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关键词： 胚胎干细胞   类肝素   温敏性纳米复合物   神经分化  

摘要： 肝素(Heparin,HP)/硫酸乙酰肝素(Heparin Sulfate,HS)是结构最为复杂,功能最为广泛的糖胺聚糖,是一种线性聚合物,因为聚合物长链上具有大量磺酸基团,所以带有大量负电荷。HP/HS可以结合各种生物活性分子,进而调节生物体的生命活动。类肝素是模拟HP/HS结构的一种聚合物,带有大量磺酸基团,和HP/HS一样,类肝素同样可以与细胞外的成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)和细胞膜上的成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor,FGFR)结合形成三元复合物,促进胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)进行神经分化。在考虑到类肝素长链中的磺酸基团与FGF和FGFR的作用强度在不同条件下存在差异,形成类肝素-FGF-FGFR三元复合物的效率不同,影响ESCs的神经分化,我们设计一种纳米材料,以期改善形成三元复合物的效率,更加高效地促进ESCs定向分化为神经细胞。本课题采用单元重组策略利用可逆加成-断裂链转移(reversible addition-fragmentation chain transfer,RAFT)聚合法合成类肝素 聚合物 p(MAG-co-SPA)(pMS),并在类肝素pMS长链末端嵌段聚合一段聚(N-异丙基丙烯酰胺)(pNIPAAm)形成温敏性类肝素嵌段共聚物pNIPAAm-b-p(MAG-co-SPA)(pNMS),通过其后修饰获得的巯基末端与金纳米粒子(AuNPs)进行组装,制备具有温敏性的纳米复合物,探究温敏性纳米复合物对ESCs分化的影响。研究内容如下:(1)用2-(甲基丙烯酰胺基)葡萄糖(MAG)作为糖单元,3-磺丙基丙烯酸钾(SPA)作为磺酸单元,链转移剂和引发剂分别为4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸(CPADB)和偶氮二异丁腈(AIBN),通过RAFT聚合法来合成类肝素聚合物pMS。然后以pMS作为大分子链转移剂,NIPAAm作为单体,通过RAFT聚合法来合成温敏性类肝素嵌段共聚物pNMS。在将聚合物端基巯基化之后与AuNPs进行组装制备温敏性纳米复合物AuNPs-pNMS,将其作用于细胞,研究其对ESCs生长增殖和分化的影响。结果表明温敏性纳米复合物AuNPs-pNMS有着良好的生物相容性,对ESCs的增殖没有抑制作用,和肝素以及类肝素一样,可以促进ESCs进行神经分化,并且分化效果强于肝素和AuNPs-pMS。在AuNPs-pNMS处理ESCs 14天后,成熟神经元标志性基因β3-tubulin的相对基因表达量是肝素对照组的14倍,相比较于AuNPs-pMS组,也提高了近3倍。另外AuNPs-pNMS组的成熟神经元标志性蛋白β3-tubulin的表达量也远远超过肝素组和AuNPs-pMS组,比例达到了近80%,并出现大量神经元结构,分化效果比肝素组和AuNPs-pMS组更佳。同时免疫荧光染色的荧光强度表明了 AuNPs-pNMS与FGFR结合的稳定性更高,可以形成更稳定的三元复合物。这些结果表明类肝素长链中pNIPAAm片段的加入,提高了形成的三元复合物的稳定性,可以更好的促进ESCs的神经分化。(2)在保持pMS片段分子量为8900 Da一定的情况下,通过RAFT聚合法合成pNIPAAm与pMS具有不同比例分子量的pNMS,制备不同比例的AuNPs-pNMS,探究不同比例的AuNPs-pNMS对ESCs命运的调控。结果表明,不同比例的AuNPs-pNMS对ESCs的增殖没有影响,pNMS分子量为28100 Da时,AuNPs-pN3MS对ESCs神经分化的效果最好,并且最佳促分化浓度为2.4nmol/L。上述结果表明pNMS中pNIPAAm与pMS的结构单元比例以及AuNPs-pNMS作用细胞的浓度都对ESCs的神经分化有着影响。综上所述,类肝素与FGFR和FGF形成三元复合物的稳定性会影响促进ESCs神经分化的效果。通过在类肝素pMS长链上嵌段功能片段pNIPAAm,制备温敏性纳米复合物AuNPs-pNMS,可以提高细胞膜表面形成的三元复合物的稳定性,更好的促进ESCs神经分化。同时pNIPAAm与pMS的结构单元比例以及AuNPs-pNMS作用细胞的浓度也会影响细胞的分化效果。这些结论为我们制定促进ESCs神经分化的平台提供了新的思路。

关键词： 胚胎干细胞   自我更新   多能性   CID755673   蛋白激酶D   AKT  

摘要： 小鼠胚胎干细胞(Mouse embryonic stem cells,m ESCs)来源于着床前的内细胞团,在体外具有自我更新与多能性这两种特性,其中自我更新是指细胞在体外的特定条件下能够不断的进行自我复制式地增殖,并能够保持未分化的状态,而多能性是指细胞能够向外胚层、中胚层、内胚层分化。研究人员于1981年首次从小鼠中分离出m ESCs,这也是第一株在体外成功建立的干细胞系,拓宽了人们对于m ESCs的理解。经过7年时间,人的胚胎干细胞(Human embryonic stem cells,h ESCs)系成功建立,促使涉及h ESCs的基础研究逐渐兴起,h ESCs在生命医学领域的应用已成为广大研究人员所关心的热点话题。目前而言,m ESCs与h ESCs在某些特性上有一定相似,但是生物学特性也存在很多的不同,例如培养条件和细胞形态。目前只有小鼠与大鼠的ESCs在体内被证明具有形成种系嵌合体动物的能力,研究人员一直在努力开发合适的培养基,用于维持不同动物ESCs的体外生长。基于此,本论文将寻找ESCs自我更新的新机制,从而为优化当前的培养条件去维持其他动物的ESCs提供有用的线索。首先,本论文利用一个化学小分子试剂库进行筛选,发现CID755673(CID)处理的46C m ESCs呈现未分化的表型。同时,对处理后46C m ESCs进行碱性磷酸酶染色(AP),免疫荧光和荧光实时定量(q RT-PCR)等检测,发现处理后的m ESCs具有较强的AP活性,且高表达多能性基因Oct4和Nanog,表明CID能够促进m ESCs的自我更新。接下来通过在m ESCs中添加不同浓度的CID进行处理,AP染色显示10μM浓度是最佳的处理浓度。但是培养在10μM CID下的m ESCs传到第三代时出现了分化表型。所以小分子CID只能在体外短暂地维持m ESCs的自我更新。为了明确CID是否可以和其他小分子在体外长期地维持m ESCs的干性,本论文将设置两组实验组,即CID与小分子PD0325901(PD)组合以及CID与CHIR99021(CHIR)的组合,结果发现CID与PD共同处理的46C m ESCs表现出较强的AP活性,高表达Oct4、Sox2和Nanog等自我更新标志基因,且可多次传代。我们把此条件命名为“PC”。在体外条件下,我们结合拟胚体实验(EB分化)发现PC处理的m ESCs能够向外、中、内三个胚层的细胞进行分化。而注射到胚泡后,能够形成嵌合体小鼠,且此小鼠能够生殖遗传。说明PC可以在体外维持m ESCs的多能性。CID是蛋白激酶D家族(Protein K inase D,PKD)的抑制剂,PKD家族主要包括三个成员PKD1、PKD2和PKD3,PKD家族成员参与调节许多细胞生物学功能,例如高尔基体复合体的完整性和蛋白质的分泌、细胞凋亡与增殖、氧化应激和炎症、心脏病和恶性肿瘤的发展等。接下来,为了确定CID促进46C m ESCs自我更新是通过何种PKD来实现的,本项目在46C m ESCs中分别单独下调了PKD1、PKD2和PKD3的转录本,单独下调PKD并不够维持m ESCs的干性,表明PKD家族基因的功能可能存在互补。因此,本项目通过CRISPR/CAS9介导的DNA双链突变在46C m ESCs中逐一敲除PKD基因表达,与野生型细胞相比,同时敲除三个PKD基因的m ESCs分化延缓,具有较强的碱性磷酸酶活性。说明CID是通过同时抑制PKD家族成员的活性来促进m ESCs的自我更新。接着,为了探究CID促进m ESCs自我更新的分子机制,本项目利用高通量测序技术分析了PD与PC处理的m ESCs中基因表达的变化。与PD组相比,PC处理的细胞中有613个基因的表达上调,980基因表达下调。结合生物信息学的功能富集的分析,鉴定出与干细胞多能性调控的相关基因。q RT-PCR方法进一步验证表达筛选出Pik3r3和Id2。但是在PC存在条件下,敲低Id2表达的细胞仍有典型的m ESCs形态,表明Id2不是CID发挥功能的关键靶基因。于是我们选择了另一候选基因Pik3r3。先前研究表明过表达Pik3r3会增加AKT的磷酸化,敲低Pik3r3则会降低AKT的磷酸化,本项目也验证了这一结论。此外,蛋白质免疫印迹检测显示:CID确实可以增加AKT的磷酸化水平。接下来,本项目在CID存在条件下,添加了PI3K/AKT信号通路特异性的小分子抑制剂,LY294002(LY294)。尽管添加LY294没有显著地抑制PC维持m ESCs的自我更新,但是在一些细胞克隆的边缘出现了分化。这些发现共同表明PI3K/AKT信号通路可以部分地介导CID促进m ESCs自我更新的能力。最后,为了确定CID是否能够促进h ESCs自我更新,在h ESC

关键词： 人胚胎干细胞   定向分化   内皮细胞   前庭样家族成员4  

摘要： 【背景】　　Hippo信号通路在干细胞自我更新和扩增中具有关键作用，并且参与调节心血管细胞的分化。前庭样家族成员4（VGLL4），Hippo信号通路的重要组分，作为一个新的转录共激活因子可诱导干细胞向成骨细胞，骨骼肌细胞分化。此外，内皮细胞（EC）中敲除VGLL4在导致心脏瓣膜细胞过度增殖的同时促进内皮间质转化，并且VGLL4可以抑制氧化低密度脂蛋白诱导的EC凋亡。然而，VGLL4在EC分化中的作用和机制尚未报道。　　【目的】　　探讨VGLL4在人胚胎干细胞（hESC）定向分化为EC中的作用及其调控的分子机制。　　【方法】　　***经中胚层定向诱导分化为EC模型的建立　　采用WB和RT-qPCR检测分化过程中多能性相关基因OCT4、SOX2、NANOG;中胚层标志基因EOMES、T、MIXL1;EC标志性基因CD31、VE-Cad、vWF及Hippo信号通路相关基因（包括VGLL4）的表达。　　***4对EC分化的影响　　基于PiggyBac转座子系统建立可诱导VGLL4过表达的hESC稳定细胞株，通过CRISPR-Cas9系统构建并筛选VGLL4杂合敲除的hESC细胞株。再分别与对照组同时分化为EC。WB和RT-qPCR检测hESC中干扰VGLL4表达后EC和中胚层细胞相关标志性基因的变化。　　***4通过与TEAD1结合影响EC关键转录因子的表达调节EC分化　　RT-qPCR检测干扰VGLL4对EC关键转录因子的影响。免疫共沉淀实验（CO-IP）、生物信息学分析及双荧光素酶实验检测VGLL4是否通过TEAD1影响FL1启动子的活性。进一步，在抑制VGLL4表达的同时诱导TEAD1过表达，通过RT-qPCR检测其对EC标志性基因及关键转录因子的影响。　　【结果】　　***经中胚层定向诱导分化为EC过程中，VGLL4呈上调趋势　　在hESC分化为中胚层细胞过程中，多能性相关基因的表达水平显著下调，中胚层标志基因的表达呈瞬时上调。进一步在中胚层细胞分化为EC过程中，EC标志性基因的表达水平显著上调。免疫荧光、成管实验及脂质吞噬实验结果显示hESC来源的EC与正常EC具有相似功能，表明hESC分化为EC模型构建成功。同时，VGLL4和TEAD1在此过程中表达呈上调趋势，TEAD4表达呈下调趋势。　　***4调节hESC分化为EC　　（1）DOX诱导VGLL4过表达促进hESC分化为EC　　RT-qPCR、WB及免疫荧光结果显示，hESC中过表达VGLL4时，多能性基因的表达与对照组相比没有显著性差异，增殖性基因PCNA、MKI67和CCND1的mRNA表达水平也无显著性变化。在EC分化过程中，与对照组相比，诱导VGLL4高表达时，EC标志性基因的表达在mRNA和蛋白水平上显著上调，中胚层标志基因的表达也显著上调。　　（2）杂合敲除VGLL4抑制hESC分化为EC　　RT-qPCR、WB结果显示，杂合敲除VGLL4效率达60%左右，多能性基因的表达无显著性改变。增殖性基因在mRNA表达水平上上调。与对照组相比，VGLL4低表达情况下，EC、中胚层标志性基因的表达显著下调，CD31、VE-Cad的蛋白表达水平也显著下调。　　***4通过与TEAD1结合促进EC关键转录因子的表达　　与对照组相比，VGLL4过表达促进EC关键转录因子ERG、FLI1、FOXC2、SOX17及HEY1等的表达，抑制VGLL4表达抑制EC关键转录因子的表达。并且VGLL4通过与TEAD1结合促进EC关键转录因子FLI1等的表达。　　【结论】　　***4参与调控中胚层介导的hESC分化为EC的过程。　　2.过表达VGLL4促进hESC分化为EC，而杂合敲除VGLL4抑制hESC分化为EC。　　***4通过与TEAD1结合促进EC关键转录因子FLI1的表达从而促进EC分化。

关键词： 基因工程   pMA5载体质粒   枯草芽孢杆菌   生物降解   雌二醇  

摘要： 活性污泥法是指人为地向污水中通入空气使污水中产生富含微生物的污泥,经微生物作用使污水得到净化的方法,其作为一种污水生物处理方法距今已有一百多年的历史。活性污泥法发展至今除普通式活性污泥法外还衍生出了很多改良工艺,如氧化沟法、两段式活性污泥法、序批式活性污泥法等,但目前还没有看到利用基因工程技术对活性污泥法进行改良的报道。由此,利用活性污泥中的土著菌构建具有特定降解功能的基因工程菌用来处理更具广谱性的污染物、提升活性污泥法污染物降解能力是一种具有良好前景的活性污泥改良方式。本文在此设想上开展了实验研究。目前,利用基因工程对菌株进行改良已经成为一种相对成熟的技术,基因工程技术是指外源基因经体外重组后导入到受体细胞内,使得外源基因可以在该受体细胞内进行复制、转录、翻译和表达的一种生物学技术。本文意在活性污泥中获得一株具有独立生存能力并且能够在土著微生物群落中获得生态位的土著菌株,将其制备成为感受态细菌,利用基因工程技术导入外源性功能基因,获得功能菌株。本研究得到以下结论:首先,从长春市某污水处理厂曝气池活性污泥中分离筛选出一株菌株,经过形态学观察,菌落为圆形,菌落边缘不规则,有褶皱,不透明,扩张,污白色或微带黄色,菌体粘稠,结合分子生物学鉴定,确定菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),并将其命名为*** DH-BS01;其次,通过全基因组测序分析得到了菌株*** DH-BS01的基因组特征,菌株基因组大小为4.2 Mbp,GC含量为43.79%,包含4,116个编码基因,213个非编码RNA,10个基因岛以及4个前噬菌体,将菌株基因组在多个数据库上进行了基因功能注释,共注释到4,090个基因,各数据库上注释到不同数量的基因,对各数据库的注释结果进行了基因功能分析;将菌株*** DH-BS01与三个参考基因组进行了比较基因组分析;然后,借助基因工程手段将外源雌激素降解相关基因HSD17B14导入载体质粒pMA5中,将该载体质粒转化进感受态枯草芽孢杆菌DH-BS01中构建成为重组菌。最后,选择雌二醇为菌株降解的主要对象,对原枯草芽孢杆菌、空载枯草芽孢杆菌以及重组菌进行以雌二醇为唯一碳源的相关降解实验,当降解进行到72 h时,原枯草芽孢杆菌DH-BS01的降解率为27.2%,空载枯草芽孢杆菌DH-BS01-pMA5的降解率为21.3%,而重组菌DH-BS01-pMA5-HSD17B14对雌二醇的降解率达到57.7%,实验结果表明本实验构建的基因工程菌对雌二醇降解效率为野生型枯草芽孢杆菌菌株降解效率的二倍。本研究结果使基因工程菌株获得了比野生型枯草芽孢杆菌更高效率的雌激素降解功能,对缓解生活污水以及养殖废水中的雌激素污染,提高污水处理厂二级出水指标具有重要意义。活性污泥土著菌株*** DH-BS01具有作为基因工程受体菌的潜力,为之后利用该菌株制成特性活性污泥应用到污水污染物处理中提供了理论依据及可靠的原材料。未来的研究方向主要在于将活性污泥土著菌株*** DH-BS01通过基因工程技术改造,制备成为具有多种污染物降解功能的菌剂,将其应用到活性污泥法污水处理中以实现污水修复治理效能的提升从而改善生态环境。

关键词： 间充质干细胞   胚胎干细胞   绿色荧光蛋白   慢病毒  

摘要： 目的:1.用pLVX-IRES-Puro-GFP慢病毒转导人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞,流式细胞仪分析慢病毒对三种不同来源人间充质干细胞的转导效率。2.将成功标记绿色荧光蛋白基因的人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞继续传代培养,分析传代培养对绿色荧光蛋白基因阳性的细胞形态及荧光表达的影响。3.测定荧光蛋白标记前后的人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞的增殖、分化及细胞表型,分析慢病毒介导的绿色荧光蛋白转导对人间充质干细胞增殖、分化及细胞表型的影响,为后续干细胞体内示踪奠定基础。方法:1.用相同MOI值pLVX-IRES-Puro-GFP慢病毒转导人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞,流式细胞仪检测三种不同来源人间充质干细胞的慢病毒转导效率。2.将标记有绿色荧光蛋白基因的人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞继续培养传代,观察细胞形态的变化和绿色荧光蛋白基因的表达,流式细胞仪检测细胞增殖10代后绿色荧光蛋白阳性细胞的比例。3.对绿色荧光蛋白标记前后的细胞用CCK-8法测定细胞增殖情况,用定向诱导分化培养液进行成脂、成骨、成软骨诱导分化,油红O、茜素红、阿利新蓝染色液分别对分化后的细胞染色,流式细胞仪测定标记前后细胞表面抗原CD73、CD90、CD105、CD34、CD11b、CD19、CD45和HLA-DR的表达。结果:1.p LVX-IRES-Puro-GFP慢病毒转导人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞的效率存在明显差异,且差异具有显著统计学意义(P<0.01)。结果显示,人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞慢病毒转导效率最高,其次是人脐带间充质干细胞,人脂肪间充质干细胞转导效率最低。2.标记有绿色荧光蛋白基因的人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞继续培养繁殖10代,倒置荧光显微镜下仍然可见几乎所有细胞均带有绿色荧光。自然光线下可见细胞贴壁成梭形,胞质丰富,细胞整体成漩涡状生长,均保持了正常良好的细胞形态,与同代数未转导干细胞比较无明显差异。3.标记有绿色荧光蛋白的人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞的增殖曲线和未标记细胞相近,在450nm波长下测得的OD值无统计学差异(P>0.05),人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞和人脐带间充质干细胞标记绿色荧光蛋白基因后依然能分化成脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞,流式细胞仪测定表面抗原CD73、CD90、CD105阳性比例均在95%以上,CD34、CD11b、CD19、CD45和HLA-DR几乎不表达(<0.2%)。与同代数未转导干细胞表面抗原表达结果一致。结论:1.p LVX-IRES-Puro-GFP慢病毒转导人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞的效率有显著差异(P<0.01),分析可能与间充质干细胞来源的不同或细胞增殖力差异等有关。2.标记有绿色荧光蛋白基因的人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞继续培养繁殖10代后细胞形态正常,且绿色荧光蛋白的表达未衰减,提示绿色荧光蛋白基因可在细胞内长期稳定表达,适用于干细胞的长期标记。3.慢病毒GFP基因转导对人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞的生长增殖、分化及细胞表型无不良影响,表明慢病毒介导的绿色荧光蛋白转导对细胞无毒害,且可在细胞内稳定表达,是一种理想的干细胞标记方法。

关键词： 染色质构象   精子发生   拓扑结合域   小鼠胚胎干细胞  

摘要： 细胞核中的染色质是编码所有基因,以表达维持生命的细胞功能所必需的蛋白质的信息载体。了解细胞核中的正常的信息组织、存储和展开方式有利于人类健康事业。已有研究发现染色质构象这种信息组织形式的变化可能引起癌症等疾病,也可能改变人体对病毒等感染物的响应。本研究主要研究小鼠精子发生过程中的三维构象变化以及胚胎干细胞中的TADs（拓扑结合域）类别。论文第一部分是利用Hi-C和其他组学技术研究小鼠精子发生的五个时期中染色体的构效关系。我们发现染色质环和拓扑结合域都在粗线期几乎消失,随后再逐渐重建。结合Hi-C和RNA-seq数据,我们发现在精子发生不同阶段间转换了 A/B区室的区域与减数分裂特异的mRNAs和piRNAs的表达活性有关。此外,ATAC-seq数据表明,染色质可及性本身不能决定粗线期细胞中TADs和环的消失。而ChIP-seq数据表明,粗线期细胞中的CTCF和cohesin仍然结合在原始生殖细胞中的TAD边界位置上,说明TADs和环的动态变化也不能仅由CTCF和cohesin的结合决定。论文第二部分是对拓扑结合域的分类。根据边界上基因的转录水平、边界序列的染色质状态、TADs大小、TADs内互作矩阵的特征值大小将TADs分为了九类,并发现了其中SA类TADs表达最活跃且在细胞间最保守;A11类和S22可能参与干细胞分化和增殖。总之,本研究补充了对小鼠精子发生过程中基因组构效关系的认识,并特别地深化了对拓扑结合域这一类染色质构象的共性与区分的认识。

关键词： IPMN   KLF4   全外显子组测序   细胞游离DNA(cfDNA)   液体活检   肝细胞癌  

摘要： 目的:导管内乳头状黏液性肿瘤(Intraductal Papillary Mucinous Neoplasms,IPMNs)是一种非浸润性囊肿性胰腺肿瘤,根据肿瘤上皮形态分为低级别和高级别。低级别IPMNs异型性及恶性转化风险均很低,而高级别IPMNs不但异型性高,而且发展为浸润性癌的风险更高。本研究的目的是通过比较同一 IPMN患者低级别和高级别不同组织区域的基因突变,探讨肿瘤进展的分子变异模式。内容:本课题对17例非浸润性IPMNs的低级别区域和高级别区域进行多区域全外显子组测序,共检测了 76个区域,包括49个低级别区域和27个高级别区域。使用生物信息学方法分析得到这些样本的体细胞SNV、InDel突变和CNV变异信息,发现了 IPMNs的驱动基因——KLF4。同时,比较IPMN不同区域变异模式,并对每例样本建立系统发生树,探索IPMNs进化过程。最后在一组包含63例IPMNs囊液样本的独立队列的中验证了新驱动基因KLF4的突变模式。结果:我们的多区域全外显子组测序分析鉴别出IPMNs全新的驱动基因KLF4,该驱动基因尚未被报道过。在纳入分析的17例IPMNs样本中,有超过50%的样本有该基因的热点突变,并且KLF4突变更倾向于富集在低等级IPMNs中。同时,我们重建了每例样本的系统发生关系,分析IPMN的发展进化轨迹,并证明了这些病变的遗传异质性。在独立的IPMN囊液样本队列中也检测到相同的KLF4热点突变,并且也是在低级别IPMNs中的突变率更高。结论:KLF4热点突变在IPMN患者中具有较高的突变率,并且在低级别IPMN患者中富集,表明低级别和高级别区域具有不同的分子特征。系统进化分析表明IPMN拥有高度的遗传异质性。背景:基于细胞游离DNA(Cell Free DNA,cfDNA)的肿瘤无创检测具有很高的利用价值,尤其是基因突变和甲基化检测方面。但是,通常情况下cfDNA的使用范围受到很多限制,主要因为一次取样所获得的cfDNA量极少,在大多数情况下仅能满足一种检测的需要,很难有足够的cfDNA满足同时进行多种变异的检测。因此,我们创建了一个新的技术,称为Mutation Capsule(MC),实现了使用一份cfDNA同时进行突变和甲基化等多种检测。方法:使用甲基化敏感的限制性内切酶对cfDNA进行酶切处理,我们将甲基化状态转化成高通量测序可检测到的形式。把突变和甲基化状态一起保存的同时,在同一个全基因组文库中扩增,然后可用于突变和甲基化联合检测。我们搜集了 85例HCC和100例nonHCC患者的样本,探索了该技术在肝癌早期筛查中的应用价值。结果:该技术可以同时检测频率低至0.02%的突变和0.25%的甲基化变异。此外,与直接检测cfDNA样本相比,在保证较高灵敏度的前提下,使用10%的MC文库就足以同时检测基因突变和甲基化变异。而且这一特点,加上特殊的扩增子设计,使得cfDNA分子到测序文库的转换效率更高,可以检测到更多的原始cfDNA分子。HCC患者cfDNA样本的基因突变和甲基化呈现互补模式,与只检测一种类型的生物标志物相比,同时检测两种类型的生物标志物可以覆盖更多的HCC病例。结论:MC技术可以使用同一份cfDNA样本同时用于多种检测,允许突变和甲基化共检测。这个技术的多重检测特点,使得低cfDNA产量的样本的检测更加灵敏。

关键词： CHD8   CRISPR/Cas9   神经外胚层   人胚胎干细胞   细胞凋亡  

摘要： CHD8蛋白是隶属于依赖ATP的染色质重塑因子CHD家族,在大脑中广泛地表达。同时小鼠CHD8纯合敲除导致胚胎死亡表明CHD8在早起胚胎发育中的重要作用。随着研究和技术的发展,人们对自闭症患者进行的大量外显子测序,发现CHD8也是自闭症疾病致病的高风险突变基因之一。在CHD8突变的自闭症患者中CHD8的等位基因出现缺失或者插入导致CHD8表达不足。但是,对于CHD8的基础生物学功能及作用机制的了解还是知之甚少。胚胎干细胞来源于囊胚期的内细胞团,在体外能长时间维持自我更新和三胚层分化的能力,可以作为很好地体外发育模型研究在早期胚胎发育过程中的关键事件是如何发生的,更清楚地了解胚胎发育过程中的信号通路、表观遗传以及细胞状态变化等过程。胚胎干细胞也可以作为疾病发生模型的工具细胞,利用基因编辑技术在胚胎干细胞模拟致病基因的突变通过在体外分化模拟疾病发生的过程,有助于人们对于疾病发生过程及机制的研究,为疾病的治疗提供了思路或者治疗的靶点。已有的CHD8杂合或者敲低的细胞或小鼠模型的研究报道显示,CHD8的表达下调能够影响自闭症的发生以及神经发育相关基因的正常表达,同时发现杂合的小鼠也能够表现出自闭症的相关特征以及促进神经祖细胞增殖的能力。然而,CHD8在早期胚胎发育中的作用以及自闭症疾病中的功能与机制现在尚不清楚,特别是纯合CHD8敲除的细胞模型目前还没有被建立,我们无法完全排除残存的CHD8蛋白可能行使部分功能的可能性。因此,建立CHD8完全缺失的胚胎干细胞模型是迫切需要的。在这里,我们通过CRISPR/Cas9技术在人的胚胎干细胞里构建CHD8基因移码突变的细胞系,成功对CHD8蛋白进行完全敲除,并基于得到的CHD8敲除的胚胎干细胞系探究了 CHD8的完全缺失对胚胎干细胞多能性维持和谱系分化的影响。研究结果表明,完全敲除CHD8对人胚胎干细胞的自我更新和维持没有明显影响,不影响胚胎干细胞核心标志基因的表达,但会稍微促进胚胎干细胞的细胞凋亡,也对对胚胎干细胞的增殖和细胞周期等生物学过程有轻微影响,促进细胞增殖,改变了细胞周期的G1和G2/M期。通过体外的自发分化的拟胚体实验研究,我们发现CHD8的敲除会特异性影响神经外胚层基因PAX6的表达,导致PAX6的表达出现明显减少,而不影响内胚层和中胚层相关基因的表达。通过定型内胚层以及神经外胚层的定向分化实验,我们进一步确认CHD8的敲除会特异性导致神经外胚层分化失败,具体表现在神经外胚层分化中低表达神经祖细胞的标志基因并且在分化过程中出现大量的细胞死亡。同时我们分别对野生型以及CHD8敲除的胚胎干细胞以及分化得到神经祖细胞进行RNA-seq。RNA-seq的转录组分析的结果表明CHD8的完全缺失并不影响胚胎干细胞阶段的整体转录水平,特别是胚胎干细胞的多能性基因以及三胚层基因的表达并未发生明显变化。而在神经祖细胞阶段,RNA-seq的结果表明CHD8的敲除能够导致细胞凋亡相关基因的持续异常表达,同时也导致神经外胚层相关基因的表达受阻而无法激活。这些实验结果表明,CHD8在早起神经发生过程中的多能性退出、神经外胚层正常分化以及细胞凋亡的调控中发挥了重要作用。总而言之,这些实验结果为CHD8在多能性以及神经分化中的作用提供了新的见解。

关键词： 单链脱氧核糖核苷酸   高通量测序技术   R环检测   胞嘧啶脱氨酶  

摘要： 存在于原核生物和真核生物基因组中动态的单链DNA(ssDNA)是生物体中RNA转录、DNA复制和DNA修复的模板。同时，单链DNA结构因为更高的可及性也会成为活性氧和核酸酶攻击的靶标，进而导致基因组的不稳定性。对动态单链DNA进行高通量测序及定位，是了解其生物功能和在生物体中起到的调节作用十分重要的手段。而现有的全基因组水平单链DNA测序方法，如ssDNA-seq及KAS-seq等，对于直接测定单链DNA的序列及位置，都存在着不足。因此，开发一种高效的、高精度的单链DNA测序方法十分必要。　　本课题开发了一种由胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A辅助的全基因组单链DNA测序方法，并将其命名为A3A-ssDNA-seq。其原理是，在温和的DNA非变性条件下，APOBEC3A能够实现对全基因组单链DNA区域内胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的高效特异性脱氨，并通过富集分析的生物信息学计算方法，由发生脱氨的位点判断单链DNA区域。相比于已被报道的通过抗体免疫沉淀介导的单链DNA富集测序方法，A3A-ssDNA-seq对全基因组单链DNA捕获和分析的分辨率更高，可接近分子水平上的单核苷酸精度。相比于利用高锰酸钾的单链DNA测序方法ssDNA-seq而言，A3A-ssDNA-seq所需要的细胞量更少，仅需要1μg的基因组DNA即可进行脱氨、片段化、建库的流程。与采取生物素化进行富集的KAS-seq相比，A3A-ssDNA-seq也能够以数量相当的细胞量完成测序，最少可以104-105的细胞量进行测试。　　R-loop是基因组上重要的二级结构，包含一条被置换的单链DNA和一个DNA∶RNA杂交链，是基因组中单链DNA的主要来源之一。利用已开发的A3A-ssDNA-seq高通量测序方法与具有DNA∶RNA杂交链降解能力的内源性核酸酶RNase H1体内过表达结合，就可以高分辨率地鉴别、定位小鼠胚胎干细胞中的R-loop。与已有的其他R-loop测序方法相比，这种方法可以捕捉到更多的R-loop位点。相比于DRIP-seq而言，A3A-ssDNA-seq对于R-loop的检测精度可以达到101-102bp，提高了近一个数量级。　　A3A-ssDNA-seq使得我们能够在全基因组水平上精确识别单链DNA并区分R-loop结构以及其他含有单链DNA的非B型DNA二级结构。本文的研究发现，单链DNA在小鼠胚胎干细胞的基因组中分布广泛，且在基因的启动子区域、重复区域等富集。同时，我们发现当基因表达水平越高时，A3A-ssDNA-seq的信号就越强，这证明了单链DNA结构与RNA聚合酶Ⅱ介导的基因转录调控的正向关联。另外，本文也探讨了R-loop对小鼠胚胎干细胞基因组基因转录和对多能性维持的潜在影响。　　A3A-ssDNA-seq作为一种高效率的、非损伤的单链DNA测序方法，能够广泛地应用于不同的真核细胞基因组中单链DNA的生物学功能和结构的研究中。未来，A3A-ssDNA-seq也能够在单链DNA与疾病进展，特别是肿瘤基因组学的研究中，发挥更大的作用。

关键词： 药物递送   基因工程   胶原蛋白   白蛋白   协同治疗  

摘要： 癌症的药物开发与治疗一直是生物医药领域的研究热点。尽管近年来免疫检查点抑制剂药物已有明确的突破,但治疗效果客观上还是严重依赖提高给药剂量。临床广泛应用的化疗药物多数水溶性较差、生物利用度低、毒副作用大,致使难以达成理想的有效治疗给药剂量。即使是治疗效果明确的靶向药物,其在体内的动力学过程也只是具有药物分布的广泛性和作用发生的靶向性特征,治疗效果也受制于给药剂量。在目前新药化合物发现和改造还难以显著突破大剂量给药的情况下,从制剂材料学角度改善这个难题已受到行业的广泛关注。采用纳米粒包载难溶性化疗药物,改善药物的溶解度,提高对肿瘤组织的靶向性,达到“减毒增效”的案例已有报道。但这些纳米药物递送系统仍然存在化学治疗药在靶组织中蓄积量少、药物在靶组织部位释放的影响因素多,以及单纯化学药治疗具有局限性等共性问题。本论文以机体自身固有的蛋白质为材料,设计和制备了生物相容性好、靶向性强、对肿瘤微环境有多重响应性释放药物的纳米药物载体,并对其作为新制剂开发的辅料性能进行评价。主要研究结果如下:（1）基于肿瘤微环境细胞外基质中普遍存在较高浓度的基质金属蛋白酶2（MMP-2）和透明质酸酶（HAase）的研究报道,设计和制备了以两种酶的底物I型胶原蛋白和透明质酸为门控和靶向分子的介孔二氧化硅纳米粒。以临床已明确有治疗作用的盐酸阿霉素（Dox）为实验例,制备得到包载Dox的双酶响应型纳米递药系统（FMSN-Dox-C2H）。设计的介孔二氧化硅纳米粒自带绿色荧光,而Dox带有红色荧光,能够可视化评价FMSN-Dox-C2H纳米粒的功能响应。FMSN-Dox-C2H纳米粒是160×80 nm的圆柱体,具有低吸附白蛋白的性状,胶原蛋白和透明质酸的接枝率分别为8%和6%,载药量为9.9±0.3%。体外药物释放实验发现,对FMSN-Dox-C2H组添加MMP-2和HAase,其72 h后的Dox释放率可达70.3±7.5%,而不加酶的对照组释放率仅为7.06±2.8%,达到了采用胶原蛋白和透明质酸封堵粒子孔道,提高纳米粒在体液中的稳定性,以及双酶门控释放药物的设计目的。以不表达MMP-2和HAase的正常细胞株Cos-7和低表达两种酶的肝癌细胞Hep G2为参照,发现FMSN-Dox-C2H纳米粒对高表达两种酶的宫颈癌细胞He La具有剂量依赖关系的杀伤作用。激光共聚焦显微镜观察到Dox扩散进入He La细胞的量明显高于Hep G2细胞的量,提示纳米粒对双酶的响应性符合有效释放阿霉素的设计预期,透明质酸对He La细胞表面存在的相应受体CD44的靶向作用也是这种胞内浓度差异的可能解释。FMSN-Dox-C2H纳米粒的荷He La细胞瘤小鼠CDX模型的体内实验结果也验证了这种解释的可能性。（2）鉴于体内无法降解介孔二氧化硅纳米粒和已上市的注射用白蛋白结合型紫杉醇制剂生产质量控制的技术难点,论文采用基因重组技术设计了两端分别插入不同重复度的多聚组氨酸（His）、MMP-2酶切位点和RGD肽的人血清白蛋白（HSA）融合基因序列,实现了系列融合蛋白在毕赤酵母系统中的表达。筛选获得分子质量为71796 Da的含18个His的融合白蛋白（3RGD-HSA-MMP-18His,RHMH18）可以简单和可控的实现自组装,形成的纳米颗粒呈规则的球形,直径约为100 nm。包载紫杉醇（PTX）后制备的RHMH18纳米粒,载药量为6.6±0.3%。添加MMP-2和改变p H的72 h药物释放率可达到68.7±4.2%,显著高于对照组的释放量（6.2±0.9%）,且实验发现RHMH18纳米粒的药物释放率与其组氨酸的数量呈正相关。以RGD受体ανβ3-整联蛋白表达量为依据,选择低表达的乳腺癌MCF-7细胞和高表达的肺腺癌A549细胞、MGC-803细胞为测试细胞,发现RHMH18纳米粒具有明显的ανβ3靶向性和对MMP-2的敏感性。RHMH18纳米粒在荷MGC-803细胞瘤和A549细胞瘤小鼠CDX模型的体内实验结果也验证了体外实验结果的可靠性,并观察到纳米粒组PTX的体内半衰期可达到63.36 h,LD50为58.5mg/kg/day。上述结果提示,RHMH18纳米粒的设计可达到I型胶原蛋白和透明质酸为门控和靶向分子的介孔二氧化硅纳米粒的药用效果,且这种RHMH18来源明确,功能多样,质量单一可控,自组装的纳米粒大小均一,包载药物均衡,显著优于分子质量范围较大的I型胶原蛋白和透明质酸,利于作为制备相应药物制剂的辅料;体内实验结果显著提升了PTX给药剂量的安全性和在肿瘤部位的药物浓度,具有明显的治疗效果。RHMH18纳米粒与已上市的注射用白蛋白结合型紫杉醇制剂在技术上都是利用白蛋白表面的疏水区域自组装来解决难溶药物的制剂制备难题,但作用原理不同。前者是通过白蛋白上融合的多聚His在不同