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关键词： miR-26b   胚胎干细胞   多能性   分化  

摘要： 目的研究miR-26b对小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,m ESCs)多能性及其分化的调控作用。方法1.实时荧光定量PCR检测miR-26簇前体在m ESCs和小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEF)中的表达。2.实时荧光定量PCR检测胚状体(embryoid body,EB)形成过程中成熟miR-26b的表达,并且比较miR-26b在m ESCs与MEF中的表达。***-8方法检测miR-26b对m ESCs增殖能力的影响。4.流式细胞术测定miR-26b对m ESCs细胞周期与凋亡的影响。5.使用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色试剂盒检测miR-26b对m ESCs中碱性磷酸酶活性的影响。6.实时荧光定量PCR检测miR-26b对m ESCs中多能性转录因子(Oct4、Sox2和Nanog)m RNA表达的影响。7.使用蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测miR-26b对m ESCs中三个关键转录因子的蛋白表达影响。8.用体外模型观察转染pc DNA-pre-miR-26b对m ESCs细胞群落形态的影响。9.实时荧光定量PCR检测miR-26b对视黄酸(retinoic acid,RA)诱导以及激活素A(activin A,AA)诱导m ESCs的胚层标志物表达的影响。10.免疫荧光法检测在m ESCs分化过程中,miR-26b对中胚层和内胚层标志物(α-SMA和GATA4)的影响。11.实时荧光定量PCR检测miR-26b前体在三个胚层衍生的典型组织器官中的表达情况。结果1.m ESCs中,miR-26b的前体在miR-26簇群表达最高。MEF中所有miR-26前体均上调,其中pre-miR-26b上调幅度最大(上调约10倍)。2.成熟的miR-26b在EB形成过程中从第2天到第6天明显上调,并且成熟miR-26b在MEF中的表达水平明显高于其在m ESCs中的表达水平。***-26b的过表达抑制m ESCs增殖,并显示miR-26b过表达诱导m ESCs于细胞周期的G1期阻滞,miR-26b不影响m ESCs的凋亡。***染色结果表明miR-26b导致m ESCs中ALP活性降低。5.过表达miR-26b导致m ESCs中多能性标志物(Oct4、Sox2和Nanog)的表达水平降低。6.体外模型研究miR-26b对m ESCs分化的影响,在miR-26b诱导的第4天观察到了分化的细胞,m ESCs的细胞集落开始变平并从细胞群落边缘分离。随后,大多数细胞群落失去了典型的单型形态,形成了具有不同形态的三维结构。***处理增加了外胚层标记物Nestin的表达。在miR-26b过表达的情况下,该诱导被抑制。与此相反,miR-26b促进AA诱导的中、内胚层标记物的表达,包括α-SMA和GATA4。***-26b的过表达使m ESCs细胞群落中存在α-SMA阳性细胞,这些细胞6天后约占细胞总数的50%。miR-26b也能显著诱导GATA4。***-26b前体在主要由中胚层和内胚层衍生而来的器官中高表达,尤其是肠、胃和肝脏,在脑和脊髓等外胚层衍生组织中表达相对较低。结论本研究证实miR-26b是miR-26家族调控m ESCs分化的潜在关键成员。miR-26b抑制m ESCs的多能性及自我更新,并且miR-26b可以促进m ESCs向中内胚层分化。

关键词： 再生医学   胚胎干细胞   琥珀酸脱氢酶   线粒体   代谢学  

摘要： 具有多种分化潜能和无限增殖能力的胚胎干细胞(ESCs)一直是再生医学领域的重要研究模型。相比于分化完全的成体细胞，胚胎干细胞的线粒体呈现一种不成熟的状态，其有氧呼吸更弱，而更依赖糖酵解为增殖活动提供生物合成原料以及三磷酸腺苷(ATP)，这一特性有助于其多能性的维持并适用于其快速的增殖活动。小鼠胚胎干细胞(mESCs)主要有两种培养条件，含血清和Lif的SL培养基和无血清但添加GSK3β和MEK/ERK抑制剂的2iL培养基。然而，在这两种培养条件下的细胞仍有其局限性:SL条件下的细胞异质性较高，多能性不稳定;尽管用2iL条件能获得多能性更高、均一性更好的细胞群体，但是长期培养于2il条件会引发DNA去甲基化以及基因组不稳定等问题。线粒体代谢在多种细胞命运决定中发挥重要作用，在本研究中，我们首先发现激活线粒体氧化磷酸化代谢不利于小鼠胚胎干细胞多能性维持，进一步，利用多种线粒体代谢抑制剂处理SL细胞，结果显示，抑制琥珀酸脱氢酶(SDH)可在SL条件下显著提高小鼠胚胎干细胞的多能性，有趣的是在2iL条件下抑制SDH则能提高样品的DNA甲基化和基因组稳定性。以上研究为我们展示了线粒体代谢在小鼠胚胎干细胞中新的重要作用，提出了一种新的调控胚胎干细胞特性的思路，在后续的研究中我们将深入探究其分子机制。

关键词： 胚胎干细胞(hESC)   间充质干细胞(MSC)   T淋巴细胞   调节性T细胞(Treg)   明胶(gelatin)   透明质酸(Hyaluronic acid,HA)   胶原蛋白(collagen)   纤连蛋白(fibronectin)  

摘要： 间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell,MSC)除了具有其干细胞特性以外还具有免疫调节特性而成为颇具临床应用价值的治疗性细胞。胚胎干细胞(Human Embryonic Stem Cell,hESC)是一种在体外可无限增殖的亚全能细胞,具有分化成各种体细胞的潜力,因此如果胚胎干细胞能分化成间充质干细胞则该细胞(hESCMSC)将是一种可再生的MSC,而且由于来源相同,hESC-MSC品质高度均一,可望成为质量完全可控的新型MSC产品以用于临床治疗。尽管目前hESC-MSC分化方案多种多样,但是分化效率相差较大,特别是其免疫调节的特性目前仍存在争议。hESC-MSC分化可使用生物基质材料替代细胞饲养层维持人类胚胎干细胞存活并辅助诱导分化,避免了动物源基质细胞对临床研究造成困难。生物基质材料具有无毒、无病原体、生物相容性良好等优势,是诱导hESC-MSC的理想媒介和微环境。不同包被材料通过识别细胞表面受体信号,在培养过程中对hESC-MSC迁移、增殖、分化等具有重要的意义,但对T淋巴细胞免疫调节特性影响鲜见报道。为此我们首先建立了一个简易、高效的hESC-MSC分化方案,并针对该hESC-MSC的免疫调节特性进行了探索,结果表明该hESC-MSC比脐带间充质干细胞(UC-MSC)具有更强烈的对T淋巴细胞增殖的抑制和促进Treg分化的免疫调节功能,提示hESC-MSC可成为更有效的细胞制剂运用于治疗免疫相关的病症。我们进而又在已建立的hESC-MSC分化方案基础上通过改变四种包被材料(明胶/胶原蛋白/透明质酸/纤连蛋白)制备出符合间充质干细胞定义标准的hESC-MSCs,并对这四种来源hESCMSCs的免疫调节特性进行了深入研究。结果表明,透明质酸和明胶两种基质包被分化的hESC-MSC对T淋巴细胞增殖的抑制和促进Treg分化的免疫调节功能优于其他包被材料,并且更强于脐带间充质干细胞(UC-MSC)。本研究证实了明胶、透明质酸两种包被材料分化的hESC-MSCs具有更强免疫调节潜力,有望成为临床免疫治疗种子细胞的首选;两种包被材料是影响hESC-MSC免疫调控能力至关重要的环节,为今后免疫试验研究中细胞培养材料的选择提供了数据支持,并在组织工程和生物医学领域中具有很大的应用价值。

关键词： 绿藻   杜氏盐藻   藏红花酸   玉米黄素裂解酶   基因工程  

摘要： 藏红花酸有极高的保健和药用价值。由于天然藏红花酸的产量极其有限,故此利用合成生物学手段进行藏红花酸的异源转化具有广泛的应用前景。杜氏盐藻是一种无细胞壁的单细胞真核绿藻,生长速度快,培养方法简便,遗传转化稳定,特别是其胞内藏红花酸的前体分子——β-胡萝卜素含量可高达细胞干重10%,为目前所有已知微藻中含量最高。然而在杜氏盐藻的类胡萝卜素代谢途径中,缺失以β-胡萝卜素为底物催化生成藏红花酸的关键酶:玉米黄素裂解酶(ZCD)。本研究拟通过高产β-胡萝卜素的杜氏盐藻,利用基因工程在杜氏盐藻中表达来自藏红花的ZCD外源基因(CSZCD),以期通过合成生物学手段在杜氏盐藻中构建藏红花酸的合成途径,获得具有藏红花酸合成能力的转基因杜氏盐藻工程株。具体研究结果如下:1.利用改良后的培养基,通过光照强度、培养温度、各组份配比等优化,确立杜氏盐藻的最优生长曲线;2.基于pCAMBIA3301载体为骨架,成功构建杜氏盐藻的重组表达载体pCAMBI3301-CSZCD,并通过玻璃珠转化法将重组质粒导入盐藻细胞;3.通过草铵膦抗性平板筛选,利用PCR技术和基因测序技术对转化藻株进行分子水平检测,鉴定获得能够稳定遗传外源基因CSZCD的盐藻转化藻株,4.通过高效液相色谱比较分析野生型与转化藻株中藏红花酸含量变化,并利用LC-MS分析杜氏盐藻转化株藏红花酸的相关化合物,初步验证转CSZCD基因的杜氏盐藻能合成藏红花酸相关化合物。本研究成功构建杜氏盐藻的遗传表达载体,获得具有稳定表达外源CSZCD基因的杜氏盐藻转化株。通过HPLC和LC-MS分析后,发现CSZCD基因在杜氏盐藻中的成功表达能实现藏红花酸相关化合物的合成,为后续通过基因工程手段从杜氏盐藻中合成藏红花酸奠定技术基础。

关键词： 小鼠胚胎干细胞   自我更新   Tfcp2l1   β-TrCP1   MK2  

摘要： 胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)由于其特性,即在分化为其他不同类型细胞的同时还能保持自己不断更新的状态而成为科学家们重点关注的对象。目前关于胚胎干细胞的研究中最多的是小鼠胚胎干细胞(mouse ESCs,mESCs),我们先前研究表明CP2家族转录因子Tfcp2l1(Transcription factor CP2-like protein 1)是mESCs维持自我更新的一个重要基因。Tfcp2l1是自我更新相关信号通路LIF/STAT3、Wnt/β-catenin以及FGF/MEK/ERK的共同靶点。Tfcp2l1转录本的上调能够代替细胞因子LIF或Wnt/β-catenin信号激动剂和FGF/MEK/ERK通路的抑制剂(CHIR99021和PD0325901,即2I)介导的自我更新促进作用。更重要的是,与LIF/STAT3信号通路的其他靶基因相比,只有下调Tfcp2l1才有可能削弱LIF介导的自我更新作用。此外,Tfcp2l1能够将小鼠外胚层干细胞(mouse Epiblast Stem Cells,mEpiSCs)重编程回到mESCs状态。因此,Tfcp2l1已成为维持和诱导胚胎干细胞多能性的核心分子。到目前为止,许多与Tfcp2l1相关的效应因子已经被鉴定出来,如Tfcp2l1与MTA1蛋白相互作用抑制分化细胞的出现,同时刺激Esrrb的表达以实现LIF非依赖性的mESCs自我更新。但关于Tfcp2l1蛋白稳定性调控的确切机制尚不清楚,在这里我们发现了一种精确控制Tfcp2l1蛋白稳定性的新机制。根据人蛋白质参考数据库(http://***/)预测,Tfcp2l1可能与β-TrCP1(β-transducin repeat containing protein 1)具有相互作用,因为β-TrCP1是泛素连接酶,所以为了验证该预测,我们首先用蛋白酶体抑制剂MG-132处理细胞,结果显示处理过的细胞中Tfcp2l1蛋白的稳定性提高,这表明Tfcp2l1确实是通过泛素化—蛋白酶体途径降解的。为了进一步探究β-TrCP1对Tfcp2l1的调节作用,我们分别从过表达和敲低两个方面检测Tfcp2l1的蛋白量变化。结果显示,β-TrCP1基因的上调不影响Tfcp2l1的转录水平,但会降低Tfcp2l1蛋白水平,而β-TrCP1表达下调后Tfcp2l1的蛋白水平则显著增加,转录水平不变。由于β-TrCP2和β-TrCP1都是泛素连接酶E3的关键成分,因此,我们检测了β-TrCP2对Tfcp2l1的调控作用,β-TrCP2对Tfcp2l1蛋白的调控弱于β-TrCP1。以上结果表明Tfcp2l1蛋白的稳定性主要由β-TrCP1控制。在确定了β-TrCP对Tfcp2l1的调节作用后,我们接下来从蛋白水平进行检测两者是否具有直接的相互作用。首先我们准备了两株都过表达了带有FLAG标签的Tfcp2l1基因的细胞,同时这两株细胞再分别过表达带有HA标签的β-TrCP1和β-TrCP2,免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)和蛋白免疫印迹实验表明它们之间确实存在直接的相互作用。接着我们将β-TrCP1在Tfcp2l1蛋白上的保守结合位点(DSGDNS)突变为(DAGDNA),再转入细胞,同样的进行了免疫共沉淀实验,结果显示Tfcp211突变体结合β-TrCP1的强度弱于野生型Tfcp2l1。基于泛素化检测实验,我们发现在分别过表达野生型和突变型的Tfcp2l1细胞中,增强β-TrCP1的活性泛素化野生型Tfcp2l1蛋白要强于Tfcp2l1突变体,说明β-TrCP1通过泛素化将Tfcp2l1蛋白降解,同时免疫荧光的实验显示β-TrCP1对Tfcp211蛋白的修饰主要发生在细胞质中。β-TrCP1结合Tfcp2l1蛋白保守基序(DSGDNS)里的丝氨酸接着必须事先被磷酸化,根据http://***/网站预测的结果,我们发现激酶MK2(MAP kinase-activated protein kinase 2)涉及这一过程。为了明确Tfcp2l1的稳定性是否受MK2控制,我们进行了三个实验。第一,通过过表达HA标记的MK2,我们发现MK2基因的过表达导致了Tfcp2l1蛋白水平的降低。第二,通过添加MK2抑制剂,我们发现Tfcp2l1蛋白水平逐渐增加。第三,通过将MK2转录本敲低,我们观察到MK2的下调导致了Tfcp2l1蛋白在mESCs中积累。这些结果表明MK2是Tfcp2l1蛋白的一种新的负调控因子。为了验证MK2是否直接调控Tfcp2l1,我们同样进行了免疫共沉淀技术探究MK2激酶对β-TrCP1和Tfcp2l1之间关系的影响,我们准备了两株同样过

关键词： 干细胞分化   Eed   复合物   BAF  

摘要： 文章简介BAF(Brg or Brahma-associated factors)染色质重塑复合物利用其ATP酶亚基水解ATP产生的能量改变组蛋白和DNA的作用,调控转录因子同DNA的结合而调节基因的表达,参与多种生物学过程。BAF复合物由多至15个不同的亚基组成,但对这些亚基功能的研究多局限于显示失活特定亚基而导致的表型缺陷,缺乏深入的作用机制的研究。

关键词： 基因工程   教学改革   前沿进展   科研思维  

摘要： 基因工程是一门以分子生物学、生物化学和遗传学等多个学科为基础的课程。它是一门理论与实验并重的课程、是国内外高校生物学本科生的必修课。基因工程课程相比其它学科基础课程更加偏重于培养学生的科学思维和在科研工作中独立发现问题及解决问题的能力,基因工程技术发展非常快,随时都有新技术和新方法涌现,因此基因工程理论课程应当增加对当前生命科学前沿研究进展的授课内容。同时改变基因工程实验课的设置方式,以连续实验的方式让学生了解基因工程技术在科研中的运用,从而带领学生了解最新的科研进展、帮助学生建立系统连贯的科研思路,满足高校生物学专业复合型人才的培养要求。

关键词： 合成生物学   伦理   责任伦理   责任  

摘要： 合成生物学是新兴生物科学技术中具有重大潜力的一个分支领域。它旨在通过重新设计和改造现有的生物系统,或者从头设计与构建新的生物部件、装置和系统,进一步加深我们对自然和生命本质的理解,在此基础上,生产和发展出有利于人类美好生活的生物技术产品。合成生物学在生物能源与生物医药等领域具有良好的应用前景和应用价值,因此受到科学技术界和企业界的广泛重视。然而,由于合成生物学涉及对生物系统和生物体的操作,因而存在着潜在的风险与伦理问题。正因如此,合成生物学自诞生起,就引起学界对其伦理问题的极大的关注。合成生物学的伦理研究,就是为了在追问合成生物学的伦理问题及其产生的语境的基础上,探讨如何规范和促进合成生物学的负责任发展。基于这一背景,文章将责任伦理学作为探讨合成生物学的基本理论框架。首先,文章在对合成生物学的学科内涵及其哲学思想进行概述的基础之上,追问合成生物学为什么会产生伦理问题。借助于“构物致知”与“构以致用”这两种技术研究范式,分析了合成生物学的主要特征,讨论了合成生物学集科学、技术与工程一体化的学科特点。其次,通过对汉斯·尤纳斯(Hans Jonas)和汉斯·伦克(Hans Lenk)的相关责任伦理思想进行概括与分析,从“责任”这一核心概念出发,构建了合成生物学的责任伦理研究框架,围绕责任伦理可以为合成生物学研究带来怎样的启示,为什么要开展合成生物学的负责任创新等问题展开讨论。第三,深入合成生物学的伦理问题,针对合成生物学两类不同的伦理问题,即概念性与非概念性的伦理问题,区分不同的责任类型。文章将概念性的伦理问题与合成生物学的“叙事”和“隐喻”相结合,指出对合成生物学的伦理担忧与关于合成生物学的不同叙事视角和叙事方式,比如“隐喻”的运用相关。而这些伦理担忧和争议实际上主要是一种对未来风险的“推测”和“预设”。合成生物学的非概念性伦理问题,包括安全性、风险与机遇的公平分配等,与其他技术伦理学问题相比,并不是全新的问题。因此,有必要根据其不同的伦理类型有针对性地开展责任伦理的研究。第四,根据合成生物学责任伦理研究的理论框架,要求以前瞻性的责任视角看待合成生物学的发展,因此对合成生物学未来发展方向的预测和展望离不开相关的技术评估。除了考虑风险评估外,对一些概念性的伦理争议还应当借鉴远景评估的模式。在此基础上,对于合成生物学实践当中的责任问题,有必要将合成生物学的伦理监管及其责任体系结合在一起加以分析,依据不同的责任主体,尝试提出合成生物学伦理监管的责任体系,就相关责任归属问题进行了探讨。最后,基于我国合成生物学伦理监管的相关法规与条例,提出了合成生物学研发行为的基本伦理原则和伦理规范,针对合成生物学研发人员提出了相应的社会责任和行动规范建议。讨论如何在责任伦理的指导下促进我国合成生物学研发的健康、可持续发展。

关键词： 沙门氏菌   基因工程   甲硫氨酸酶   骨肉瘤  

摘要： 目的 研究携带甲硫氨酸酶基因的减毒沙门氏菌VNP20009-M对骨肉瘤的治疗作用及其机制.方法 将重组沙门氏菌VNP20009-M与骨肉瘤细胞MNNG-HOS共培养;骨肉瘤细胞MNNG-HOS、U2OS及SaoS-2均高表达甲硫氨酸酶基因后探索细胞增殖、迁移及凋亡能力的变化;构建MNNG-HOS裸鼠皮下荷瘤模型,评价不同剂量的VNP20009-M在动物模型中的治疗效果.结果 通过质粒PCR验证甲硫氨酸酶基因只存在于目的菌株VNP20009-M中,且具有较高的甲硫氨酸酶活性,重组沙门氏菌构建成功.VNP20009-M显著诱导骨肉瘤细胞MNNG-HOS的凋亡.相比对照组,甲硫氨酸酶基因过表达的骨肉瘤细胞增殖、迁移能力被显著抑制.VNP20009-M治疗后小鼠皮下肿瘤生长被显著抑制.结论 VNP20009-M可诱导骨肉瘤细胞凋亡并抑制癌细胞增殖和迁移,可以作为一种新型高效的药物为临床提供新的治疗方式.

关键词： 胰高血糖素样肽-2   基因工程   优化后表达参数   生物活性  

摘要： 胰高血糖素样肽-2（Glucagon-like peptide-2,GLP-2）是胰高血糖素原的衍生肽,其主要功能是促进肠道绒毛生长、刺激肠道隐窝内细胞增殖分化。目前临床上用于治疗一些肠道炎症性疾病,例如短肠综合征、肠炎性腹泻等。此外,在畜牧业中,GLP-2对家畜肠道疾病也有一定的预防效果。GLP-2血浆半衰期很短,在人体内大概只有7 min,这是因为体内二肽激酶（dipeptidyl peptidase IV,DPP-4）能够识别并水解GLP-2第二位的丙氨酸氨基末端,若将第二位丙氨酸用甘氨酸替换则可以抵抗DPP-4酶水解,延长药物半衰期。虽然GLP-2有着广泛的应用前景,但是从自然资源中获得GLP-2的活性损失大、得率低且过程繁琐,化学合成工艺复杂且纯度难以保证,两种方法均难应用于GLP-2工厂化大量生产。如何快速、较低成本、便捷的生产出有活性的GLP-2是本课题拟解决的问题。本实验利用基因工程技术表达出定点诱变的猪源性GLP-2,用甘氨酸取代GLP-2氨基末端第二位丙氨酸后,再根据大肠杆菌的偏好性对GLP-2序列进行优化,并在目标肽序列N端添加肠激酶识别位点,合成基因序列。通过Kpn I和Xho I双酶切位点连接到pET-40b（+）构建原核重组表达载体pET-40b（+）-GLP-2,重组质粒转化进大肠杆菌BL21菌株,诱导表达重组蛋白。优化后表达参数为:菌液OD600为0.6时,用0.2 mmol/L IPTG,37℃,诱导培养5 h;最终得到GLP-2重组蛋白表达量较高的基因工程菌株。通过镍离子亲和层析柱纯化以及分梯度洗脱获得纯度较高的GLP-2重组蛋白,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定其为目的蛋白。在体外,通过检测GLP-2重组蛋白对IPEC-j2细胞的增殖以及对该细胞下游因子mRNA表达量的影响,证实其体外活性;在体内,通过GLP-2重组蛋白对KM小鼠体重变化的影响、对肠道下游因子mRNA表达量的影响以及对LPS诱发小鼠肠道炎症的预防效果等,证明了重组蛋白在生物体内的活性。本实验为GLP-2功能性研究以及在工厂化的生产应用奠定了基础。