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关键词： 胚胎干细胞   Dusp9   CRISPR-Cas9   多能性  

摘要： 小鼠胚胎干细胞(Mouse Embryonic Stem Cells,m ESCs)来源于着床前囊胚的内细胞团,具有无限自我更新能力。自1981年Martin Evans等人利用饲养层细胞和血清体系第一次建立了m ESCs细胞系,关于m ESCs体外培养体系的研究越来越受到人们关注。2008年Ying等人在化学成分明确的培养基中添加MEK抑制剂PD0325901和GSK3抑制剂CHIR99021(2i),与白血病抑制因子(LIF)组成了2i/LIF培养体系,就可以使m ESCs处于na?ve状态。2018年,Bao等人通过在化学成分明确的培养基中添加了Activin A、BMP4、CHIR99021和LIF四种因子组成了ABC/L培养体系,并成功利用该体系建立了干细胞系Advanced Stem Cells(ASCs)。通过比较ASCs和m ESCs的转录组数据后发现,Dusp9在ASCs中的表达显著上调,这一现象引起了我们的注意。基于这一发现,我们利用CRISPR-Cas9系统构建了Dusp9敲除的ASCs细胞系,并对该细胞系的多能性、DNA甲基化及发育潜能进行鉴定。进一步,我们通过实时荧光定量PCR、免疫荧光染色分别检测了Dusp9敲除ASCs细胞中DNA甲基化和糖脂代谢相关的基因和蛋白表达变化。结果如下:1.成功建立Dusp9敲除胚胎干细胞系首先我们利用连接有Dusp9-sg RNA的PX-459载体,通过脂质体将重组载体转染到ASCs细胞中,通过PCR产物测序、实时荧光定量PCR和WB等方法验证并成功获得了Dusp9敲除ASCs细胞系。***9敲除胚胎干细胞系的转录组结果分析转录组分析结果表明,Dusp9基因敲除影响胚胎干细胞的多能性维持基因和其它相关调控基因的表达。从GSEA分析结果发现,Dusp9高表达组和低表达组之间m TOR和脂肪酸代谢等信号通路也存在显著差异。最后,利用实时荧光定量PCR技术检测了Dusp9敲除细胞系中糖代谢和脂代谢相关基因的表达变化情况。***9敲除胚胎干细胞的多能性、DNA甲基化及发育潜能研究首先通过AP染色、实时荧光定量PCR和免疫荧光染色等方法检测Dusp9敲除胚胎干细胞的多能性,结果表明Dusp9敲除胚胎干细胞系具有干细胞多能性特征,仍表达Oct4和Sox2多能性特异蛋白。其次,在m RNA和蛋白水平上分别验证了Dusp9缺失导致Dnmt3B表达下降的现象。同时,体外分化实验显示,Dusp9敲除细胞系的三胚层标记基因的表达水平显著高于对照组,说明具有更高的三胚层分化潜力。更重要的嵌合体实验结果表明,Dusp9敲除细胞可以贡献到着床后胎儿和卵黄囊组织中,证明Dusp9敲除胚胎干细胞系具有多能性。综上所述,我们利用CRISPR-Cas9技术成功获得了Dusp9敲除的ASCs细胞系,Dusp9的缺失会影响胚胎干细胞的DNA甲基化和糖脂代谢等相关基因表达水平。进一步实验证明Dusp9敲除胚胎干细胞系具有干细胞多能性,能够贡献到着床后的胎儿及卵黄囊。

关键词： 人胚胎干细胞来源的外泌体   心力衰竭   血管生成  

摘要： 背景:心力衰竭是各种心脏疾病的终末阶段,随着世界人口老龄化,心力衰竭已经成为严重的公共卫生问题。高血压目前被认为是导致心力衰竭的主要原因之一,持续的高血压可导致心脏发生一系列病理变化,包括心肌细胞肥大、心脏组织纤维化等,最终发生心力衰竭。在心力衰竭的发生发展中,血管新生对维持心功能起重要作用。人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)具有很强的分化能力,目前已经被认为在修复心脏损伤方面极具潜能。然而,人胚胎干细胞应用仍存在许多问题,例如引发机体免疫反应、移植存活率低等,导致其临床应用受限。既往研究发现,干细胞对心脏的修复作用主要源于旁分泌机制。人胚胎干细胞来源的外泌体(hESCs derivedexosomes,hESC-exo)作为干细胞主要的分泌性囊泡,可通过携带的microRNA和蛋白质等发挥生物效应。目前,外泌体已经成为治疗心力衰竭极具前景的研究方向之一。第一部分 人胚胎干细胞的培养、鉴定以及外泌体的提取、鉴定和蛋白质谱分析第一节 人胚胎干细胞的培养和鉴定目的:对H9人胚胎干细胞进行培养并确定细胞状态。方法:配置完全的Essential 8培养基,使用Vitronectin蛋白包被细胞培养器材,对H9人胚胎干细胞进行传代培养,采用电子显微经观察细胞形态并进行碱性磷酸酶染色(alkaline phosphatase,ALP)鉴定培养结果。结果:培养的人胚胎干细胞生长良好,ALP染色证实干细胞处于未分化状态。结论:人胚胎干细胞使用Essential 8联合Vitronectin蛋白培养系统培养效果良好,能保持干细胞的未分化状态。第二节 人胚胎干细胞外泌体的提取、鉴定和蛋白质谱分析目的:从人胚胎干细胞培养基中抽提外泌体并进行鉴定,使用蛋白质谱分析及Western Blot明确外泌体含有的蛋白成分。方法:采用超速离心法从细胞培养上清中提取外泌体(exosome)。使用纳米流式技术(nano flow cytometry,NanoFCM)对外泌体进行粒径检测;投射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)观察外泌体的大小及形态;Western Blot 鉴定外泌体标记分子CD9及Alix。对提取的外泌体进行蛋白质谱分析并采用Western Blot验证。结果:1.人胚胎干细胞培养基抽提的外泌体直径范围在50-125nm,平均直径66.66nm,直径中位数61.75nm,大小相对均一;电镜下显示具有特征性的外泌体球形结构;Western Blot检测到外泌体标记分子CD9+,Alix+。2.蛋白质谱分析结果显示外泌体富含多种蛋白质,其中低分子量成纤维细胞生长因子 2(fibroblastgrowth factor2,FGF2)位于蛋白质含量的前 10 位,Western Blot证实外泌体内所含FGF2分子量为18kDa。结论:使用超速离心法可有效从人胚胎干细胞培养基中抽提出分泌性囊泡,经电镜、纳米流式技术及Western Blot检测,证实为外泌体。对外泌体进行蛋白成分分析显示外泌体内富含低分子量FGF2。第二部分 hESC-exo通过FGF2促进血管内皮细胞体外形成血管样结构目的:明确hESC-exo对血管内皮细胞的作用及调控机制方法:选取人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)为研究对象,使用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染48小时抑制HUVECs 成纤维细胞生长因子 2 受体(fibroblastgrowthfactor2 receptor,FGF2R)的表达。将HUVECs分为对照组、FGF2处理组、exosome处理组及FGF2R siRNA+exosome 处理组。FGF2 处理组加入 FGF2(10ng/ml);exosome 处理组及 FGF2R siRNA+exosome处理组加入hESC-exo(1×109)。分别培养6小时,检测各组内皮细胞的小管形成能力。结果:1.使用FGF2R siRNA干扰后,FGF2R相对表达量下降约60%(1.00±0.14 VS 0.30±0.10,P<0.01)2.与对照组相比,FGF2处理组及exosome处理组内皮细胞的成管长度增加约1倍(0.92±0.08 VS 2.18±0.18,P<0.01;0.92±0.08 VS 1.83±0.06,P<0.01)。3.抑制FGF2R的表达后,外泌体诱导内皮细胞的成管长度的下降近50%(1.83±0.06VS 1.05±0.17,P<0.01)。结论:hESC-exo通过含有的FGF2增强内皮细胞体外形成血管样结构的能力第三部分 hESC-

关键词： 膀胱癌   无创诊断   尿液沉淀   CNA   低覆盖全基因组测序  

摘要： 研究背景膀胱癌是全球第九大常见癌症,且在近年来发病率呈现升高趋势,即使是非浸润型的膀胱癌其复发率仍可高达30%,并且随着病程的进展,五年生存率甚至不足50%。恶性肿瘤细胞通常存在基因组不稳定性,并表现为整个染色体或片段的拷贝数扩增或缺失,并可能因此改变正常体细胞,增加其增值、侵袭、转移的能力,向恶性肿瘤细胞转化。这样的染色体非整倍性改变的现象被称为拷贝数变异(CNA,copy number aberrations)。膀胱癌的基因组表现出强烈的基因组不稳定性特征,存在极强的突变负荷和影响多种染色体的广泛的拷贝数变异,这使其成为了探索诊断新方法的明显目标。研究目的探索构建一种利用二代测序技术,进行低覆盖全基因组测序,检测膀胱癌尿液沉淀中DNA拷贝数变异的方法。探讨其在膀胱癌术前进行无创诊断和术后肿瘤进展监控中的意义。研究方法利用0.1～0.3×低覆盖度二代测序技术对样本提取DNA进行测序,检测膀胱癌尿液和血液样本DNA的染色体拷贝数变异情况,并结合临床信息进行分析。本研究研究主要分为三部分:收集54例膀胱癌,11例膀胱良性肿瘤,以及43例正常人的中段晨尿沉淀样本,利用低覆盖全基因组测序并分析三组样本尿沉淀DNA拷贝数变异检出情况,探讨该测序和分析方法的可行性;对比了 12例膀胱癌患者尿沉淀DNA与血浆cfDNA的拷贝数变异情况,探讨该方法用于两种不同体液检测材料时的差异;对比了治疗前和治疗后随访中膀胱癌患者尿沉淀DNA拷贝数变异的变化,探讨该方法是否可用于检测膀胱癌的进展情况。研究结果通过低覆盖度的全基因组测序法,对膀胱癌、膀胱良性肿瘤、正常对照三组的尿液沉淀DNA进行测序,发现膀胱癌组检出CNA的样本数比例明显高于另外两组(P<0.005)。而在膀胱癌组中,高级别组比低级别、良性组肿瘤检测到更高比例数的CNA(P<0.005)。该测序方法敏感性高,可检测到最小0.15Mb的微重复微缺失改变。膀胱癌尿沉淀DNA拷贝数变异,重复区域主要在1q、5p、6p、7p、8q、13q号染色体臂;缺失区域主要在2q、8p、9q、9p,以及11p号染色体臂的部分区域。分析发现高频率出现拷贝重复区域涉及,如STK3、COX6C、SPAG1、CDKAL1等;以及高频率缺失区域内涉及C9orf53、CDKN2A、CDKN2B、MIR31、IFNA1等膀胱癌肿瘤基因相关通路的基因。通过对比膀胱癌尿沉淀DNA与血浆cfDNA的结果,以及膀胱癌在治疗前后尿液沉淀中的DNA拷贝数改变结果,推测利用低覆盖测序技术检测膀胱癌尿液沉淀除或可用于诊断和监控膀胱癌的病情进展。结论利用低覆盖全基因组测序可以用于检测尿沉淀DNA拷贝数变异情况,此方法为以后用于膀胱癌术前无创诊断的研发提供了新的思路,后续将进一步在大样本量中进行进一步验证和方法的改进。

关键词： 脐带间充质干细胞   CRISPR/Cas9技术   永生化   外泌体   MYC-AS1  

摘要： 人脐带间充质干细胞(UCMSC)是一种具有多向分化潜能的多能干细胞,在组织修复和某些疾病治疗的临床应用上发挥重要作用。UCMSCs的传代次数有限,超过8代后UCMSCs的活力、分化能力均明显下降,随着传代次数的增加,细胞衰老失去其生物学特性,不便进行基因编辑。SV40 LT是来自猿猴病毒SV40的一个功能蛋白,又称SV40大T抗原。SV40 LT基因通常被随机插入基因组,用于构建永生化细胞系。构建一个永生化脐带间充质干细胞系显然对其功能研究、基因编辑及其临床应用研究具有重要意义。长非编码RNA(lncRNA)是一类缺少开放阅读框,拥有更少外显子的长度大于200 nt的非编码RNA。反义RNA是与正义链上的转录产物部分或完全互补的RNA,通过碱基互补配对特定的RNA来发挥封闭、抑制靶基因表达的功能。本实验室新近鉴定的MYC基因的长非编码反义RNAMYC-AS1可以抑制原癌基因MYC的表达,具有显著的抑癌作用。本研究利用CRISPR/Cas9技术在AAVS1基因第一外显子插入具有PGK启动子和SV40-polyA的SV40 LT基因,使MSC细胞达到永生化。并利用慢病毒构建一个具有抑癌作用的反义长非编码RNA MYC-AS1转基因的间充质干细胞系,从该细胞系的培养液中分离提取外泌体。通过处理肝癌细胞HepG2,研究表达MYC-AS1的外泌体对HepG2表型的影响,为MSC及其外泌体的基础研究和临床应用研究提供依据。主要研究结果如下:1、建立SV40 LT基因敲入的脐带间充质干细胞系本研究通过CRISPR/Cas9技术介导的同源重组将具有PGK启动子和SV40-polyA的SV40 LT基因整合到AAVS1基因的第一外显子上,使MSC达到永生化。首先,针对AAVS1基因第一外显子设计并筛选出高编辑效率的gRNA位点,构建出AAVS1-Cas9-sgRNA和同源重组质粒AAVS1-Neo-SV40。通过共转染、G418筛选和鉴定等步骤,最后得到SV40 LT基因定点敲入的MSC细胞系。结果表明,与野生型MSC相比,永生化MSC-SV40 LT细胞增殖显著加快,其定向分化特性并未改变,β-半乳糖苷酶染色显示MSC-SV40 LT细胞不发生衰老,可在体外稳定传代超过40代。其增殖能力增强,但裸鼠成瘤实验未发现其具有成瘤性。2、MSC细胞永生化对MSC细胞基因表达谱的影响为了解MSC细胞永生化对其基因表达谱的影响,我们对MSC和MSC-SV40LT细胞进行了转录组测序。结果显示,SV40 LT基因敲入后,在MSC和MSC-SV40 LT细胞之间共筛选到3088个差异基因。与MSC相比,MSC-SV40 LT细胞中上调基因1675个,下调基因1413个。GO富集结果可以看出,差异基因主要富集在细胞周期、细胞黏附、细胞分裂、DNA修复、细胞外基质组织等生物学过程中。KEGG分析说明差异基因主要富集在PI3K-AKt信号、癌症、线粒体、人乳头瘤病毒感染、细胞因子受体互作、细胞衰老、细胞周期、细胞自噬等通路。从这些差异基因中分别随机挑选3个基因和3个肿瘤相关基因FOS、SET和MYC进行验证,RT-qPCR结果与测序结果一致。肝癌HepG2细胞的3个肿瘤相关基因表达水平显著高于野生型MSC细胞和永生化MSC细胞,MSC-SV40LT细胞的增殖变快可能与这些肿瘤相关基因的表达量升高相关,但在MSC-SV40 LT细胞中这些基因上调的差异不显著,结合裸鼠体内不成瘤的结果,初步认为永生化细胞是安全的。3、MYC-AS1转基因间充质干细胞外泌体对肿瘤细胞HepG2表型的影响本研究利用慢病毒系统在永生化细胞系的基础上构建一个具有抑癌作用的反义长非编码RNAMYC-AS1转基因的间充质干细胞系,分别用细胞迁移、细胞增殖和细胞凋亡试验来观察这些MYC-AS1转基因的外泌体对肿瘤细胞HepG2表型的影响。结果显示,成功构建MYC-AS1转基因的间充质干细胞系,并在其外泌体中检测出高水平的MYC-AS1基因表达,外泌体MYC-AS1能显著抑制HepG2细胞的迁移和增殖能力,并促进细胞凋亡。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas9技术定点敲入SV40 LT基因,成功构建永生化UCMSCs细胞系,并利用慢病毒系统构建MYC-AS1转基因细胞系。研究发现该转基因细胞系的外泌体具有高水平的MYC-AS1,对肝癌细胞HepG2具有明显的抑制作用。本研究结果对hMSC及其外泌体的基础研究和临床应用研究均具有重要指导意义。

关键词： 衣康酸   解脂耶氏酵母   柠檬酸   发酵   乙酸  

摘要： 衣康酸是一种应用前景广阔的平台化学品,是高分子材料、涂料、药物合成等领域重要的化工原料。目前,衣康酸的生产以土曲霉发酵为主。然而,土曲霉作为发酵生产菌株存在许多缺陷,例如营养要求高、发酵周期长等,增加了衣康酸发酵生产的成本。基因工程及代谢工程的发展,为构建基因工程菌解决上述缺陷奠定了基础。底盘菌株的选择对于基因工程菌的构建影响较大,解脂耶氏酵母具有低pH值耐受性良好、生长速度快、底物适应能力强等特点,且代谢过程中柠檬酸的合成旺盛,为衣康酸合成途径的构建提供了良好的基础,是极具开发潜力的衣康酸生产底盘菌株。本研究以解脂耶氏酵母为底盘菌株,通过表达土曲霉顺乌头酸脱羧酶基因CADA,在解脂耶氏酵母体内构建了衣康酸的代谢途径,以葡萄糖作为底物,衣康酸的产量达到50 mg/L。针对于衣康酸产量较低的问题,进一步表达乌头酸酶基因ACO及线粒体羧酸转运蛋白基因MTT,强化顺乌头酸的跨膜供应,衣康酸的产量达到330 mg/L,提高了约6.7倍。为了避免糖酵解过程中柠檬酸的反馈抑制,选用乙酸替换葡萄糖作为碳源,并通过过表达乙酰辅酶A合成酶基因ACS、柠檬酸合成酶基因CAS、以及线粒体羧酸转运蛋白基因MTT,使工程菌中衣康酸前体物-柠檬酸的产量达到11.77 g/L,实现了解脂耶氏酵母利用乙酸代谢生产柠檬酸;在此基础上,与前述工作相结合,通过引入顺乌头酸脱羧酶基因CADA,最终衣康酸的产量达到1.2 g/L,较以葡萄糖为碳源的工程菌提高了 2.6倍。本研究通过构建乙酸利用菌株,证明了解脂耶氏酵母利用乙酸生产衣康酸途径的巨大潜力,为后续衣康酸基因工程菌构建工作奠定了工作的基础。

关键词： SHROOM3   神经管缺陷   胚胎干细胞   CRISPR-Cas9  

摘要： 神经管（neural tube）是发生中枢神经系统的始基,起源于胚体神经外胚层,在胚胎发育过程中,脊索诱导其背侧中线的神经外胚层形成神经板并发育成神经管。神经管缺陷（neural tube defects,NTDs）也被称作神经管畸形,在胚胎早期发育时,因神经管不能闭合或闭合不完整导致,是发病概率仅次于先天性心脏病的一种常见先天性畸形。NTDs的起因非常复杂,可能由受环境和遗传因素相互作用引起的。目前,临床上常通过在妊娠前和妊娠早期额外摄入适量叶酸有效降低NTDs发病（约70%）。但是有些NTDs单纯通过补充叶酸并不能有效的预防。当SHROOM3基因缺失发生神经管闭合不全时,无法单纯通过叶酸补偿来预防和治疗,甚至发现过多的叶酸补偿会导致胚胎的致死性增加。其内在机制由于缺乏合适的动物模型,该基因在人类NTDs发生过程中的作用及机理尚不清楚。非人灵长类与人类大脑在生理结构、发育的空间和时序性上有高度相似性,因此利用非人灵长类模拟人类NTDs,可以在在体外和体内共同探究其发病机制,有望为药物和干细胞移植临床前治疗的有效性和安全性研究提供重要的研究平台。为了探究SHROOM3基因突变如何影响灵长类神经管缺陷,我们开展了相关实验,主要研究内容和结果如下:1.利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建SHROOM3基因敲除食蟹猴胚胎及获得SHROOM3基因突变的食蟹猴胚胎干细胞（cynomolgus monkey embryonic stem cells,cmESC）。针对食蟹猴SHROOM3基因的5号外显子设计sgRNA,在胚胎水平验证打靶效率,选择工作效率最高的两个sgRNA和sp Cas9的mRNA共同注射到食蟹猴1-细胞期胚胎,获得SHROOM3基因突变的胚胎。确定可以获得SHROOM3基因突变的胚胎后,利用发育到囊胚的胚胎建立ES细胞系获得SHROOM3基因突变的cmESC。***3基因在体外神经分化过程中的表达时间窗口建立了体外神经上皮干分化体系,该过程设置了5个时间点来探究SHROOM3基因在整个发育过程中表达的时间窗口以及表达水平。实验结果表明,在胚胎干细胞时SHROOM3基因已经表达,且在体外神经分化过程中持续表达,Rosettes结构形成时期SHROOM3基因表达达到了较高水平。这些数据表明SHROOM3基因在神经系统发育过程中可能扮演着非常重要的角色,推测神经管闭合与SHROOM3基因具有重要的关系。3.研究正常及SHROOM3基因突变cmESC体外神经分化潜能在体外建立神经上皮干细胞分化体系基础上,将ES诱导成神经上皮干细胞（neuroepithelium stem cell,NESC）。通过免疫荧光染色、RT-PCR、Western blot以及q PCR等技术,在野生型（Wildtype,WT）和SHROOM3mut-ESC从胚胎干细胞体外分化过程中取ES,神经花环（Neural Rosettes,NRs）,微小类神经管结构（Neural tubes-like,NTs）以及后期NESC分化的细胞这些时间点进行检测,分析正常和突变细胞体外分化能力。发现SHROOM3促进ES细胞神经定向分化;SHROOM3基因缺失影响胚胎干细胞向外胚层分化的能力;SHROOM3基因缺失使神经上皮干细胞向神经元和胶质细胞分化能力增强,但是会使影响大脑可塑性的OTX2表达量降低。没有SHROOM3的情况下,Wnt信号传导没有受到明显阻断;SHROOM3基因突变可能会影响细胞生长速率、形态等。结论:SHROOM3基因在神经发育系统中可能扮演非常重要的角色。在体外,cmESC的SHROOM3基因突变会影响ESC在体外分化过程中的细胞生长速率、细胞形态,以及向外胚层分化的能力。SHROOM3基因突变可能会影响到神经分化的潜能,但并不通过直接阻断Wnt信号通路来影响神经管的闭合。SHROOM3基因突变导致猴神经管缺陷的具体分子机制仍有待进一步研究。

关键词： 蓝色菊花   飞燕草素   基因工程   蓝色基因  

摘要： 菊花(Chrysanthemum morifolium)为原产我国的菊科菊属植物。菊花作为中国十大传统名花以及世界四大切花之一,深受国内外消费者喜爱并具有较大市场,是观赏、经济及文化价值极高的花卉。菊花花色鲜艳丰富,但唯独缺乏蓝色,因为其天然缺乏类黄酮3′5′羟化酶活性,体内无法积累飞燕草色素苷。本研究以菊花‘南农粉翠’为宿主材料,将蓝色相关基因风铃草Cam F3′5′H、飞燕草Dg AA7GT、Dg AA7BG-GT1和Dg SCPL2与蝶豆花Ct A3′5′GT共转化获得转基因阳性植株。通过表型观察、分子鉴定、花色指标分析以及花色苷组分鉴定,最终获得紫色-紫罗兰色和蓝色转基因菊花。主要研究结果如下:1.通过合成方法克隆了风铃草CamF3′5′H、蝶豆花CtA3′5′GT以及飞燕草Dg AA7GT、Dg AA7BG-GT1和Dg SCPL2,分别构建了p ORE-R4-F3HP-Cam F3′5′H-F3HP-Ct A3′5′GT和p YLTAC380N-F3HP-Cam F3'5'H-MYB1P-Dg AA7BG-GT1-CCD4P-Dg SCPL2-RCHSA-Dg AA7GT-F3HP-Ct A3'5'GT两个植物表达载体。对菊花‘南农粉翠’进行遗传转化,一共获得了24个p ORE-R4-F3HP-Cam F3′5′H-F3HP-Ct A3′5′GT阳性株系和15个p YLTAC380N-F3HP-Cam F3'5'H-MYB1P-Dg AA7BG-GT1-CCD4P-Dg SCPL2-RCHSA-Dg AA7GT-F3HP-Ct A3'5'GT阳性株系。经表型观察以及分子鉴定,发现Cam-17和Cam-26两个阳性株系花色变化明显,Ct A3'5'GT和Cam F3'5'H在菊花中具有催化活性并能引起花色由粉色向紫色至紫罗兰色转变。表型观察及RT-PCR分析显示,Cam5G-43和Cam5G-48两个株系花色变化尤为明显,5个基因均成功在菊花花瓣中异源表达并能引起花色向蓝色转变。同时对实验室前期将蓝目菊Oh F3′5′H通过p ORE-R4-F3HP-Oh F3′5′H-F3HP-Ct A3′5′GT载体获得的转基因菊花进行表型观察及半定量分析,发现Oh-9-3和Oh-23-8株系花色变成蓝紫色,表明Oh F3′5′H基因可以使菊花积累蓝色花色素从而使花色变成蓝紫色。2.利用英国皇家园艺协会标准比色卡(RHSCC)以及色差仪对转基因菊花株系花色进行系统描述。结果表明Cam-17和Cam-26花色由粉色向紫色到紫罗兰色转变;Cam5G-43和Cam5G-48花色发生明显蓝化,由粉色向蓝色转变;Oh-9-3和Oh-23-8则转变为紫罗兰色。花色素定性分析表明,菊花‘南农粉翠’的色素类型主要为两种,分别为花青苷和黄酮色素,缺乏类胡萝卜素。利用超高效液相色谱-电喷雾离子化串联质谱联用技术(UPLC-ESI-MS)对野生型及转基因菊花舌状花中花青素苷成分进行定性分析,数据显示,野生型菊花中主要含2种花青苷成分,分别为A1、A2,其结构分别为Cy-3-O-(6″-丙二酰基)葡萄糖苷、Cy-3-O-(3″,6″-二丙二酰基)葡萄糖苷。p ORE-R4-F3HPCam F3′5′H-F3HP-Ct A3′5′GT、p ORE-R4-F3HP-Oh F3′5′H-F3HP-Ct A3′5′GT和p YLTAC380N-F3HP-Cam F3'5'H-MYB1P-Dg AA7BG-GT1-CCD4P-Dg SCPL2-RCHSA-Dg AA7GT-F3HP-Ct A3'5'GT转基因菊花中鉴定出5种相同花青苷成分,分别为A3、A4、A7、A8、A9,其结构分别为Cy-3-O-(6″-丙二酰基)葡萄糖苷-3′-O-葡萄糖苷、Cy-3-O-(3″,6″-二丙二酰基)葡萄糖苷-3′-O-葡萄糖苷、Dp-3,3′,5′-三-O-葡萄糖苷、Dp-3-O-(6″-丙二酰基)葡萄糖苷-3′,5′-二-O-葡萄糖苷和Dp-3-O-(3″,6″-二丙二酰基)葡萄糖苷-3′,5′-二-O-葡萄糖苷。这表明转基因菊花内源花色代谢路径发生改变,可大量积累飞燕草色素,从而使花色显示蓝紫色或蓝色。

关键词： flr-2耐氟基因   耐辐射奇球菌   基因工程菌   生物富集   铀  

摘要： 作为清洁的可再生能源,近年来核能得到了广泛的开发。而核能主要原料金属铀的开采逐渐增多,铀资源逐渐匮乏。铀是一种兼具化学毒性和放射毒性的重金属,因其半衰期长而对环境安全和人类健康构成潜在威胁。因此,加大对环境中铀的去除和回收刻不容缓。由于现如今多采用酸法浸铀采矿技术,酸性条件使得在浸出铀的同时,F-也被大量浸出。为达到使用活体微生物可持续治理含铀废水的目的,构建具有多重抗性的一体化基因工程菌,使其在富集铀的同时兼备多种离子抗性具有重要的现实意义。第二章:全基因合成flr-2耐氟基因,经PCR扩增,与双酶切后的线性载体p RADK无缝克隆,构建p RADK-flr-2重组载体。将p RADK-flr-2重组载体转入大肠杆菌Top10,通过双酶切、菌落PCR鉴定、基因测序及Blast比对,结果显示大肠杆菌Top10-flr-2克隆菌构建成功。第三章:为验证flr-2融合蛋白表达,以及探究细菌对铀的富集作用,构建大肠杆菌表达菌BL21-flr-2。Western blot检测、氨基酸比对以及BL21-flr-2于含F-培养基中的生长曲线均说明flr-2基因正常表达且BL21-flr-2表达菌具有较好的氟抗性。进行大肠杆菌表达菌BL21-flr-2的单因素铀富集实验,在p H 4、铀初始浓度20 mg L-1、菌液投加比为33.3%时富集反应180 min,BL21-flr-2对铀的富集率可达88%左右,平衡时单位铀富集量为31.88 mg g-1。通过SEM、EDS和FTIR对富集前后BL21-flr-2干菌体进行结构表征。结果显示,成功在BL21-flr-2表面富集了铀。磷酰基、羧基和羟基等活性官能团参与BL21-flr-2对铀的富集过程,同时可能存在生物大分子参与铀的富集过程。第四章:为解决活性微生物在铀废水治理过程中缺乏对复杂离子环境的抗性,构建含flr-2耐氟基因的Deino-flr-2耐辐射基因工程菌,使其兼备耐氟离子及对辐射、重金属环境的多重抗性。利用耐辐射奇球菌自身还原酶活性及菌体表面活性官能团对铀的富集作用,实现对模拟低浓度含铀废水的治理。通过对Deino-flr-2耐辐射基因工程菌中p RADK-flr-2重组质粒进行PCR鉴定、基因测序及BLAST比对,结果显示,Deino-flr-2耐辐射基因工程菌构建成功。进行Deino-flr-2耐辐射基因工程菌的单因素铀富集实验,在p H 5、铀初始浓度25 mg L-1、菌液投加比为33.3%时富集反应75 min,Deino-flr-2对铀的富集率可达90%左右,平衡时单位铀富集量为47.87 mg g-1。通过SEM、EDS和FTIR对富集前后Deino-flr-2干菌体进行结构表征,结果显示,成功在Deino-flr-2表面富集了铀。Deino-flr-2对铀的生物富集是一个结合被动和主动机制的复杂过程,其中包括快速的细胞表面生物吸附以及随后发生的酶介导的生物还原。

关键词： 小麦   胚乳   特异表达   基因工程   启动子  

摘要： 小麦(Triticum aestivum L.)是世界上主要的粮食作物,为全球35%的人口提供日常所需的蛋白质及热量。胚乳是小麦主要养分储存的器官,决定着籽粒的最终产量和营养价值。一直以来,小麦育种目标追求高产而忽略品质的提升,随着小麦基因组信息的不断完善和基因工程工具的逐步发展,通过生物工程技术改良小麦籽粒品质和营养成为可能。胚乳特异表达启动子具有驱动目的基因在胚乳中特异表达而不影响其它组织的潜力,是籽粒基因工程中的重要工具。然而,小麦由于其六倍体特性及遗传转化效率的限制,胚乳特异表达基因及启动子的鉴定和研究较少。本研究利用IWGSC已发表的六倍体小麦转录组数据(http://***/),从全基因组水平对小麦胚乳特异表达基因进行了筛选和注释,并分析了其启动子的序列特征,得到如下结论:1.共鉴定到316个在小麦灌浆期胚乳中特异表达的基因,验证了其中18个基因的表达模式;功能注释表明这些基因主要参与了贮藏蛋白的积累,防御和信号传导过程,其中贮藏蛋白编码基因共118个,防御相关基因共57个,信号传导相关基因共30个,且贮藏蛋白的累积是胚乳中高度特异的生理过程。2.胚乳发育早期,低分子量谷蛋白和清蛋白迅速累积,此时鉴定到参与糖信号传导的受体类胰岛素因子受体(IGF1R);灌浆中期,醇溶蛋白和球蛋白大量积累,此时谷氨酸和ABA信号传导较为活跃。3.贮藏蛋白、防御及信号传导基因启动子区均含光响应元件G-box和box-4及脱水反应元件DRE-core;不同的是,胚乳特异表达元件O2-site、GCN4＿motif和Prolamin-box在贮藏蛋白编码基因中显著富集,脱落酸响应元件ABRE在防御基因中显著富集,胚乳特异表达元件RY-element及赤霉素响应元件P-box和TATC-box在信号传导基因中显著富集。4.该研究为籽粒基因工程提供了20个可用于改善特定发育时期籽粒品质和营养的候选启动子,其中克隆得到的3个高表达水平的胚乳特异性启动子具有指导靶基因在胚乳发育特定阶段表达的潜力,为籽粒基因工程提供了重要参考。本研究通过挖掘小麦胚乳特异表达基因及其启动子,不仅加深了我们对小麦胚乳发育过程的理解,为剖析籽粒发育调控机制提供了关键信息;同时也为通过基因工程针对性地改良籽粒品质及营养组成奠定了重要基础。