RhoA   超声辅助抽脂   3D打印   三维激光表面扫描   软骨组织工程   人耳廓外形组织工程软骨  

摘要： 研究背景组织工程技术构建人耳廓外形软骨组织的可行性和有效性已被多个小组成功证明。其中两个关键的问题是种子细胞和人耳廓外形的精准控制。残耳软骨细胞的获取不会损伤健康组织,并且会再生出与天然软骨相似的弹性软骨。但是有报告显示有超过18种不同的小耳畸形相关综合征伴有单基因缺陷或染色体畸变。由于残耳软骨细胞的基因缺陷,导致在裸鼠体内12周后,残耳软骨细胞形成的软骨组织与健康耳软骨细胞工程软骨相比,表现出较低的生化和生物力学特性。我们在前期研究中发现P1残耳软骨细胞的迁移能力弱于健康耳软骨细胞,提示残耳软骨细胞的迁移能力可能于组织工程软骨的质量有关。此外,对于具有精细三维结构的耳廓软骨组织,如何将PGA纤维预先制备成个性化的人耳廓外形是一个难题。3D打印技术为解决这个难题提供了解决方案。研究目的1、研究基因工程技术促进残耳软骨细胞迁移能力的可行性。2、研究迁移能力提高的残耳软骨细胞单独或者与脂肪干细胞共培养对构建软骨组织的影响3、3D打印技术辅助构建人耳廓外形的组织工程软骨。研究内容1、基因工程技术促进残耳软骨细胞迁移能力的可行性。方法 通过对比残耳软骨细胞和正常耳软骨细胞找出有差异的迁移相关基因,通过划痕和Transwell实验检测过表达该基因对残耳软骨细胞迁移能力的影响。结果 迁移相关基因RhoA在正常耳软骨细胞中的表达量高于残耳软骨细胞。过表达RhoA可以促进残耳软骨细胞的迁移能力。结论 RhoA对于残耳软骨细胞的迁移能力有促进作用。2.超声辅助抽脂获取的脂肪干细胞和残耳软骨细胞共培养对构建软骨组织的影响。方法 应用超声辅助抽脂技术和常规负压抽脂技术获得的人脂肪干细胞。分3组,对照组:单纯残耳软骨细胞;实验组1:残耳软骨细胞和常规负压抽脂获得的脂肪干细胞1:1混合;实验组2:残耳软骨细胞和超声辅助抽脂获得的脂肪干细胞1:1混合,体外培养4周后植入裸鼠体内,8周后取材检测。结果 组织学、湿重、GAG含量、生物力学检测表明实验组1、2形成的软骨组织优于对照组,实验组1、2之间无显著性差异。结论 超声辅助抽脂技术和常规负压抽脂技术获得的人脂肪干细胞与残耳软骨细胞共培养都可形成成熟的组织工程软骨,二者之间无显著差异。3、过表达RhoA的残耳软骨细胞与脂肪干细胞混合共培养构建组织工程软骨。方法 实验分为6组,组1:残耳软骨细胞;组2:残耳软骨细胞与脂肪干细胞1:1混合;组3:pCDH过表达残耳软骨细胞;组4:pCDH过表达残耳软骨细胞与脂肪干细胞1:1混合;组5:RhoA过表达残耳软骨细胞;组6:RhoA过表达残耳软骨细胞与脂肪干细胞1:1混合;体外4周,体内4周,体内8周取材检测。结果 组织学、湿重、GAG含量、生物力学、特异性软骨基因ACAN、COL Ⅱ检测表明,RhoA过表达残耳软骨细胞构建的工程化软骨质量优于单独残耳软骨细胞组,RhoA过表达残耳软骨细胞和脂肪干细胞混合培养组形成的软骨质量最优。结论 RhoA过表达促进了工程化软骨的质量,RhoA过表达残耳软骨细胞与脂肪干细胞混合培养组形成的软骨质量最优,这为后续构建耳廓形态的组织工程软骨提供了参考依据。4、3D打印技术辅助构建人耳廓形状组织工程软骨。方法 采用计算机辅助设计与制造(CAD/CAM)和3D打印技术,预先制作一套患者专用的人耳廓外形的钛合金模具。将无纺的PGA纤维压入模具中形成人耳廓外形的支架,接种残耳软骨细胞,体外培养4周,植入裸鼠体内培养16周取材,组织学、生物力学、三维扫描形态学检测。结果 用3D打印技术可以形成人耳廓外形的钛合金模具,应用该模具可以形成人耳廓外形的PGA/PLA支架,16周后取材可以形成个性化的人耳廓外形的软骨组织相似度高达91.42%组织学显示成熟的软骨组织陷窝,有较高的生物力学性能。结论 3D打印技术可以辅助构建人耳廓形状组织工程软骨。5、基因工程残耳软骨细胞构建人耳廓形状组织工程软骨。方法 采用计算机辅助设计与制造(CAD/CAM)和3D打印技术,制作一套患者专用的人耳廓外形的钛合金模具。将无纺的PGA纤维压入模具中形成人耳廓外形的支架,1:1接种过表达RhoA残耳软骨细胞和脂肪干细胞,体外培养4周,植入裸鼠体内培养16周取材,组织学、生物力学、三维扫描形态学检测。结果 用3D打印技术可以形成人耳廓外形的钛合金模具,应用该模具可以形成人耳廓外形的PGA/PLA支架,16周后取材可以形成个性化的人耳廓外形的软骨组织,相似度高达90%,组织学显示成熟的软骨组织陷窝,生物力学强度接近正常耳软骨组织。结论 应用过表达RhoA残耳软骨细胞混合共培养超声辅助抽脂获取的脂肪干细胞可以在3D打印技术辅助下构建人耳廓形状组织工程软骨

关键词： 椎间盘退变   人胚胎干细胞   外泌体   干细胞   激活作用  

摘要： 目的：　　近年来研究显示逆转退变髓核干细胞再生能力是治疗椎间盘退变性疾病的关键。干细胞分泌的外泌体是植入干细胞发挥修复作用的主导物质。胚胎干细胞来源外泌体含有与其无限增殖能力相关的独特microRNAs，蛋白质和脂质等。因此本文从细胞增殖能力，多向分化潜能及其机制等评估人胚胎干细胞来源外泌体(human embryonic stem cell derived exosomes, hESC-exos)对退变髓核干细胞再生能力的影响。　　方法：　　本实验采用酶消化法和组织块贴壁法从人退变髓核组织提取退变髓核干细胞(degenerative nucleus pulposus stem cells, D-NPSCs)，培养到第三代用于实验。使用超高速离心法从人胚胎干细胞培养上清中提取外泌体;使用透射电镜，纳米粒子分析系统和免疫印迹的方法来鉴定所提取的外泌体。将得到的hESC-Exos作用于退变髓核干细胞，采用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷标记分析(EdU)，细胞活力测定，细胞生长曲线绘制和流式细胞术检测hESC-exos对D-NPSCs增殖能力的作用，并进一步用qRT-PCR法检测干细胞多能性基因，组织干细胞相关基因和髓核干细胞相关基因的表达。此外，本研究探索了hESC-exos对D-NPSCs多向分化潜能和克隆形成能力的影响，并采用免疫荧光和免疫印迹的方法检测相关标志蛋白的表达。　　结果：　　首先，我们从人胚胎干细胞条件培养基中成功提取了hESC-exos。细胞活力检测结果显示，hESC-exos作用的D-NPSCs细胞活力明显高于D-NPSCs组。EdU标记分析也表明hESC-exos组增殖能力显著增强;流式细胞分析显示，hESC-exos组较D-NPSCs组的细胞凋亡率更低，更多的细胞进入细胞分裂期。以上结果可以说明，hESC-exos可以显著提高D-NPSCs的增殖能力并减少细胞凋亡。同时我们的结果还显示，hESC-exos组增殖能力上调的同时伴随着成脂，成软骨分化潜能的提高。我们进一步发现hESC-exos作用后，D-NPSCs的多能性基因SOX2，髓核干/祖细胞标志性基因TIE2和组织干细胞相关基因AXIN2,LGR5表达水平显著性上调。免疫印迹的结果进一步证实了β-CATENIN,SOX2,AXIN2在蛋白表达水平上调。由此我们推测，hESC-exos可能通过激活Wnt信号通路，促进D-NPSCs去分化而上调其多能性，从而增强其再生能力。　　结论：　　hESC-exos可能通过Wnt信号通路促进髓核干细胞发生去分化，从而提高退变髓核干细胞的细胞增殖能力和多能性，进而激活D-NPSCs再生能力。本研究为开发椎间盘退变生物治疗的新模式提供了重要的实验依据。

关键词： 胚胎干细胞   多能性   CRISPR/CasS9   Epc1   Fbxw7  

摘要： 多能干细胞多能性的退出及功能细胞/组织的获得作为现阶段干细胞与再生医学领域的两个核心问题,是决定干细胞与再生医学研究能否向临床转化的第一道关卡。目前,干细胞多能性的维持方面的研究已经相当成熟,然而对其如何从不断地自我更新和增殖的多能性稳态中退出,乃至分化成特定谱系的特异性细胞或者组织的相关的机理却知之甚少,尽管目前已知的内源性因子Tcf711、Tfe3以及NuRD复合物等在多能性退出中发挥了重要作用,但是其他促进多能干细胞退出多能性基态的基因还有待确定,为此,我们将CRISPR/Cas9全基因组基因敲除这种全新的技术应用于此,首次在基因组层面以一种无偏的方式筛选促进多能性退出的关键基因。本项研究成功建立了基于CRISPR/Cas9全基因组基因敲除筛选多能性退出关键基因模型,利用慢病毒转染/感染技术、lenti-Cas9基因敲除技术、shRNA基因敲降技术,通过PCR重测序、MAGeCK分析(Model-based Analysis of Genome-wide CRISPR-Cas9 Knockout)、GO 分析等数据获取及处理方法,初步发现了 Epc1以及Fbxw7具有促进小鼠胚胎干细胞(Mouse Embryonic Stem Cells,mESCs)退出多能性基态的作用。本项目首次将CRISPR/Cas9全基因组基因敲除技术应用于多能干细胞多能性退出的研究,成功建立了全基因组基因敲除筛选多能性退出关键基因模型。我们采用经典的分化模型,即在确定成分的小鼠胚胎干细胞常规培养基N2B27+2i/LIF中,去除LIF和两个小分子抑制PD/Chir,使胚胎干细胞无法维持自我更新、退出多能性,从而达到分化的目的,在筛选出包括TCF711和P53在内的阳性基因的同时,也初步发现了能促进多能性退出的新基因Epc1(Enhancer Of Polycomb Homolog 1)以及Fbxw7(经文献调研发现该基因在多能性退出中已有一定的研究),为进一步研究其作用机制、丰富细胞命运调控相关知识提供了切入点。论文将分为筛选模型的建立、筛选数据的分析以及筛选实验验证这三个部分,依次阐述本项研究的主要内容及成果。

关键词： 分子生物学   遗传系统   信息   遗传密码   DNA测序   因果特异性关系   意向性   任意性  

摘要： 显微镜发明以前遗传是哲学家的研究领域。遗传学科在探索研究生物性状遗传变异的自然现象过程中逐渐形成,试图揭示生命世界遗传变异规律,理论化阐述客观现象。人们对遗传变异现象的本质提出过如泛生论、种质论、芽球、遗传因子等种种假说和猜测。1909年“基因”概念正式提出,科学理论和技术的发展促使“基因”概念内涵日益丰富。生物学研究进入分子水平解释模式后,信息概念成为了分子生物学中生物特异性假定理论的一部分。信息概念有助于解释复杂生物现象,生物学哲学家因此开始关注“信息”概念解释复杂性问题的效用。不同语境下,遗传信息概念有着不同的语义内涵。遗传问题常用信息术语讨论,语言和DNA的组合结构为类比推理提供了强有力基础。20世纪50年代到70年代,信息是研究基因作用的一种手段。80年代以后,信息成为了体现以产生DNA序列为结果的测序技术发展的目标,“遗传信息”嵌入DNA测序新技术给生物医学研究实践带来了巨大前景和潜力。遗传信息概念应用主要包括:1.由基因中包含的信息指定或编码对整个生物体表型性状的描述(包括复杂行为性状);2.就存储在基因中的程序执行而言,对细胞内许多因果过程甚至整个有机体发育序列的处理;3.把基因(及其他遗传结构)的传递看作亲代向子代的信息流动;4.从进化论角度看,基因本身在某种意义上应该被看作是由信息“构成”的,信息成为生物世界的基本组成部分;5.以完全概括性方式描述理想化种群动态变化是自然选择的结果。生物分子序列和表型性状研究源于不同科学传统,被归为“遗传信息”使DNA序列被当作推断表型效应的捷径,随之出现基因决定论复燃危险。测序和基因功能研究应当分离,学科、实验和技术交叉作用将为遗传信息提供新意义。

关键词： 犬细小病毒   基因工程抗体   HEK-293F细胞   犬源化  

摘要： 犬细小病毒病是由犬细小病毒（Canine parvovirus,CPV）感染引起,严重危害犬类健康的传染病,具有发病率高、传染性强、死亡率高等特点。目前犬细小病毒病没有特效药物,目前采用的单克隆抗体在CPV感染早期有良好的治疗效果,但单克隆抗体为鼠源,具有较高的免疫原性,不能连续注射。本研究通过对已有单克隆抗体进行犬源化改造,制备适合犬用的免疫原性低的抗CPV抗体药物。首先对已有抗CPV的杂交瘤细胞株4H8进行鉴定,4H8抗体亚型为IgG2b,亲和力常数6个Ka平均值为1.02×10～111 L/mol,只与CPV VLPs反应。经RACE-PCR提取4H8抗体可变区序列,用NCBI IgBLAST分析。将4H8抗体可变区序列与在ENA网站上查到的鼠源抗体恒定区序列组装,分别构建真核表达载体pcDNA3.1（+）-L和pcDNA3.1（+）-H,共转染HEK-293、HEK-293F细胞进行表达。采用间接ELISA检测鼠源CPV基因工程抗体（CA）的表达量,CA在HEK-293F细胞中的表达量为5.97 mg/L;血凝抑制、中和试验检测其生物活性,CA在HEK-293细胞上清中的血抑和中和效价分别为1:2～4、1:152,在HEK-293F细胞上清中的血抑和中和效价分别为1:2～6、1:1 290。纯化CA后进行SDS-PAGE分析在55和25 Ku处出现条带;间接免疫荧光检测,CA能与CPV发生特异性结合。确定经过改造的CA依然保持活性后,进行犬源化改造。将4H8抗体可变区序列与在NCBI网站上查到的犬源抗体恒定区序列组装,分别构建真核表达载体pcDNA3.1（+）-cL和pcDNA3.1（+）-cH,按照CA的方法进行表达和检测犬源CPV基因工程抗体（CCA）。CCA在HEK-293细胞上清中的血抑和中和效价分别为1:2～5、1:203,在HEK-293F细胞上清中的血抑和中和效价分别为1:2～9和1:2 580。CCA经Protein A亲和层析柱纯化后纯度在95%以上,血抑和中和效价分别为1:212和1:32 768。经BCA法检测CCA在HEK-293F细胞中的表达量为89.65 mg/L。SDS-PAGE分析CCA在55和25 Ku处出现条带,Western-blot检测重链能与兔抗犬IgG-HRP结合,间接免疫荧光检测CCA能中和CPV。以上结果表明,本研究在HEK-293F细胞中成功表达具有中和活性、纯度高、免疫原性低的犬源化CPV基因工程抗体。

关键词： 靶向捕获测序技术   肿瘤   液体活检   线粒体DNA   突变  

摘要： 研究背景近年来,液体活检技术在新型肿瘤标志物临床检测应用中取得了突破性进展。其主要通过各种技术方法检测肿瘤原发灶或转移灶释放到外周血或其他体液中的循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)、循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ct DNA)或者外泌体,从而达到诊断或监测肿瘤的目的。线粒体是几乎存在于所有真核细胞中的重要细胞器,参与许多生命活动的调节。线粒体DNA(mitochondria DNA,mt DNA)是一段双链闭合环状结构,包括编码区和非编码区,全长仅有16569bp,测序产生的数据量小,所以检测快速、成本低。mt DNA具有高拷贝数,一个细胞中可含有几百至几千个mt DNA的拷贝。另外,肿瘤细胞中mt DNA常存在于高水平活性氧的环境下,同时缺少组蛋白保护和有效的DNA修复系统,因此其突变频率较核基因组高10倍左右。因此,外周血游离mt DNA作为诊断、治疗标志物具有良好临床应用价值,有望成为液体活检的新型肿瘤标志物。目的1.分析血浆游离线粒体DNA特征,包括血浆游离mt DNA拷贝数、片段大小和断点分布;2.建立肿瘤患者血浆游离mt DNA突变的大样本精准检测方法;3.观察肿瘤患者血浆游离mt DNA突变特征,并探索可能在肿瘤发生及演变过程中可能发挥重要功能的mt DNA突变。方法1.构建全基因组测序文库,通过全基因组测序分析血浆游离mt DNA的拷贝数、片段分布特征及断点特征;2.利用自制的线粒体DNA杂交捕获探针从全基因组测序文库中捕获mt DNA,观察不同探针使用量、探针长度、杂交温度以及扩增次数对于mt DNA富集效率的影响,以优化mt DNA检测的实验流程;3.使用上述优化后的流程对肿瘤患者中血浆游离mt DNA进行捕获,利用自建的生信分析流程检测血浆游离mt DNA体细胞突变,并分析突变特征。结果1.肝癌血浆游离mt DNA的拷贝数显著低于组织mt DNA(P<0.001);片段分布集中于100-140bp之间,明显低于血浆游离DNA,断点呈现规律性分布;2.捕获效率随探针使用量的增加呈先上升后下降的趋势,探针长度、杂交温度以及扩增次数对于捕获效率均有影响,通过设置不同实验参数,已建立最优流程;3.肿瘤患者的血浆中mt DNA异质性突变数量高于肿瘤组织中mt DNA异质性突变数量(P<0.05);4.肿瘤患者的血浆与肿瘤组织样本中存在相同的mt DNA异质性突变。结论血浆中mt DNA与肿瘤组织中mt DNA存在差异性,应个性化设置实验参数以提高捕获效率;基于靶向捕获测序技术,可以准确的在血浆中检测到肿瘤来源的mt DNA突变。

关键词： MicroRNAs   ceRNAs   鸡   胚胎干细胞   精原干细胞  

摘要： 不论是作为模式动物在科研领域的贡献,或是作为蛋白质肉类满足人们的日常需求,鸡遗传学在贡献新知识和满足全球食品需求方面有着悠久的历史和良好的前景。为了适应现代商业化生产,如何高效获得种公鸡优良品质的雄性生殖细胞就成了关键技术之一。胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)是干性最高的一类细胞,原则上体内其他各类细胞都可以由它分化而来,当然也包括雄性生殖细胞。ESCs向雄性生殖细胞的分化过程受到诸多因素的协同调控,因此只有分别阐明这些调控因素在雄性生殖细胞分化中的调节机制,建立有效的体外诱导分化体系,才有从根本上有效提高雄性生殖细胞的体外生成效率。MicroRNAs(miRNAs)能够参与机体内生理和病理众多过程,是一类非常重要的调控因子,随着越来越多的miRNAs被发现,其在生殖细胞进程中的作用也逐渐被重视起来。本实验前期筛选出在RA(Retinoicacid)体外诱导ESCs向SSCs(Spermatogonial stem cells)分化过程中差异性表达的miR-302d,本文分别在体内外水平对其进行了功能验证,筛选并验证其靶基因Tle4的功能,探究miR-302d对生殖细胞分化相关Wnt信号通路中关键基因的影响,并初步探索miR-302d、互作LncRNA-341和靶基因Tle4三者之间的关系。结果表明,LncRNA-341能够竞争结合miR-302d,抑制miR-302d对Tle4的靶向结合,从而上调Tle4的表达,进而调节Wnt信号通路上相关节点基因的表达,来促进鸡体内外SSCs的形成。该研究为后续利用miRNAs诱导ESCs向雄性生殖细胞分化、建立稳定高效的体外诱导分化培养体系和获得高质量的雄性生殖细胞提供实验支持。

关键词： 干细胞   血管平滑肌细胞   miRNA-145   KLF4   诱导分化  

摘要： 目的:本研究拟将miRNA-145作为诱导剂联合其他诱导剂诱导胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）分化为血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells,VSMCs）,初步建立miRNA-145促进ESCs向VSMCs诱导分化方案。最后在最佳诱导方案中,过表达Krüppel样因子4（Krüppel-like factor 4,KLF4）,初步研究miRNA-145促进ESCs诱导分化为VSMCs的机制。为后续进一步研究调控机制以及建立更加快速高效的ESC-VSMCs诱导方案打下基础。方法:1、ESCs诱导分化为VSMCs过程中,检测miRNA-145、KLF4以及VSMCs特异性标记蛋白表达情况。2、以miRNA-145作为诱导剂,与不同诱导剂进行组合,建立最佳的诱导分化方案,同时在此方案基础上,过表达KLF4,观察诱导分化出的细胞VSMCs标记蛋白表达以及收缩功能的变化情况。结果:1、miRNA-145在胚胎干细胞向血管平滑肌细胞诱导分化过程中表达的实验研究（1）成功诱导出ESC-VSMCs,随着诱导的进行,光镜下表现为密切接触的克隆样细胞逐渐向为长梭形转变。（2）在不同诱导阶段,通过Q-PCR鉴定显示,miRNA-145及VSMCs特异性标记α平滑肌肌动蛋白（Alpha-smooth muscle actin,α-SMA）,Calponin,平滑肌22α（Smooth muscle 22 alpha,SM22α）动态变化,第1-3天,KLF4表达降低。第3天开始,miRNA-145表达显著升高,到第6天达到高峰,特异性标记基因呈现出相同的变化趋势。（3）通过免疫荧光染色检测,ESC-VSMCs中特异性标记蛋白α-SMA,Calponin,SM22α均阳性表达。2、miRNA-145在胚胎干细胞向血管平滑肌细胞诱导分化过程中表达的实验研究miRNA-145促进胚胎干细胞向血管平滑肌细胞诱导分化方案的初步研究（1）通过miRNA-145与ActivinA、血小板衍生生长因子-BB（Platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB）不同的组合作为诱导剂,均能诱导出既表达特异性标记蛋白,又具有收缩功能的VSMCs,但不同分组具有差异,其中miRNA-145联合PDGF-BB诱导效率最佳。（2）miRNA-145可能通过抑制KLF4促进干细胞向VSMCs诱导分化,尤其是在促进中间谱系细胞分化为VSMCs过程中。结论:1、通过miRNA-145与ActivinA、PDGF-BB不同的组合作为诱导剂,均能诱导出既表达特异性标记蛋白,又具有收缩功能的VSMCs,但不同分组具有差异,其中miRNA-145联合PDGF-BB诱导效率最佳。2、miRNA-145可能通过抑制KLF4促进干细胞向VSMCs诱导分化的作用,尤其是在促进中间谱系细胞分化为VSMCs过程中。