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关键词： 转基因作物   NGS   分子特征   侧翼序列   安全评价  

摘要： 分子特征是指转基因植物中外源DNA片段在受体基因组中的整合、表达以及遗传稳定性等方面的信息,主要内容有插入外源基因的拷贝数、插入位点的侧翼序列、插入序列的完整性、是否有载体骨架序列的插入等。分子特征是研发者筛选和鉴别转化体重要依据,也是转基因植物安全评价的主要内容。目前,插入外源基因的拷贝数可以通过Southern杂交、荧光定量PCR或数字PCR等方法进行解析,插入位点和侧翼序列可以通过基于PCR的染色体步移技术获得。这些技术适用于解析外源插入片段整合情况比较简单的转基因作物的分子特征,但对于同一位点插入多个拷贝等复杂整合情况、包含多个外源基因的复合性状转基因作物、以及应用基因编辑和合成生物学等技术研发的新型转基因作物的分子特征的解析往往不够精准。随着DNA测序技术的发展和大数据时代的到来,NGS(Next Generation Sequencing)技术以其高通量、灵敏度高、可操作性强、和可重复性强等特点,为精准解析转基因植物的分子特征提供了新的技术方案。本研究在对NGS测序技术的发展、NGS技术在转基因植物分子特征解析中的应用、以及国外转基因植物安全评价中对高通量测序数据的要求等背景调研的基础上,总结了NGS技术解析转基因作物分子特征的技术方法,对NGS测序和传统方法解析转基因作物分子特征的技术原理与结果进行了系统的比较,并将NGS不同测序平台的测序结果及数据处理方式进行了对比。主要研究内容与结果如下:1.建立了NGS技术解析转基因作物分子特征的技术方法。以转基因抗草甘膦水稻G2-7转化体及其亲本中花11为样本,利用Illumina NovaSeq 6000平台进行全基因组测序,共获得了129.72Gb的测序数据,通过与水稻参考基因组和转基因载体序列的比较,确定了G2-7转化事件的外源基因为单拷贝插入,无质粒骨架的插入,插入位点为水稻Oryza sativa Japonica Group 1号染色体,造成了水稻基因组16 bp的缺失和插入外源DNA参考序列两端共49 bp的缺失,并用序列拼接的方法找到了插入位置左右分别375 bp和353 bp的侧翼序列,证明了使用NGS技术和生物信息学方法相结合的方法,能够为评估转基因植物的安全性提供节省时间和成本的有效方法。2.对整合情况较为复杂的转化体的分子特征解析。用Illumina HiSeq 4000平台对转基因抗草甘膦水稻G2-6转化体及其亲本中花11进行全基因组测序,深度分别为20×、30×、40×、70×,共获得了149.35 Gb的测序数据,用PacBio Sequal平台对抗草甘膦水稻G2-6转化体及其亲本中花11进行全基因组测序,数据量为20 Gb。通过Illumina平台和PacBio平台测序结果结合的方法对G2-6转化体进行了分子特征解析,确定了G2-6转化事件的外源基因为单拷贝插入,无质粒骨架的插入,插入位点为水稻Oryza sativa Japonica Group 8号染色体,造成了水稻基因组31bp的缺失和插入外源DNA参考序列两端共69 bp的缺失,将Illumina和PacBio的测序数据结合分析,获得了传统方法无法获得的插入位点左右两端分别为278 bp和773 bp的侧翼序列,并发现了G2-6转化体3’端的一段482 bp的非预期插入序列,说明PacBio测序平台在解决复杂的外源DNA串联、重复等情况有独特的优势。3.对NGS测序技术在转基因安全评价中的应用过程中的一些技术方法进行了比较,包括不同的测序平台、不同的数据分析软件以及不同测序深度进行了对比,本研究中使用Illumina和PacBio测序结果进行分子特征解析能够得到拷贝数、插入位点、载体骨架插入方面一致的结论,对于复杂转化体的侧翼序列,可以用PacBio测序结合Sanger测序结果进行分析;本研究中对Illumina测序结果分析使用的两种比对分析软件和可视化软件均能得到一致的结论,在软件的选择上可以根据测序数据量及参考序列大小进行选择;在同批次建库测序的条件下,Illumina测序获得的数据量与测序深度成正比,在进行侧翼序列组装时,建议使用30×以上的测序数据,确保接合区获得的数据量充足。以上结果为NGS在转基因作物安全评价中的应用提供了参考。综上,本论文的研究结果表明,NGS技术在解析转基因作物的分子特征方面能够得到与传统方法相当的结果,并且在解析复杂整合体的分子特征时能够克服传统方法的不足,有着更高效、快速的优势。本文为NGS技术在我国转基因生物安全评价中的应用提供了理论支撑。

关键词： 耳聋   胚胎干细胞   内耳类毛细胞   miR-183家族   MC-3T3条件培养液  

摘要： 耳聋是全球性常见疾病，严重损害了广大患者的社会交流能力，影响了人类的生活质量。内耳毛细胞是是内耳重要的听觉感受器，人类耳蜗及前庭中只存在15000个毛细胞，而作为终末分化细胞，毛细胞受到损伤后不能再生。遗传或者获得性因素如年龄增长、耳毒性药物、病毒感染、噪音和外伤等会使毛细胞受到损伤，造成感音神经性耳聋。长期以来，改善听力的选择仅限于助听器、人工耳蜗等设备，但这些方法无法从根本上解决问题。　　胚胎干细胞在适宜条件下可分化为几乎所有的细胞类型，可以作为内耳毛细胞再生的重要种子细胞之一。利用胚胎干细胞技术，内耳毛细胞的再生和修复成可能，有望在临床治疗上根治耳聋这一顽疾。目前在耳蜗毛细胞的miRNA研究中，miR-183家族是最先被报道参与了纤毛化的感觉上皮细胞和神经纤毛细胞的器官发生和发育功能的基因簇，它们在某些器官如眼睛、鼻子和内耳中有特殊的表达，对动物感觉器官的发育和功能的形成至关重要。　　本研究利用小鼠胚胎干细胞分别构建了miR-96、miR-182、miR-183过表达的细胞株miR-96-mES、miR-182-mES、miR-183-mES，并利用这一系列的细胞株制备104cells大小的拟胚体，在MC3T3培养液(MC3T3 Conditioned Medium， MC3T3-CM)及强力霉素(Dox)共同作用下，构建了体外高效诱导分化产生内耳类毛细胞的体系，将小鼠mES细胞分为三个阶段：分别是外胚层细胞、听觉前体细胞和内耳类毛细胞进行诱导分化，同时设置WT-mES的拟胚体在MC3T3-CM和EB-CM两种不同培养条件下诱导分化实验作为对照。实验结果发现过表达的细胞株miR-96-mES、miR-182-mES、miR-183-mES制备成104cells大小拟胚体后，均具有向外胚层细胞分化的潜能，同时在MC3T3-CM条件下诱导贴壁生长6d后，免疫荧光实验检测出Pax2、Pax8听觉前体细胞的标志基因高表达，14d后免疫荧光实验检测除诱导得到的Brn3c、Myosin7a、Math1内耳类毛细胞表达毛细胞的相关标志基因高表达。扫描电镜实验镜检观察到三株过表达细胞诱导分化而来的类毛细胞表面也发现有不同程度的不成熟的杂乱纤毛结构。FM1-43FX吸附电生理实验结果进一步证实了三株过表达细胞体外诱导分化获得的类毛细胞具有内耳毛细胞特异性的静纤毛样结构，且具备了初步的电生理功能。　　总之，本研究实验成功构建了miR-96、miR-182、miR-183过表达的小鼠胚胎干细胞的细胞株，并在体外高效诱导分化体系MC3T3-CM-Dox(＋)的作用下分化为内耳类毛细胞，为干细胞治疗毛细胞损伤耳聋提供基础材料。

关键词： 促肾上腺皮质激素   促肾上腺皮质激素持久   基因工程   稳定性   药理作用制备   纯化  

摘要： 目的:胰岛素样生长因子(IGFs)是DNA序列与胰岛素非常相似的蛋白质。IGF是细胞用来与周围环境通讯的复杂系统的一部分,它们在促进细胞增殖和抑制细胞死亡或凋亡方面发挥着作用。研究表明,胰岛素/IGF轴在衰老中起着重要作用,在诸如癌症和糖尿病等疾病中也起着重要作用,例如,IGF-1既可以刺激前列腺癌细胞也可以刺激乳腺癌细胞生长。方法:在大肠杆菌中表达与组织纤溶酶原激活剂(TPAST)融合至胰岛素样生长因子(IGF1)的重组腺皮质激素(ACTH)重组融合蛋白(His Tag-Linker-ACTH-TPAST-IGFI-PET21)。并使用Ni-NTA琼脂糖珠进行纯化。IGF1通过TPAST底物接头与ACTH融合的原因是因为在血液中存在组织纤溶酶原激活剂(TPAST),它将作用于TPAST底物接头并切割该部位以释放ACTH和IGF1。IGFI可以使ACTH的效果提高20倍以上。(1)使用Primer Express软件设计wt ACTH,TPAst,IGF1的引物F和R。(2)使用蛋白酶数据库分析了ACTH中的蛋白酶(存在于血液中)的切割位点,并通过重叠PCR方法创建了融合ACTH-IPAst-IGF1的三个基因。(3)接下来,通过使用限制酶消化物连接到p ET21a载体中,构建融合表达质粒(His Tag-Linker-ACTH-TPAST-IGFI-PET21)。(4)将重组质粒转化到大肠杆菌BL21-DE3菌株中进行蛋白表达。(5)在分析ACTH-TPAst-IGF1融合的重组蛋白的表达是否在上清液或沉淀级分中后,使用Ni-NTA琼脂糖珠进一步纯化。(6)由于蛋白质在大肠杆菌的沉淀级分中表达,因此由于形成包涵体而使其变性和微粒化。因此,需要对其进行复性和溶解以使其重折叠以增加活性。(7)下一步是在基于体外细胞的测定和体内测定中测试该蛋白的功能。结果:(1)通过重叠PCR产生融合的基因产物,然后亚克隆到p ET21a载体中。(2)构建野生型(WT)ACTH-TPAST-IGFI的质粒,然后通过DNA测序进行验证:(3)从大肠杆菌菌株BL21-DE3中表达并纯化以上所有物质。在SDS-PAGE凝胶上进行了考马斯亮蓝染色,显示了14kd融合蛋白在IPTG诱导培养物的沉淀级分和蛋白质纯化级分后的洗脱级分中的表达。(4)但是,由于蛋白质不溶,因此将其透析并重新折叠并浓缩蛋白质。(1)分子实验结果1.质粒图谱2.双重酶促裂解3.将融合基因PCR产物克隆到载体中***测序5.重组融合蛋白在大肠杆菌中的表达6.蛋白质纯化和洗脱蛋白的复性。***-PAGE。凝胶用可可蓝染色。***法测定小鼠中c AMP,CREB和Gluco皮质类固醇浓度的产生(由于Covid-19的当前情况,有待完成)结论:(1)我们成功地在大肠杆菌中以沉淀级分克隆并表达了重组融合蛋白。(2)使用Ni-NTA磁珠对该14KD蛋白进行蛋白纯化得到纯洗脱级分,纯蛋白浓度为＿(3)我们成功地通过透析使14kd融合蛋白的蛋白复性。

关键词： 水稻   褐飞虱   基因编辑   苏云金芽胞杆菌   Cry1Ab毒素   分子改造  

摘要： 褐飞虱作为亚洲水稻生产的主要害虫之一，亟需开发高效、安全的生物防治手段控制其危害。苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）Cry1A毒素及其基因已大量用于生物农药或转基因作物防治鳞翅目害虫。然而，Cry1A毒素对褐飞虱等半翅目昆虫并无毒性作用。钙粘蛋白（cadherin）作为一种细胞膜结合蛋白广泛存在于生物体内。通过对Cry1A毒理机制的研究发现，Cry1A毒素分子诱发毒性作用是因其能够与多数靶标昆虫中肠cadherin互作。通过对昆虫抗性机制的研究显示，部分鳞翅目昆虫对Cry1Ac毒素产生抗性的关键因素是因其中肠cadherin的突变与缺失。然而，中肠cadherin蛋白是否作为Cry1A毒素的关键受体，Cry1A毒素能否与昆虫中肠cadherin蛋白结合产生毒性作用仍有待于进一步验证。在对Cry1A毒理机制认识的过程中，中肠cadherin蛋白被认为是影响Cry1A毒素毒性作用的关键要素。为了改造Cry1A毒素，拓展其杀虫谱，使其对褐飞虱具有毒性作用，本研究利用课题组前期筛选获得的能够与褐飞虱中肠cadherin蛋白结合的短肽（brown planthopper midgut cadheirn binding peptide，BMCBP）替换Cry1Ab domain II中决定受体识别的loopα8、loop1、loop2及loop3四个环区，经克隆及原核表达获得11个单个或多个环区被BMCBP替换的GST-Cry1Ab改造蛋白。其中有6个改造蛋白由于环区替换导致结构不稳定，易降解。经过生物活性测定后，筛选出3个改造毒素对褐飞虱具有潜在毒性作用。其中，利用BMCBP替换loop2、loop3环区后获得的改造毒素GST-BMCBPL2L3-Cry1Ab和4个环区都替换后获得的改造毒素GST-BMCBPL1L2L3Lα8-Cry1Ab在10?g/mL的浓度下饲喂褐飞虱2龄若虫96h后，造成褐飞虱死亡率达30-40%，对比野生型Cry1Ab毒素，死亡率提升了2-3倍。　　为了进一步确认改造毒素与褐飞虱中肠cadherin结合能够导致其对褐飞虱的毒性作用，需要获得中肠cadherin缺失的褐飞虱品系。由于褐飞虱产卵于水稻韧皮部，且卵体积小，胚胎离体存活率低。本研究基于CRISPR/Cas9技术在褐飞虱上的应用，对褐飞虱胚胎显微注射及虫卵离体孵化技术进行了条件摸索与优化。产卵高峰期摸索结果显示，在成虫期12天及20天时有两个产卵高峰期，每20只成虫2h内产卵数能够达到80枚。针对褐飞虱虫卵离开水稻韧皮部后易受细菌及真菌侵染导致胚胎死亡的问题，本研究发现经抗菌溶液（75%酒精、20ng/μL戊唑醇和50ng/μL卡那霉素）处理后胚胎存活率较对照组提升一倍，可达50%。利用Nanoinject III系统对褐飞虱胚胎进行显微注射的条件优化。包括显微注射前玻璃针开口的磨针角度优化、显微注射过程中注射溶液体积的优化及注射速度的优化等。结果证明以15°夹角研磨开口的玻璃针注射的褐飞虱胚胎存活率最高，可达到4%;每次胚胎注射溶液体积为1.1nL时胚胎的存活率最高，达到2.5%;注射速度为1nL/s时胚胎的存活率最高，可达到4%-5%。本研究还通过对褐飞虱胚胎发育过程中胚胎内共生菌生长状况、卵壳表面红眼斑点出现时间及卵离体孵化时间进行统计分析，以进一步掌握显微注射后褐飞虱卵存活及孵化时间节点。为了在基因编辑后高效筛选突变体，需要在保证试虫存活的前提下，分离试虫身体组织，经裂解后提取DNA用于突变基因型分析。本研究对褐飞虱2龄若虫进行了不同部位的摘取，以观察受损虫体的存活率。结果显示摘取左后足跟部位的褐飞虱若虫具有最高的存活率（60%），能够进入成虫期并顺利交配。基于上述优化条件，本研究参考已公布的褐飞虱基因组（BioProject:PRJNA177647）及中肠转录组数据（BioProject:PRJNA504931），针对控制褐飞虱眼部色素沉降的色素沉降基因（pigmentation，GenBank accession ***376474.1）所在的scaffold的第11号外显子上的PAM位点设计guide RNA。胚胎注射guide RNA及Cas9蛋白后，于G0代成功获得色素沉降基因上对应PAM位点有1个碱基删除突变的褐飞虱突变体。相较于野生型褐飞虱若虫，该突变体能够呈现白眼表型。　　本研究利用基因工程技术结合褐飞虱中肠cadherin蛋白的短肽改造Bt Cry1Ab毒素，筛选获得了对褐飞虱毒性作用有所提升的蛋白突变体。上述结果对定向改造Cry毒素以防治褐飞虱等非靶标昆虫具有参考意义。此外，优化了针对褐飞虱特定基因的基因敲除技术平台，为后续定向敲除褐飞虱中肠cadherin，以验证改造获得的Cry1Ab突变体

关键词： 纳米孔   DNA测序   信息分析   解旋酶动力学  

摘要： DNA序列中包含着丰富的遗传信息,DNA测序技术对于基因突变的检测、遗传病诊断、犯罪调查等都有着至关重要的作用。从第一代的Sanger测序法发展至今,测序原理和技术一直在不断更新。如今以纳米孔为代表的第三代测序技术,高通量、低成本、单分子无标记的测序方式,已经有了商业化测序产品。近些年来,基于纳米孔的测序技术飞速发展。固态纳米孔与生物纳米孔等方面都取得了不错的进展。固态纳米孔除了DNA分子探测功能外,还能够实现DNA分子修饰检测、蛋白质检测和分子折叠探测等功能。生物纳米孔测序技术不仅实现了DNA分子测序,还能够识别DNA分子上的甲基化修饰信息。基于离子电流的纳米孔测序技术,日臻成熟并且不断突破。本论文的开展基于纳米孔测序技术,探测纳米孔中纳米结构动力学等相关问题。研究内容主要包括:1.基于固态纳米孔单分子探测手段,利用氮化硅纳米孔探测四面体DNA纳米结构的穿孔动力学。当纳米孔孔径比四面体DNA纳米结构稍大一点时,在电流信号中可以清楚的看到四面体DNA纳米结构的穿孔事件。阻孔电流与穿孔时间的统计分析结果表明,四面体DNA纳米结构的穿孔行为类似于双链DNA分子,都可以用一维有偏扩散模型描述。利用四面体DNA纳米结构作为线性DNA分子上的标记物,构建了三种类型的分子。分子穿孔电流信号中,可以清晰看到四面体DNA纳米结构引起的额外电流信号。得到了高信噪比穿孔信号。归一化时间位置与四面体DNA纳米结构结合位置一致。2.基于生物纳米孔测序技术,利用商业化测序仪探测解旋酶动力学。解旋酶作用位点与纳米孔测序敏感位置存在一段距离,因此序列信息与每个碱基解旋时间存在偏移量。基于Lab VIEW编程语言,我们编写了用于纳米孔DNA测序信息分析的程序。该程序结合了序列比对算法,能够图像化数据并且批量化处理数据。结果表明,解旋酶对于每个碱基的解旋时间都不相同,解旋作用与碱基化学结构和结合方式都相关,通过测序方式得到了特异性偏移量的信息。顺铂结合DNA分子的测序信息可以获得顺铂分子的结合位点,并且顺铂分子会影响解旋酶的解旋作用。3.我们自主设计了固态纳米孔绝缘衬底的加工模具,利用聚甲基丙烯酸甲酯粉末热熔成型的方式,可以实现绝缘衬底的批量化制备。绝缘衬底可以应用于二维材料的转移。

关键词： PCV2   疫苗   复制缺陷病毒   反式互补   基因工程  

摘要： 由PCV2感染引起的PCVAD于2002年开始在我国各地呈暴发流行以来,至今成为危害我国养猪业的重要疫病之一。感染PCV2将导致猪免疫抑制,易继发或并发其他病原体,从而造成更大的经济损失。疫苗免疫是预防PCV2相关疾病的主要手段,目前临床应用的PCV2疫苗主要分为两类,全病毒灭活苗和基因工程亚单位疫苗,尽管具有较好的安全性,但是达不到理想的免疫保护效果。因此国内外许多研究人员进行了新型PCV2疫苗的研究,包括弱毒疫苗、DNA疫苗等。本试验研究将利用基因工程技术制备复制缺陷PCV2病毒,为开发新型PCV2基因工程疫苗奠定了前期实验室研究基础。1 p IRES2-CAPopt表达载体的构建根据家猪的密码子偏好,对CAP基因的ORF序列进行重新编码并人工合成,通过上游引入BglⅡ位点、下游引入Not I位点克隆于p UC载体。p UC-CAPopt质粒和p IRES2-EGFP质粒通过BglⅡ和NotⅠ进行双酶切,分别获得CAP小片段和p IRES2载体大片段,再通过T4 DNA连接酶连接、转化,获得p IRES2-CAPopt表达载体。将p IRES2-CAPopt进行酶切鉴定,结果显示,CAP基因约700bp,p IRES2载体约4000bp,片段大小与预期结果相同,表达载体构建成功。2 CAP反式互补转基因PK15细胞株(CTC-PK15)的构建用无内毒素p IRES2-CAPopt质粒瞬时转染96孔板PK-15细胞,间接免疫荧光试验(IFA)验证载体中CAP的表达功能。p IRES2-CAPopt稳定转染24孔板PK-15细胞,稀释至1000-2000个/m L,不同浓度梯度G418筛选10-14d,确定PK-15细胞的最适筛选浓度。p IRES2-CAPopt稳定转染6孔板PK-15细胞,700 ug/ml G418加压筛选至无细胞死亡,极限稀释法挑选单克隆细胞后进行IFA验证。结果显示,p IRES2-CAPop瞬时转染细胞荧光率达10%,表明根据家猪密码子偏好重新编码的CAP基因插入p IRES2-CAPopt载体中能在PK-15细胞中正常表达。p IRES2-CAPopt稳定转染PK-15细胞后经G418加压筛选和极限稀释法单克隆筛选,获得CAP反式互补转基因细胞CTC-PK15。3复制缺陷PCV2感染性克隆p PCV2-M的构建运用线性PCR重组技术,以p Omni为载体克隆PCV2基因组DNA,构建获得感染性克隆p Omni-PCV2。通过DNA定点突变技术将p Omni-PCV2载体上CAP基因的138、139、140连续3个氨基酸密码子突变为终止密码子,构建突变病毒感染性克隆p PCV2-M。菌液PCR鉴定结果表明感染性克隆p Omni-PCV2构建成功。突变的p PCV2-M感染性克隆测序结果显示CAP中连续3个氨基酸密码子成功突变为TAA、TAG、TGA三个终止密码子。4复制缺陷病毒PCV2-M的拯救用p PCV2-M感染性克隆转染CTC-PK15细胞,G418维持浓度下盲传12代,收获PCV2-M病毒,特异性PCR扩增显示病毒DNA逐代增多,证明复制缺陷病毒PCV2-M拯救成功。将已知滴度的PCV2病毒(TCID=10)DNA 10倍梯度至10,以不同稀释度DNA为模板进行PCR扩增,观察PCR结果中扩增阳性的最高稀释度与TCID的对应关系。提取盲传12代的PCV2-M病毒DNA 10倍梯度稀释后进行PCR扩增,与PCV2病毒模板扩增结果比较来估计PCV2-M的病毒滴度。结果显示,PCV2病毒模板扩增阳性的最高稀释倍数为10,而PCV2-M病毒扩增阳性的最高稀释度为10,因为PCR模板与IFA法测定病毒滴度时都是10倍梯度稀释,因此估计PCV2-M病毒的TCID约为10。5复制缺陷病毒PCV2-M的增殖缺陷验证用拯救的PCV2-M病毒分别感染PK-15细胞和CTC-PK15细胞并盲传3代,收获两种细胞的裂解液提取病毒DNA,通过特异性PCR验证PCV2-M病毒在正常PK-15细胞中的复制缺陷特性。结果显示PCV2-M病毒感染CTC-PK15细胞后1-3代盲传细胞裂解液均能扩增出特异性条带,而PCV2-M病毒感染PK-15细胞后只有P1代细胞裂解液有扩增条带,P2、P3代细胞裂解液均无扩增条带,表明PCV2-M病毒对正常PK-15细胞具有感染性,能感染进入PK-15细胞,但不能产生子代病毒从而感染下一代细胞。用PCV2-M病毒感染CTC-PK15细胞,连续传代30代,每10代收获一次病毒感染PK-15细胞后通过IFA验证PCV2-M病毒是否发生回复突变。结果显示PCV2-M病毒在CTC-PK15细胞中连续传30代后在PK-15细胞中仍为复制缺陷病毒,表明其没有发生回复突变,说明本研究设计构建的PCV2-M

关键词： 胚胎干细胞   神经分化   糖胺聚糖类似物   视磺酸   光热传输  

摘要： 胚胎干细胞向神经细胞的诱导分化在神经退行性疾病的治疗中具有良好的应用前景,如何高效的诱导干细胞向神经细胞定向分化是当前亟需解决的关键问题。糖胺聚糖(GAG)相关信号通路和视黄酸(RA)相关信号通路作为干细胞神经分化过程中最为关键的两种信号通路,在基础研究和实际应用中都受到了广泛的关注。然而,信号分子利用度低是上述两类策略中存在的共性问题。基于此,本论文旨在开发一种新型的细胞分化诱导平台,既能利用糖胺聚糖类似物作用于GAG相关信号通路以促进神经分化,同时提高RA的细胞利用率进一步促进神经细胞的分化和成熟,通过以上两种方式协同作用于神经分化信号通路,达到提高干细胞神经分化效率和纯度的目的。具体研究内容如下:(1)以金纳米粒子(GNP)为载体,研究糖胺聚糖类似物和RA光热传输的协同作用对小鼠胚胎干细胞神经分化的影响。首先通过可逆加成-断裂链转移自由基聚合(RAFT)的方法合成分别含有糖胺聚糖功能性单元(糖单元和磺酸单元)的聚合物聚N-甲基丙烯酰葡萄糖(PMAG)和聚对苯乙烯磺酸钠(PSS),并通过胺解法得到巯基化的聚合物。随后通过不同的比例将上述两种聚合物组装到金纳米粒子表面,得到糖胺聚糖类似物改性的纳米粒子复合物。该复合物利用GNP与细胞膜之间的相互作用将功能单元富集到细胞膜表面,提高功能单元激活GAG相关信号通路的效率,达到促进神经分化的效果。同时,利用GNP自身的光热转换效应,在一定的激光照射条件下将RA传输到细胞内,提高其与细胞核上相应受体结合的几率从而进一步提高分化效率,以此来提高干细胞神经分化的效率和纯度。免疫荧光染色和实时定量聚合酶链式反应(qPCR)实验结果表明:当两种聚合物按投料比为1:1进行组装时,获得的纳米粒子复合物即GNP-M1S1具有最佳的促分化效果。更为重要的是,在0.80 W/cm2激光功率照射10s条件下,GNP-M1S1实验组分化细胞β3-tubulin基因的表达量增加320倍左右,分化细胞中神经细胞百分比提高到87%左右。该结果表明,金纳米粒子表面糖胺聚糖功能单元的修饰以及光热效应的协同不仅能够显著提高胚胎干细胞向神经细胞的分化效率,而且对分化神经细胞的纯度也有显著提升。(2)基于静电纺丝支架材料研究糖胺聚糖类似物及光热金纳米材料对胚胎干细胞神经分化的影响。首先通过同轴静电纺丝技术制备负载糖胺聚糖类似物和金纳米棒(GNR)的核壳结构支架材料,纤维内核为含糖单元和磺酸单元的聚合物PMAG和PSS,纤维外壳为包载GNR的聚己内酯(PCL)壳层。支架材料的高孔隙率为细胞提供良好的生长微环境,纤维结构中负载的聚合物释放后作用于细胞,激活GAG相关信号通路以促进干细胞分化;同时,利用纤维壳层中GNR的光热效应将RA因子输送到细胞内部,与细胞核上的受体结合,进一步促进干细胞的神经分化。实验结果表明:纺丝结构中糖胺聚糖类似物和金纳米棒的引入均具有促神经分化的作用;同时,GNR光热效应的协同显著增强了 PCL@GNR和PCL&P@GNR支架材料的促神经分化效果,尤其是PCL&P@GNR支架材料,在0.66 W/cm2激光功率照射30 s的条件下,促神经分化效果达到最佳,神经细胞标志性基因β3-tubulin的相对表达量提高250倍左右。该结果表明,这种新型的复合支架材料在金纳米棒光热效应的协同下具有优异的促神经分化效果。综上所述,本论文基于糖胺聚糖类似物和神经诱导分子RA在胚胎干细胞神经分化中的重要作用,分别以金纳米粒子和静电纺丝材料作为载体,既利用糖胺聚糖类似物作用于GAG相关信号通路,同时又通过光热效应提高RA向细胞内的传输,通过上述两种策略的协同提高干细胞神经分化的效率和纯度。本论文的工作为构建胚胎干细胞神经分化诱导平台提供了新的思路和方向,不仅对神经退行性疾病的细胞治疗具有重要的理论研究意义和实际应用价值,同时也为其他类型细胞的定向诱导分化提供了指导。

关键词： 类胡萝卜素   虾青素   磷酸甘露糖异构酶   转录因子  

摘要： 类胡萝卜素是广泛存在于自然界中的萜烯类化合物，具有广泛的生物学功能，对动物体十分重要。番茄（Solanum lycopersicum）是人体获得类胡萝卜素的主要来源之一，其基因组小，遗传背景清晰、栽培和转化技术成熟，是进行类胡萝卜素研究的重要模式植物。本论文利用基因工程技术，探索影响以番茄为细胞工厂合成虾青素等酮式类胡萝卜素的因素，建立基于绿藻源的磷酸甘露糖异构酶基因(ChlPMI)为选择标记基因的番茄遗传转化系统。　　番茄果实有独特积累番茄红素的合成机制，而催化番茄红素合成虾青素需要番茄红素β-环化酶(LCYB)、β-胡萝卜素酮化酶(BKT)和羟化酶(BHY)。自切割2A肽介导的多顺反子基因是实现多基因异源表达的有效策略。本研究首先评价由CaMV35S启动子驱动的2A肽序列连接的四个虾青素合成相关基因（crtB-2A-HpBHY-2A-CrBKT-2A-VsVHB）在烟草中的表达效果。转基因烟草植株呈红色，叶片中合成了虾青素、角黄质、酮式叶黄素，但其植株生长发育异常，不能完成其生活史。为了克服此问题，采用番茄果实特异性启动子E8替代组成型强启动子CaMV35S，同时用AtOR或SlLCYB替代VsVHB基因优化表达载体，比较分析组成型和果实特异性启动子驱动不同基因串crtB-HpBHY-CrBKT-AtOR(BBBO)和crtB-HpBHY-CrBKT-SlLCYB（BBBB）在番茄中表达的效应。　　组成型表达BBBO或BBBB的Micro-Tom品种番茄细胞可分化出高含虾青素的红色愈伤组织，但其器官分化受阻，不能再生出苗。果实特异性表达BBBO和BBBB的Micro-Tom和Huang Song番茄细胞可分化出生长发育正常的产虾青素番茄植株(BBBO和BBBB)，其表型与对照无明显差别。转BBBO的Micro-Tom番茄果实总类胡萝卜素含量是对照的6倍，且含有2.97μg/g FW的虾青素。不同于原品种Huang Song的黄色果实，转BBBB的Huang Song番茄结出红色的果实，其总类胡萝卜素含量可提升至约6.6mg/g DW，为原品种的44倍，市售栽培品种的3倍，且含有40.87μg/g DW的虾青素。在不同生长环境和季节，不同世代(T1，T2)BBBB番茄表型及果实中类胡萝卜素谱与其母本(T0)一致，表明所培育的工程番茄的优异性状能稳定遗传，具有一定的应用潜力。　　分析BBBB番茄异源和内源类胡萝卜素合成相关基因的表达发现，E8只驱动外源基因在果实成熟期表达，不影响转化植株的营养生长，是转基因植株得以正常生长发育的关键。crtB的表达弥补了Huang Song番茄中PSY1功能弱化引起果实中八氢番茄红素合成受阻的不足，而CrBKT和HpBHY可催化内源类胡萝卜素发生酮化和羟化反应、促进含氧类胡萝卜素的生成。同时，qRT-PCR分析表明在绿果期BBBB番茄中大部分内源类胡萝卜素合成途径关键基因（GGPPS2、PSY1、PDS、CYCB、CrtR-b2）较对照表达上调，ZDS的表达量在爆发期和粉果期时是对照的约2倍，DXS1表达量在粉果期和熟果期较对照显著上调。此外，BBBB番茄果实中形成了更多更大的质体小球，为类胡萝卜素的储存提供更大的空间。表明外源基因的表达促发一系列内源基因的表达，内源代谢网络协同外源基因促进BBBB番茄果实中类胡萝卜素的合成。　　从能够代谢甘露糖的绿藻Chlorococcum sp.中克隆了一个磷酸甘露糖异构酶基因(ChlPMI)并评价其为新的生物安全选择标记基因的可行性。ChlPMI编码438个氨基酸，为typeⅠPMI。系统进化分析表明其与来自藻类、高等植物及人类的PMIs聚类为一支，而与细菌的PMIs进化关系远。表达ChlPMI的Micro-Tom细胞可在6g/L的甘露糖的筛选下正常生长并诱导出愈伤组织、分化出苗，转化率平均为3.9％。基于此ChlPMI/Mannose体系，在Beta品种番茄中共表达ChlPM1和CaMV35S驱动的BBBB基因串，获得了不含抗生素抗性选择标记基因的产虾青素番茄PMI-BBBB，其植株呈棕红色，叶片中可合成42.3μg/g FW的虾青素。表明ChlPMI可作为一种安全高效的选择标记基因应用于转基因番茄的培育，可为开发更易为公众接受的转基因作物提供有效工具，具有广阔的应用前景。　　R2R3-MYB型转录因子可能调控植物类胡萝卜素的合成。据小球藻虾青素合成与调控分析，筛选出该藻可能参与调控类胡萝卜素合成的2个R2R3-MYB型转录因子（CzMYB1和CzMYB2），通过在番茄中分别过表达来探究其对类胡萝卜素合成的调控。CzMYB1转基因番茄叶片中叶绿素和叶黄素含量显著上升，但植株表现出矮化、晚花现象。CzMYB2转基因番茄叶片呈黄绿色，产淡红色的无籽果实，定

关键词： 猪   早期胚胎发育   胚胎干细胞   多能性  

摘要： 目前已经有很多关于猪多能性干细胞的报道,但尚未获得有效的培养体系可以支持干细胞长时间稳定传代并实现生殖嵌合。胚胎质量和培养体系对胚胎干细胞的成功构建都具有重要意义。早期胚胎发育需要核心转录因子和相关信号通路共同发挥作用,而胚胎干细胞建立的过程相当于在体外添加化合物和细胞因子维持内细胞团(Inner Cell Mass,ICM)的多能性并提供营养物质维持其生长和增殖的过程。因此,本研究根据各阶段胚胎测序数据筛选出调控ICM发育相关通路的激活剂,再通过在猪早期胚胎体外培养液和胚胎干细胞培养液中添加该类小分子,最终确定其对猪早期胚胎质量和胚胎干细胞多能性的影响,主要结果如下:1.通过对不同发育时期猪体内胚胎转录组数据进行分析并富集信号通路,结果表明:ICM形成过程中,WNT信号通路、cAMP信号通路、PI3K-AKT信号通路、MAPK信号通路和JAK-STAT信号通路等参与调控ICM形成。在猪孤雌胚胎培养过程中分别添加富集到信号通路的小分子,筛选到CHIR99021和rpIL6可以促进囊胚发育。2.组合添加1μM CHIR99021和10 ng/mL rpIL6验证其对孤雌囊胚质量的作用。结果表明:囊胚率(49.23±8.40%v.s.32.34±4.15%,P<0.05)、囊胚孵化率(16.19±1.96%v.s.10.25±1.12%,P<0.05)、ICM细胞数(7.72±2.30 v.s.4.28±1.60,P<0.01)提高,多能性基因OCT4(P<0.01)、SOX2(P<0.01)和NANOG(P<0.05)以及使WNT通路和JAK-STAT通路相关基因也上调表达。此外,此体系显著提高胚胎干细胞建系效率(KOFL体系:34.70±4.77%v.s.25.12±2.10%,P<0.05;LCDMIV体系:37.82±2.56%v.s.25.26±3.18%,P<0.01)。3.用体外受精胚胎验证组合添加1μM CHIR99021和10 ng/mL rpIL6的作用。结果表明此体系可以提高体外受精胚胎囊胚率(28.47±2.16%v.s.19.65±4.02%,P<0.05)、ICM细胞数(6.60±1.50 v.s.4.50±0.89,P<0.01)、囊胚孵化率(12.03±1.73%v.s.7.27±0.79%,P<0.05),及OCT4(P<0.01)、SOX2(P<0.05)和NANOG(P<0.01)的表达。4.基于KOFL体系筛选提高细胞多能性的胚胎干细胞培养体系。结果表明:LCDM体系和添加rpIL6的LCDM体系都可以支持猪多能性干细胞维持,提高多能性基因OCT4、SOX2和REX1的表达;在KOFL体系基础上添加SB431542、CHIR99021和Forskolin可以提高单细胞传代能力,细胞增殖能力和多能性基因OCT4、SOX2和KLF4的表达。5.用细胞转化筛选的体系进行从头建系并进行再次优化。结果表明:pPSCs-LCDMIV支持单细胞传代,多能性基因OCT4(P<0.05)、SOX2(P<0.01)和NANOG(P<0.01)相对于pPSCs-KOFL的表达更高,细胞可传15代以上;pEPSC体系可以利用巴马品种的猪体内胚胎构建的胚胎干细胞系,细胞可以长时间稳定传代并维持较高的多能性,且具有分化为三胚层的能力;KOFL体系基础上添加SB431542、CHIR99021和Forskolin,维持高hLIF浓度并撤除bFGF组成LSCFors体系或者维持高bFGF浓度并降低hLIF浓度组成F-LSCFors体系,两个体系均可支持从头建系,多能性基因SOX2、NANOG和KLF4表达升高,但OCT4激活受限,细胞多能性部分提高。6.通过转录组数据筛选pPSCS-LSCFors和pPSCS-F-LSCFors中表达的信号通路,结果表明:LSCFors体系中cAMP信号通路、PI3K-AKT信号通路、JAKSTAT信号通路和MAPK信号通路等上调表达,F-LSCFors体系中cAMP信号通路、PI3K-AKT信号通路、JAK-STAT信号通路和WNT信号通路等上调表达,参与调控细胞多能性。以上结果表明,WNT信号通路、JAK-STAT信号通路、cAMP信号通路和PI3K-AKT信号通路等对于猪早期胚胎发育和胚胎干细胞多能性具有重要的调控作用。猪早期胚胎体外培养过程中激活WNT信号通路和JAK-STAT信号通路可以促进囊胚形成并提高囊胚质量。在猪胚胎干细胞培养过程中,添加细胞因子或化合物激活cAMP信号通路、PI3K-AKT信号通路、JAK-STAT信号通路和WNT信号通路等对胚胎干细胞多能性的提高和细胞增殖具有重要的意义。本研究优化了猪早期胚胎和猪胚胎干细胞的培养体系,有利于获得更多优质胚胎及多能性提高的

关键词： PM   PTEN/TLR4/NF-κB   炎性损伤   肺泡上皮细胞   胚胎干细胞  

摘要： 目的流行病学调查发现妊娠期PM2.5暴露与子代肺功能损伤及哮喘的发生相关,本课题组前期动物实验也发现孕期PM2.5暴露引起仔鼠肺功能降低,肺组织炎性因子渗出增加的病理表现,但具体的分子机制不清楚。本研究利用大鼠肺上皮细胞及人胚胎干细胞向肺祖细胞诱导分化体系,研究细颗粒物(particulate matter,PM)暴露对其影响及导致其炎性损伤的可能致病机制。方法1.建立大鼠肺泡上皮细胞(RLE-6TN)PM暴露模型,PM暴露剂量分别为50、100、200、400ug/ml,观察细胞形态变化,并利用CCK8法检测不同浓度PM暴露后细胞的增殖变化。2.检测PM暴露后肺泡上皮细胞的IL-1β的mRNA表达水平。3.检测PTEN/TLR4/NF-κB通路在PM暴露致肺上皮细胞炎性损伤中的作用机制:采用实时荧光定量PCR法及免疫印迹法检测PTEN、TLR4、NF-κB表达水平;使用NF-κB通路抑制剂bms-345541抑制NF-κB激活后,采用实时荧光定量PCR法检测炎性因子IL-1β表达水平的变化。4.建立人胚胎干细胞诱导分化至肺祖细胞阶段的体外模型,并进行阶段性PM暴露:在DAY0-DAY3诱导至限定性内胚层阶段的暴露浓度为5、50、100ug/ml,采用流式细胞术检测限定性内胚层的分化指标c-kit及CXCR4的表达水平,并采用免疫印迹法检测NF-κB的表达水平;在DAY10-DAY15分化为肺祖细胞阶段的暴露浓度为5、50ug/ml,采用免疫印迹法检测肺祖细胞的分化指标TTF1的表达水平。结果1.大鼠肺上皮细胞PM暴露后,100、200、400ug/ml浓度组细胞形态均发生改变,随着暴露浓度升高,细胞形态由团簇状、铺路石样变为细胞皱缩、细胞间隙增宽、形态不规则、细胞表面被PM颗粒覆盖;PM浓度越高,形态变化越大,高浓度组且有细胞死亡;与对照组相比,各浓度PM处理组RLE-6TN增殖能力均降低,且随着PM作用浓度的升高,RLE-6TN细胞的增殖呈下降趋势。2.实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,大鼠肺上皮细胞中炎性因子IL-1βmRNA表达水平随着PM暴露浓度升高而上升,在100、200及400ug/ml组明显升高(P<0.01)。3.实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,大鼠肺上皮细胞中TLR4、PTEN、NF-κB mRNA表达水平随着PM浓度升高呈下降趋势,蛋白免疫印迹检测结果显示,与对照组相比,TLR4蛋白水平在50ug/ml浓度明显升高(P<0.01),PTEN蛋白水平在100、200、400ug/ml明显下降(P<0.05),P-NF-κB/NF-κB水平随着PM暴露浓度升高而上升,200ug/ml组升高明显(P<0.001);加入NF-KB通路活化抑制剂后,与暴露(PM+DMSO)组相比,IL-1βmRNA表达水平明显下降(P<0.05)。4.胚胎干细胞(hESCs)诱导至限定性内胚层阶段PM暴露72小时后,流式细胞术检测结果显示c-kit表达水平均下降(P<0.05),CXCR4表达水平则无明显差异;蛋白免疫印迹检测结果显示,与对照组相比,P-NF-κB/NF-κB蛋白表达水平随着PM暴露浓度升高而升高;在DAY10至DAY15分化为肺祖细胞阶段进行PM暴露后,蛋白免疫印迹结果显示,各组细胞均有表达TTF1,各浓度组间无明显差异。结论***暴露后可能通过降低大鼠肺上皮细胞的增殖能力从而引起肺损伤。***暴露可能通过PTEN/TLR4/NF-κB通路的激活,诱发肺泡上皮细胞炎性损伤,启动肺部炎症的发生从而引起肺损伤。3.利用体外hESCs诱导分化模型,提示PM早期暴露可能通过NF-κB通路影响限定性内胚层的分化效率,从而对人类胚胎早期发育产生影响。