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关键词： SUPT6H   人胚胎干细胞   自我更新   转录延伸   细胞凋亡  

摘要： 无限自我更新和多能性是人胚胎干细胞（humanembryonicstemcells，hESCs）的两个重要特性。研究hESC维持这些特性的机制，有利于推动它在基础研究和临床上的应用。　　hESC的自我更新受特定的基因表达网络调控。值得注意的是，越来越多的证据表明，除了基因的转录起始外，转录延伸也是调控基因表达的一个关键限速步骤。然而，转录延伸因子在维持hESC自我更新中的作用尚不完全清楚。SUPT6H是一个典型的转录延伸因子，它能够加速RNA聚合酶Ⅱ的转录延伸。我们的研究发现SUPT6H是hESC维持自我更新所必需的，敲低SUPT6H导致hESC分化和凋亡。机制上，SUPT6H通过结合在自我更新转录调控网络相关蛋白编码基因（如SOX2，NANOG，PRDM14和ZSCAN10）的genebody上以调控这些基因的转录延伸，并确保这些基因的正常表达，使hESC处于自我更新状态。与此同时，SUPT6H还结合在自我更新相关miR-103a-3p基因MIR103A2的genebody上，通过维持miR-103a-3p的正常表达来间接抑制分化相关基因PRKAB2的表达，从而抑制hESC发生分化。此外，SUPT6H还参与调控细胞中的R-Loop水平，进而调控hESC的基因组稳定性并维持hESC存活。　　值得注意的是，我们还发现SUPT6H与重要的自我更新调控因子PRDM14相互作用，这为我们理解SUPT6H如何特异性地结合到自我更新相关基因上进而促进这些基因的表达提供了重要线索。　　综上所述，我们的研究首次揭示了转录延伸因子SUPT6H在维持hESC自我更新中的重要作用，并揭示了SUPT6H通过调控自我更新相关基因的正常转录和基因组稳定性进而维持hESC的自我更新。此外，我们的研究发现了SUPT6H/miR-103a-3p/PRKAB2调控轴(axis)对hESC维持自我更新的重要作用，为阐明维持hESC自我更新的分子机制开拓了新的视野。

关键词： 甲状腺癌   甲状腺良性结节   二代测序   基因突变   基因融合  

摘要： 目的:甲状腺癌是一类多基因变异的疾病,多种基因变异参与甲状腺癌的发生和发展,其中最多见的变异类型是基因突变和融合。近年来随着高通量测序技术的普及,甲状腺癌的基因变异谱研究得到越来越多的关注。甲状腺良恶性结节的鉴别依赖基因变异谱的差异,但既往多针对DNA开展单基因检测,而利用高通量测序,结合DNA/RNA开展双测序的工作报道不多。本研究旨在应用二代测序和生物信息学方法探究甲状腺癌与良性结节的突变谱差异,在分子层面寻找能够辅助甲状腺良恶性结节鉴别的分子标志物。并且进一步通过对二代测序结果的统计,确定样本中是否有驱动基因突变和融合共变异的现象,并在细胞层面对共变异与单突变对肿瘤细胞生物学行为和通路激活的情况的影响是否不同进行探究。 方法:本研究收集了187例甲状腺结节组织和81例正常甲状腺组织纳入研究。通过B超对甲状腺结节进行Bethesda分级,细针穿刺活检样本和手术样本进一步分别进行细胞学检测和病理学检测,所有样本均进行基因突变和融合的检测。对测序得到的原始数据进行整理,统计发生突变的基因数,突变的类型,突变位点的分布,各基因在癌组织、可疑良性结节和正常组织的突变占比以及基因融合的发生频率,进一步分析各突变基因以及融合与甲状腺癌临床病理特征的相关性。对测序数据中的驱动基因突变和驱动基因融合同时共变异的样本进行临床病理特征分析,并分别构建不同变异载体,探究驱动基因突变和融合共变异对于甲状腺癌细胞生物学行为的影响以及通路激活的情况。 结果:1.共检出突变基因40个,主要包括驱动基因和DNA损伤修复基因等。甲状腺癌的基因变异特征与可疑良性结节存在明显差异,在癌组织中,BRAF（p<0.0001）,ZNF717（p=0.031）,TERT（p=0.049）,GGT1（p=0.008）,CHEK2（p=0.014）,OTUD4（p<0.0001）,RET蛋白激酶域（p=0.047）的突变占比和基因融合的发生频率（p=0.045）均显著高于可疑良性结节,而且RET蛋白激酶域突变（p=0.036）和GGT1（p=0.02）突变均与甲状腺癌淋巴结转移呈正相关。检出融合14例,包括CCDC6-RET、NCOA4-RET、ETV6-NTRK3和TPM3-NTRK1四种融合类型。甲状腺癌中常见的驱动基因BRAF或RAS突变和融合互斥,但在存在ATM基因突变的甲状腺癌中可共存,并与淋巴结转移显著相关。2.与单个BRAF或RAS突变相比,驱动基因共变异的甲状腺癌细胞中MAPK通路和PI3K/Akt通路的激活程度增强,增殖活性(BRAFV600E+***600E=96.43%±2.56%vs.46.61%±3.20%,p<0.0001;BRAFV600E+ETV6-NTRK3 ***600E=97.23%±1.98%vs.46.61%±3.20%,p<0.0001;KRASG12R+TPM3-NTRK1 ***12R=94.30%±3.70%vs.64.83%±3.67%,p=0.0013;KRASG12R+ETV6-NTRK3 ***12R=94.10%±3.54%vs.64.83%±3.67%,p=0.0012)和凋亡水平(BRAFV600E+TPM3-NTRK1 ***600E=20.93%±0.81%vs.6.29%±0.47%,p<0.0001;BRAFV600E+ETV6-NTRK3 ***600E=12.03%±0.2%vs.6.29%±0.47%,p<0.0001;KRASG12R+TPM3-NTRK1 ***12R=9.7%±0.47%vs.3.36%±0.3%,p<0.0001;KRASG12R+ETV6-NTRK3 ***12R=6.1%±0.05%vs.3.36%±0.3%,p=0.0002)明显升高,侵袭性增强。当敲低ATM后驱动基因共变异的甲状腺癌细胞的凋亡比例减少(BRAFV600E+TPM3-NTRK1 ***600E+TPM3-NTRK1+si ATM=20.93%±0.81%vs.1.02%±0.05%,p<0.0001;BRAFV600E+ETV6-NTRK3 ***600E+ETV6-NTRK3+si ATM=12.03%±0.2%vs.1.57%±0.04%,p<0.0001;***600E+si ATM=6.29%±0.47%vs.3.96%±0.06%,p=0.0005;KRASG12R+TPM3-NTRK1 ***12R+TPM3-NTRK1+si ATM=9.7%±0.47%vs.0.8%±0.04%,p<0.0001;KRASG12R+ETV6-NT

关键词： 胞外域   抗体   真核表达   细胞悬浮培养   酶联免疫吸附试验  

摘要： CD19特异性嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T cell,CART)在急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia,ALL)的临床试验中取得了非常好的结果,显著改善了临床对于血液系统肿瘤的治疗方法。尽管CAR-CD19细胞疗法取得了巨大的成功,但约30%的患者发生了复发,研究表明在CAR-CD19复发病人B细胞表面CD19抗原存在明显的下调甚至直接转变为阴性,这可能是使用细胞疗法治疗后发生免疫逃逸的根本原因。近几年来,许多研究对于B细胞发生免疫逃逸的原因做了进一步阐述,其中复发原因包括可变剪接,系谱转换,双等位基因移码突变和内含子保留等一系列的复发机制。所以寻找新的靶点或者双靶点联合疗法对于ALL后期临床治疗具有重要意义。CD22主要表达于正常成熟B细胞表面和来源于B细胞的肿瘤细胞表面,主要抑制B细胞抗原受体(B cell antigen receptor,BCR)。CD22在复发病人的B细胞表面仍然可以被检测到,其可以作为治疗CART-CD19复发患者非常有前景的靶点。一些CD22相关的单克隆抗体药物也成功上市,用于治疗源于B细胞的淋巴细胞白血病。目前,噬菌体抗体库技术已经成为获得人源化高亲和力抗体的重要途径,被广泛应用到医学和生物领域。可通过体外或者体外反复多轮的淘选、富集、洗脱,快速筛选获得具有亲和力的基因工程抗体。为进一步开发针对CART-CD19复发以及CD22作为靶点疾病的细胞治疗产品或者抗体药物,本研究利用噬菌体抗体库筛选技术,从商业化人源化噬菌体抗体库Domain Antibody Library和Tomlinson I Library中筛选到两个具有高亲和力的基因工程抗体(一个为单域抗体(single domain antibody,sd Ab),一个为单链抗体(single chain variable fragment,sc Fv)。本研究主要结果如下:1.构建了CD22胞外域(CD22 extracellular domain,CD22ECD)表达质粒,通过瞬时转染HEK293FT悬浮细胞大量表达CD22胞外域蛋白,并通过亲和层析,离子交换层析和分子筛获得了高纯度且糖基化修饰完整的CD22胞外域蛋白。同时还筛选得到一株能够稳定表达CD22全长的293细胞株。2.使用商业化人源化噬菌体抗体库Domain Antibody Library和Tomlinson I Library,经过表达全长CD22 293细胞水平的一轮淘选,和三轮链霉亲和素-生物素磁珠固相淘选,分别获得了针对CD22靶点的单域抗体次级库和单链抗体次级库。对这两个淘选富集的抗体库采用酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immune Sorbent Assay,ELISA)进行单个克隆的筛选,分别获得一个具有较好亲和力的抗体片段。对这两个克隆进行测序和抗体序列分析,并通过ELISA实验初步测定了两个抗体的亲和能力。

关键词： 基因工程   生物制药   前景  

摘要： 随着经济社会的发展,生物制药领域开始引入基因工程技术,使用基因工程技术对自身进行改造和发展.本文从生物制药领域中的基因操作技术分析概念入手,进行以基因工程为基础的其中几类药物类型的分析,从而了解基因工程生物制药所面临的机遇以及需要解决的问题,从而使其得到更好的发展.

关键词： 淀粉酶产色链霉菌   ε-聚赖氨酸   RT-PCR   基因工程   5L补料分批发酵  

摘要： ε-聚赖氨酸(ε-poly-l-lysine,ε-PL)是一种安全性高、抑菌谱广的食品防腐剂,已广泛用于食品、医学和生物材料等领域。我国于2014年4月批准了ε-聚赖氨酸作为食品添加剂新品种。天然生物防腐剂ε-聚赖氨酸具有广阔应用前景,但目前聚赖氨酸发酵水平较低,生产成本较高,限制了其进一步的开发和应用,迫切需要提高发酵水平、降低生产成本和销售价格。本实验室前期以一株淀粉酶产色链霉菌Streptomyces diastatochromogenes TUST作为出发菌株,通过对其进行一系列诱变获得了菌株Streptomyces diastatochromogenes 6#-7,但其ε-聚赖氨酸高产机制还尚不清楚。因此本论文基于上述两株聚赖氨酸产生菌的转录组学数据出发,利用分子生物学手段考察了赖氨酸脱羧酶基因cadA及脂肪酸ACP合酶基因fabF对ε-聚赖氨酸产量的影响。主要研究结果如下:(1)本论文利用接合转移的方法成功构建了四株基因工程淀粉酶产色链霉菌,并通过RT-qPCR验证、亚甲基蓝初筛、摇瓶复筛等方法验证,得到ε-聚赖氨酸产量优异的基因工程菌株。(2)本论文对四种基因工程菌株与其出发菌株分别进行发酵罐发酵,结果表明:与出发菌株相比,基因改造工程菌株的菌体生长曲线与出发菌株相似,但其ε-聚赖氨酸产量各有不同,其中基因工程菌株***ΔcadA较其出发菌株*** TUST的ε-PL产量提高了13.0%。***ΔfabF1、***ΔfabF2、***ΔfabF3较其出发菌株*** 6#-7的ε-PL产量分别提高了27.2%、24.4%、31.0%。5L发酵罐补料分批发酵结果表明淀粉酶产色链霉菌聚赖氨酸生物合成代谢途径中,缺失赖氨酸降解途径中赖氨酸脱羧酶基因cadA及脂肪酸合成途径中脂肪酸ACP合酶基因fabF均可以提高淀粉酶产色链霉菌中ε-PL的产量。(3)为了验证脂肪酸ACP合酶基因fabF对ε-PL产量的具体影响,对基因改造菌株ΔfabF1、ΔfabF2、ΔfabF3及其出发菌株6#-7进行一系列验证。首先利用扫描电子显微镜观察菌丝形态,发现敲除fabF基因后菌丝较出发菌株干瘪,孢子较塌陷。其次检测脂肪酸合酶活性发现,敲除菌株ΔfabF酶活明显下降。最后,利用GC-MS检测脂肪酸含量,发现改造后的菌株ΔfabF中饱和脂肪酸含量减少,这是由于敲除了脂肪酸合酶,使脂肪酸代谢减弱,减少了乙酰辅酶A消耗,进而使TCA循环增强,能量供给二氨基庚二酸合成途径。然而,不饱和脂肪酸的比例在改造菌株中大大提高,这导致了基因改造菌株细胞膜的流动性增强,有利于物质运输和能量代谢,增加胞外产物聚赖氨酸运输量。这两方面导致了改造菌株中ε-PL产量增高。(4)最后,利用RT-qPCR验证与ε-PL合成相关代谢途径中关键基因转录水平,结果表明工程菌株ΔfabF3中在TCA循环及二氨基庚二酸途径中关键酶基因表达量均提高,且ε-PL合成酶表达量上调了2.02倍,可将其逐级放大发酵,用于工业生产ε-PL。

关键词： 科研素养   基因工程   课程教学   教学改革  

摘要： 基因工程是分子生物学、遗传学等学科的重要技术手段。同时,基因工程也是生命科学领域相关专业的一门理论与实验并重的核心课程。通过基因工程课程学习,可以有效地培养学生的科研兴趣,训练学生的科研思维,提升学生的科研能力。通过阐述科研素质的基本内涵,分析了基因工程课程教学中培育学生科研素质的重要性,从优化教学内容、完善实践教学体系以及创新教学方法等方面对基因工程课程教学改革提出具体建议,通过课程改革实践促进学生科研素质的不断提升。

关键词： 单倍体胚胎干细胞   单倍体性维持   二倍体化   动物模型  

摘要： 后基因组（功能基因组）时代，基因功能研究成为一大重点。单倍体细胞，如酵母，是研究基因功能的重要工具。然而，长久以来无法建立哺乳动物的单倍体细胞系。最近，结合胚胎干细胞技术及流式分选技术，科学家从小鼠、大鼠、猴子和人的单倍体胚胎中建立了单倍体胚胎干细胞系。单倍体胚胎干细胞在细胞和个体水平是研究基因功能的有效工具，然而，其单倍体性却不稳定。单倍体细胞在培养过程中会逐渐二倍体化，形成正常的二倍体细胞。需要通过定期的流式分选富集单倍体细胞的策略来稳定维持单倍体的特性。研究发现，二倍体化的原因非常复杂，与细胞周期、细胞凋亡、表观遗传、代谢等方面都存在联系。通过小分子筛选、遗传筛选以及机制研究发现了能促进单倍体特性稳定的小分子和基因。然而，遗憾的是，任何一种稳定细胞单倍体特性的方法均无法永久维持单倍体胚胎干细胞的单倍体特性，仍然需要定期的流式分选富集单倍体细胞来维持单倍体特性。　　本研究在探讨单倍体自发二倍体化机制时，意外建立了一株能稳定维持单倍体超过半年的小鼠单倍体胚胎干细胞系。以此为契机，我们对这株单倍体的特性、基因表达水平和基因组进行深入研究，发现这株单倍体细胞具有更快的生长速度，存在多区域的拷贝数变异等因素引起的一些基因表达水平的显著改变。因此推测，该细胞系增殖能力的增强减弱了二倍体细胞的生长竞争优势，一定程度上稳定了单倍体特性。同时，对差异基因进行分析后，我们选择了12个与细胞周期或分裂增殖相关的基因进行组合敲除，发现其中11个基因同时编辑的细胞系能够更稳定地维持其单倍体特性。　　由于流式分选技术过程不仅需要昂贵的设备和相对复杂的技术，而且使用的Hoechst33342核染料对细胞有毒性，另外，分选过程中激光电压等因素会给细胞带来潜在的物理损伤。因此，本论文的第二部分研究旨在探索建立更为简单的维持单倍体特性的方法，从而避免使用流式分选技术。　　首先我们结合单倍体细胞与二倍体细胞大小的差异，开发了通过过滤富集并稳定维持单倍体的新方法。该方法成本低、操作简便、且获得的细胞活性高。同时，我们还利用该策略结合基因编辑技术产生大片段缺失的单倍体细胞系，进而通过卵子注射获得了小鼠模型。　　在第二个富集单倍体细胞的策略中，我们设计方案在培养过程中直接对二倍体化的细胞实现精准杀伤。为此，本研究结合单倍体细胞与二倍体细胞核物质含量的差异，巧妙地利用蛋白剪切系统与毒素拆分系统结合Cre-lox2272介导的翻转系统，设计了二倍体化后存在两套遗传物质才有可能开启自杀开关的二倍体细胞自杀系统。该方法可以直接在常规的培养传代过程中通过定期加入外源小分子对二倍体细胞实现高效杀伤，从而长期稳定维持细胞的单倍体特性。　　综上所述，本研究探讨了单倍体细胞二倍体化的机制并建立了简单的富集单倍体细胞的新策略，为单倍体干细胞技术的应用奠定了重要的基础。

关键词： 胚胎干细胞   超潜能干细胞   染色质可及性   MAFK  

摘要： 胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)是从早期胚胎内细胞团(Inner Cell Mass,ICM)中分离的一类干细胞,可在体外进行长期且稳定的培养。ESCs具有向胚内所有谱系发育的能力,但是其对胚胎外谱系发育的贡献十分有限。最近,一种新型干细胞——超潜能干细胞(Extended Pluripotent Stem Cells,EPSCs)的成功获得打破了这一壁垒。EPSCs可以通过ESCs的体外诱导获得,并可在体外长期培养。体内嵌合实验表明EPSCs既具有向胚内谱系发育的潜能又具有向胚胎外谱系发育的能力。体外培养来源的EPSCs可以产生囊胚样结构,这为我们理解早期胚胎的发生提供了一个独特的体外模型。 目前,关于EPSCs和ESCs之间表观遗传特征的差异鲜有报道。此外,是否存在维持EPSCs命运身份的表观因子仍然未知。鉴于此,本研究利用ATAC-seq来探究EPSCs和ESCs之间染色质开放程度的差异。我们的实验结果表明,ESCs比EPSCs具有更多的染色质可及性区域;与ESCs相比,EPSCs染色质高开放区域显著富集了MAFK(Musculoaponeurotic Fibrosarcoma,protein K)的Motif序列。此外,通过将ESCs与EPSCs的表达谱进行比较,我们发现Mafk在EPSCs中显著高表达。已有的研究发现Mafk在发育至7.5 dpc的小鼠胚胎的胚内中胚层及胚外中胚层(尿囊、羊膜和卵黄囊)表达较为丰富,表明其可能对胚外谱系的发育具有独特的贡献能力。 为探究MAFK在EPSCs中的生物学功能,我们借助慢病毒sh RNA介导的基因干扰系统,在EPSCs中构建了两株Mafk敲降效果良好的细胞系。在此基础上,我们对Mafk敲降的EPSCs的克隆形态与多能性、细胞周期与细胞凋亡进行了比较分析,并结合RNA-seq实验进行了机制探索。我们发现敲降Mafk不影响EPSCs的克隆形态、多能性及细胞周期分布,但会促进EPSCs早期凋亡。RNA-seq分析结果表明,敲降Mafk后确实会上调细胞凋亡通路相关基因的表达。进一步分析发现,敲降Mafk后会扰乱EPSCs的基因表达谱。功能聚类分析表明,敲降Mafk显著上调的基因主要富集在细胞命运应答、形态发生相关的凋亡通路、Notch信号通路、以及与形态发生相关的发育生长通路上,这表明Mafk敲降的EPSCs可能处于一种更倾向于分化的状态;而显著下调的基因与线粒体能量代谢通路相关,如电子传递链、氧化磷酸化、线粒体组装等,这意味着Mafk可能对EPSCs的线粒体能量代谢具有重要的调控作用。 这些研究结果表明MAFK对维持EPSCs功能基因的正常表达及参与细胞凋亡调控中发挥着十分重要的作用。本研究为我们深入理解EPSCs在体外可以长期稳定维持的分子机理以及早期胚胎发育的分子机制提供了理论参考,同时也丰富了我们对小Maf蛋白家族成员MAFK的功能认知。

关键词： 衰老   胚胎干细胞   外泌体   细胞周期   细胞增殖   氧化应激  

摘要： 衰老是生物个体随时间流逝机体功能逐渐退化的过程。衰老细胞的累积是机体衰老的主要原因。随着人口老龄化的加剧，抗衰老研究引起了人们的极大关注。干细胞来源外泌体内含有诸多发挥修复功能的核酸和蛋白，从而逐渐用于疾病的治疗。本实验拟利用人胚胎干细胞外泌体探究抗衰老的机制。　　研究目的:干细胞来源的外泌体具有组织修复和再生能力、低免疫原性和无致瘤风险等优点，并已被逐渐应用于疾病治疗。本实验拟将胚胎干细胞外泌体用于衰老细胞的治疗，缓解衰老相关表型，探究胚胎干细胞外泌体对衰老的调控并阐明作用机制。　　实验方法:实验通过连续培养IMR-90细胞构建复制衰老的细胞模型，用衰老相关的分泌表型、细胞周期抑制因子以及β-半乳糖苷酶染色检测构建的复制衰老细胞模型。利用纯化鉴定的人胚胎干细胞外泌体处理复制衰老的IMR-90细胞，并通过检测细胞周期、Ki67增殖标志物评估衰老细胞是否增殖。通过检测细胞周期抑制因子、衰老相关异染色质凝集(SAHF)、端粒长度、衰老相关分泌表型(SASP)以及线粒体功能，评估外泌体对衰老细胞的作用。通过转录组分析寻找经外泌体处理后衰老细胞中差异基因的表达。构建p21-YFP标记细胞系，观察外泌体对衰老细胞增殖的作用。　　实验结果:胚胎干细胞外泌体干预后，衰老IMR-90细胞的增殖能力提高，细胞周期中处于S期的细胞数明显增加，增殖标志物Ki67明显增加，促进了衰老细胞的迁移能力。外泌体能够降低p21和p16的表达水平，下调衰老细胞中SAHF的数目，延长衰老细胞端粒长度。外泌体下调了SASP通路Mmp3、TGF-β、IL-1a和IL-6的表达水平，降低了衰老细胞线粒体的氧化应激，提高了衰老细胞线粒体数目。转录组数据分析表明外泌体能够促进细胞外基质的表达，下调SASP通路TGF-β的表达。　　结论:胚胎干细胞外泌体能够促进衰老细胞的增殖，降低细胞周期抑制因子和衰老相关分泌表型通路的衰老相关标志物，修复DNA损伤，恢复衰老细胞的线粒体功能。胚胎干细胞外泌体为抗衰老提供了潜在的应用价值。

关键词： 组蛋白去甲基化酶   KDM6家族   神经外胚层分化   胚胎干细胞   WNT/beta-catenin 信号通路  

摘要： 表观遗传是一种不改变基因组序列但可以引起染色体变化且稳定遗传的方式,包括DNA修饰(甲基化),组蛋白修饰(甲基化,乙酰化,泛素化等),染色质重构,组蛋白异变体,非编码RNA等。表观遗传调控影响着胚胎发育、细胞重编程等诸多生物学过程,但在人早期神经外胚层分化过程中的研究相对较少。本研究主要关注组蛋白甲基化修饰相关酶在神经外胚层分化过程中的作用,具体如下。首先设置浓度梯度优化小分子诱导的早期神经外胚层分化;对分化前后的细胞进行RNA-Seq转录组分析,发现组蛋白H3去甲基化酶KDM6B存在最显著的升高。接下来用CRISPR/Cas9技术构建KDM6家族蛋白KDM6A和KDM6B单基因的敲除以及双基因敲除人胚胎干细胞系(embryonic stem cell,ESCs)。对这些基因敲除细胞系进行早期神经外胚层分化,通过对比其分化效率和野生型(wild type,WT)ESCs分化效率的差异,发现基因敲除细胞系均比WT更容易向神经外胚层分化。同时将干细胞状态、分化第三天和分化第七天的双基因敲除细胞系以及WT细胞系进行RNA-Seq分析,其转录组差异也显示KDM6敲除的细胞能更快、更高效地向早期神经外胚层分化。其次通过KEGG分析,发现WNT/beta-catenin信号通路发生明显变化;进一步的蛋白检测显示,和WT相比,基因敲除细胞系中活化beta-catenin蛋白表达量下降,且在ESCs状态下,早期神经分化第3天和第5天WNT/beta-catenin信号通路中重要的活化基因WNT3和FZD5都有显著降低,这些数据都证明KDM6敲除可以导致WNT/beta-catenin信号通路活化被抑制。接下来,我们在早期神经分化过程中加入WNT/beta-catenin信号通路激动剂(CHIR99021)和抑制剂(IWR-1),发现CHIR99021可以抑制早期神经分化效率,而IWR-1则可提升早期神经分化效率。更重要的是,两者均可在一定程度上回补由于KDM6敲除所导致的神经外胚层分化效率提高的表型。然后我们构建了去甲基化酶酶活结构域Jmj C突变的以及野生型的鼠源Kdm6b表达入侵病毒,在人早期神经祖细胞分化过程中加入相应病毒并在第7天检测神经外胚层分化结果,发现酶活突变的Kdm6b不能回补KDM6敲除导致的表型,而野生型的Kdm6b可以回补表型,这说明KDM6家族基因缺失促进人早期神经分化这一表型依赖于去甲基化功能。最后在早期神经外胚层分化过程中加入KDM6的小分子抑制剂GSK J1,发现GSK J1可以有效促进人ESCs以及人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)向早期神经外胚层的分化。综上所述,我们发现KDM6家族可以通过WNT/beta-catenin信号通路抑制人早期神经外胚层分化,且和其去甲基化修饰酶活密切相关。最后KDM6抑制剂GSK J1可提高人早期神经分化,这将为退行性神经疾病提供可能的改善方案。