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关键词： Sall4   Hoxd12   诱导多能干细胞   胚胎干细胞   细胞增殖  

摘要： 诱导多能干细胞(iPSCs)在体外具有分化为所有体细胞类型的能力,因此iPSCs常被期望应用于器官损伤的修复和坏死组织的再生。但由于对重编程机制认识不足所造成的诱导效率低、诱导周期长、克隆异质性等问题已成为限制iPSCs向临床应用的主要障碍。所以,阐述体细胞的重编程机制已成为科研工作者急需解决的问题。本实验室前期开发了一套利用7个转录因子(Sall4-Glis1-Mkk6-Nanog-Kdm2b-Jdp2-Esrrb,7因子)诱导多能性的高效重编程体系,并发现Sall4在该体系中具有不可或缺的作用。但Sall4在7因子中是如何介导体细胞重编程的机制仍然未知。因此,本研究以7因子诱导的体细胞重编程为模型,结合生物信息学分析与基因过表达、基因敲降技术,探索Sall4介导7因子重编程的机制。结果表明:在7因子诱导多能性的过程中,Sall4激活了足趾发育相关基因Hoxd11,Hoxd12与Hoxd13的表达。进一步研究发现,敲降Hoxd12显著降低7因子诱导的体细胞重编程效率,但敲降Hoxd12对Yamanaka因子(Oct4-Klf4-Sox2)诱导的体细胞重编程无显著作用。另外,在7因子与Yamanaka因子诱导重编程的不同阶段,分别过表达Hoxd12对体细胞重编程无显著影响;替代实验证明Hoxd12无法替代或部分替代Sall4介导体细胞重编程的功能。为了研究Hoxd12在小鼠胚胎干细胞(mESCs)中的功能,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建Hoxd12敲除的小鼠胚胎干细胞系,并证明敲除Hoxd12不影响mESCs多能性基因的表达与体外分化能力;但敲除Hoxd12可延缓mESCs的增殖速率。本研究初步探索了Sall4介导7因子重编程的机制,并发现Hoxd12对于调控体细胞重编程与mESCs的增殖具有重要作用,为揭示Sall4介导体细胞重编程的机制提供参考,对促进iPSCs安全应用到临床中具有重要的价值。

关键词： D-乳酸   L-乳酸   基因工程   代谢工程  

摘要： D-/L-乳酸是许多手性物质的合成前体,普遍应用于食品、医药和化工等领域。微生物发酵法是一种主要的乳酸生产方法,而菌种是微生物发酵的核心。本文从获得优良菌种为切入点,对基因工程改造方法的研究进展进行综述。

关键词： NAMPT   hUCMSC-Exos   人皮肤成纤维细胞   秀丽隐杆线虫   抗衰老  

摘要： 外泌体是直径在30-150nm间的纳米级囊泡,包含蛋白质、DNA、miRNA、lncRNA等多种生物分子,通过质膜融合或与表面受体结合方式参与细胞间的物质交换和信息交流,在多种疾病的发生发展过程中发挥关键作用。研究表明,间充质干细胞外泌体作为新型的理想的无细胞治疗方法,通过基因修饰或化学方式包裹药物向特定部位运输,在人和动物相关疾病的诊断和治疗方面具有较高的应用价值。NAMPT是NAD+补救合成途径的限速酶,在细胞周期、细胞代谢、细胞衰老及DNA损伤修复等生理活动中发挥着重要作用。NAMPT在哺乳动物体内有两种存在形式:细胞内和细胞外NAMPT(iNAMPT和eNAMPT)。已有研究证实细胞外囊泡内eNAMPT具有延缓衰老和延长小鼠寿命的作用。为研究过表达NAMPT基因脐带间充质干细胞外泌体(hUCMSC-Exos)能否增强抗衰老作用,本研究采用转基因技术改造外泌体,得到过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos,随后与人皮肤成纤维细胞共培养和饲喂秀丽隐杆线虫,研究其抗衰老作用,为外泌体修饰及NAMPT基因抗衰老研究提供依据。主要研究方法和结果如下:1.过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos构建及鉴定本研究通过转基因技术构建过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos。首先,构建过表达NAMPT基因的重组载体。然后通过慢病毒包装、感染、药筛,得到过表达NAMPT基因脐带间充质干细胞(hUCMSC)细胞系,并通过RT-PCR和Western blot进行鉴定。最后,收集细胞上清,提取外泌体并检测NAMPT蛋白的表达量。结果表明,脐带间充质干细胞内NAMPT mRNA和蛋白均高表达,且外泌体内NAMPT蛋白也高表达,这提示过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos构建成功。2.过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos对人皮肤成纤维细胞的衰老影响本研究通过过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos与人皮肤成纤维细胞共培养,从细胞生长曲线、β-半乳糖苷酶染色、细胞划痕试验、丙二醛含量检测及衰老相关基因P16和P21 mRNA和蛋白的含量检测等实验验证过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos对人皮肤成纤维细胞的抗衰老作用。结果表明,过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos不仅促进人皮肤成纤维细胞的增殖和迁移,还增强了其抗氧化能力和降低了其衰老相关基因的表达量。3.过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos对秀丽隐杆线虫抗衰老的影响为进一步验证过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos的抗衰老作用,利用过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos饲喂秀丽隐杆线虫,从其寿命、身体摆动频率及其体内超氧化物歧化酶和活性氧自由基等试验进行验证。结果表明,过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos不仅延长秀丽隐杆线虫的寿命,还增强了其抗氧化能力和运动能力。综上,本研究构建了 NAMPT基因过表达的hUCMSC细胞系,获得过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos。通过与人皮肤共培养和饲喂秀丽隐杆线虫发现,过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos具有显著的抗衰老作用,有望成为一种新型的抗衰老制剂。

关键词： 新媒体艺术   分子生物学   艺术科技   基因工程   DNA  

摘要： 在新媒体艺术的发展过程中,产生了互联网、人机交互、人工智能等艺术媒介形式。生物也随着科学技术的发展和社会的广泛应用被纳入到了新产生的创作媒介行列。随着生物工程,基因编辑等分子生物学技术的日趋成熟以及技术简化,人类基因组工程和生物信息学的发展,生物科技作为艺术创作的新媒介已经成为了国内外艺术发展的前瞻性方式。本文根据遗传学的发展和分子生物学的主要技术手段为基础研究,从国内外基因艺术,分子生物艺术案例为着眼点来阐述分子生物艺术的方法论、创作理念和技术经验与可行性分析。并且将创作过程中涉及的伦理问题进行了基础的探讨。目的是使关于"基因"的艺术创作具有技术上的可行性,理论上的科学性以及为社会伦理基础保障与公众的安全性做出建议。

关键词： 磷酸化   应激颗粒   胚胎干细胞  

摘要： 磷酸化修饰作为最重要的翻译后修饰方式，对蛋白质的功能具有显著的调控作用。磷酸化修饰在蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA、蛋白质与RNA之间的相互作用中也是必不可少的。生物分子凝集体，又称无膜细胞器，是由蛋白质等生物大分子通过多价相互作用聚集形成。应激颗粒作为由核糖核蛋白复合体和多种RNA结合蛋白质、RNA通过液-液相分离聚集形成的生物分子凝集体，广泛存在于多种细胞和组织内，与多种疾病的发生密切相关。磷酸化修饰对于某些蛋白质的相分离具有调控作用，例如，阿兹海默症和肌萎缩侧索硬化症等神经退行性疾病很可能由于蛋白质的磷酸化修饰及相分离异常导致。磷酸化修饰在胚胎干细胞中也具有重要作用;胚胎干细胞和诱导多能干细胞的磷酸化蛋白质谱研究表明，多能干细胞中均存在多种蛋白质的磷酸化修饰，包括OCT4和SOX2等重要的转录因子。磷酸化修饰对胚胎干细胞多潜能性维持和自我更新可能有重要影响，对于研究胚胎发育早期细胞命运决定及胚层分化有重要意义。　　睾丸作为腹腔外的生殖器官，较易受到外部环境的刺激形成应激颗粒;而隐睾造成的不育很可能与生殖细胞形成应激颗粒的异常有关。本研究首次采用离心和小分子沉淀的方法分离富集睾丸细胞应激颗粒核心，并通过串联质谱分析其蛋白质组分，发现具有相分离能力的关键蛋白GUANYIN。通过在HeLa细胞异位表达GUANYIN，本研究发现GUANYIN可以形成应激颗粒，并且不完全依赖G3BP。分别通过免疫共沉淀293T细胞内表达的GUANYIN和睾丸细胞内源的GUANYIN蛋白进行高分辨率质谱分析，本研究发现分布在GUANYIN蛋白固有无序区域的3个磷酸化修饰位点S324、S359、S361，并通过特异性的GUANYIN磷酸化抗体证实S359/S361存在磷酸化修饰。固有无序区域对于蛋白质发生相分离至关重要，该区域的翻译后修饰很可能对蛋白质相分离具有调控作用。本课题利用碱基突变的方法将GUANYIN蛋白的磷酸化位点突变为模拟去磷酸化的丙氨酸，研究突变蛋白在各种刺激条件下相分离形成应激颗粒的情况;发现在G3BP敲除的HeLa中，砷盐刺激下模拟去磷酸化突变的GUANYIN蛋白应激颗粒形成明显增多，表明磷酸化修饰可能抑制GUANYIN的相分离特征。进一步的研究发现，砷盐刺激下GUANYIN的磷酸化水平显著升高，与该条件下GUANYIN形成应激颗粒的能力减弱结果一致。同时，免疫共沉淀研究发现去磷酸化突变的GUANYIN与G3BP的蛋白间相互作用显著增强，表明磷酸化抑制GUANYIN与G3BP的结合。对GUANYIN磷酸化及磷酸化对相分离形成应激颗粒影响的研究，有助于了解GUANYIN在睾丸细胞参与形成应激颗粒的具体机制以及GUANYIN在睾丸细胞中的具体功能。本研究建立的睾丸细胞应激颗粒核心分离富集方法，对于研究睾丸细胞应激颗粒的功能具有重要的参考意义;对其中分离富集蛋白的研究，有助于了解睾丸细胞应激相关疾病地机理。　　OCT4是维持胚胎干细胞多潜能性所必需的转录因子;然而，过表达OCT4会诱使胚胎干细胞向原始内胚层分化，调控这一分化转变的分子机制尚不完全清楚。本课题首先通过氨基酸去磷酸化突变的方法对OCT4蛋白具有转录激活作用的碳端区域丝苏氨酸进行磷酸化水平检测，发现OCT4Thr343突变导致OCT4磷酸化水平显著降低。为了进一步研究OCT4Thr343磷酸化在胚胎干细胞中的作用，本课题通过CRISPR-Cas9基因编辑技术，构建了OCT4Thr343模拟去磷酸化和持续磷酸化的点突变胚胎干细胞系。本研究发现OCT4Thr343氨基酸残基突变成丙氨酸(T343A)而不是天冬氨酸(T343D)后，胚胎干细胞中OCT4的磷酸化水平显著下降。对OCT4Thr343磷酸化丢失的突变胚胎干细胞(T343A)及其形成畸胎瘤的基因表达研究表明，该突变使胚胎干细胞多潜能性改变并更倾向于向原始内胚层分化;进一步研究发现T343A突变的OCT4与SOX17蛋白间相互作用增强，而与SOX2蛋白间相互作用减弱。染色质免疫共沉淀发现T343A突变的OCT4对下游基因的调控受到其与SOX2和SOX17蛋白间相互的变化而影响。因此本研究提出基于OCT4Thr343氨基酸残基的磷酸化对于OCT4维持胚胎干细胞的多潜能性是至关重要的。基于OCT4磷酸化的这一分子机制对于研究胚胎发育早期谱系定向的调控机制有重要的参照意义。

关键词： 上皮性卵巢癌   循环肿瘤DNA   细胞游离DNA   细胞游离DNA浓度   早期诊断  

摘要： 背景卵巢癌是妇科肿瘤中致死率最高的癌症,目前筛查和早期诊断策略有限。循环肿瘤DNA(ctDNA)携带肿瘤突变信息,在多种癌症诊疗中有潜在应用价值。但对其在卵巢癌早期诊断中的作用尚缺乏探讨。材料与方法研究纳入54例上皮性卵巢癌和50例卵巢良性疾病患者。收集详细的临床病理信息,使用基于338个癌症相关基因的探针进行高通量靶向捕获测序。以了解卵巢癌及良性疾病患者细胞游离DNA(cfDNA)浓度、ctDNA突变特征,结合临床指标使用logistic回归构建卵巢癌诊断模型,并评估其诊断效能。结果病例组分别包含16例、8例、30例FIGO Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期卵巢癌患者,其中高级别浆液性癌共27例。对照组含9例交界性卵巢肿瘤患者及41例纯良性对照患者。cfDNA浓度在两组间差异不显著(p=0.073),但Ⅱ、Ⅲ期卵巢癌cfDNA浓度显著高于Ⅰ期(p=0.017),高级别浆液性癌cfDNA浓度显著高于非高级别浆液性癌(p=0.006)。ctDNA体系突变在对照组中无检出。病例组中整体检出率为85.2%,在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期检出率分别为75.0%、87.5%、90.0%。循环肿瘤DNA体系突变个数与分期、病理类型无关,与组织体系突变个数存在线性相关性(y=0.215x+1.235)。TP53、ARID1A、PIK3CA、KRAS在组织和ctDNA中检出的一致性检验Kappa值分别为0.82、0.82、0.71、0.92。Ⅰ期卵巢癌的等位基因突变频率、ctDNA浓度显著低于Ⅱ、Ⅲ期。ctDNA有无检出的单一指标进行诊断的灵敏度、特异度分别为85.2%、100.0%。ctDNA有无联合其他指标可提升单用ctDNA诊断的灵敏度,但Youden指数下降。ctDNA联合cfDNA浓度、CA125、影像表现四联模型诊断的灵敏度、特异度分别为100.0%、82.0%。ctDNA联合cfDNA浓度、CA125三联模型诊断的灵敏度、特异度分别为 96.3%、74.0%。结论cfDNA浓度定量指标在卵巢癌和卵巢良性疾病中存在不显著差异,但在卵巢癌中有区分病理类型、肿瘤分期的潜在价值。卵巢癌ctDNA突变的检出与组织主要突变存在一定的一致性。等位基因突变频率、ctDNA浓度等在不同病理类型、肿瘤分期间存在差异。ctDNA在卵巢良性疾病中无检出,在卵巢癌尤其是早期卵巢癌中检出率较高,诊断的特异性极强。基于ctDNA高通量靶向捕获测序检出的ctDNA有无、cfDNA浓度等指标与CA125、影像表现联合诊断对卵巢癌有较高的诊断价值。

关键词： 雨生红球藻   虾青素   烟草   遗传转化   β-胡萝卜素羟化酶(BHY)   β-胡萝卜素酮化酶基因(BKT)   转录因子CsMADS6  

摘要： 虾青素(3,3'-二羟基-4,4'-二酮基-β,β'-胡萝卜素)是一种脂溶性酮类类胡萝卜素,具有超强的天然抗氧化活性,广泛应用于食品、医药、化妆品、保健品和养殖业。雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)是商业化生产天然虾青素的优质生物资源。然而,成本高、效率低,依然制约着雨生红球藻虾青素规模化生产,难以满足快速增长的市场需求。培育富集虾青素的农作物新种质,以用作生物反应器,高效生产虾青素则是极具发展前景的热点领域,有助于我国功能农业和大健康产业的发展。为此,本文系统分析雨生红球藻生长及表征胁迫条件下雨生红球藻虾青素合成及相关代谢动态变化,以期揭示虾青素富集及其调控关键因素;系统解析细胞自噬参与调控雨生红球藻胁迫条件下,虾青素富集及相关生理生化过程,以期阐明虾青素生物合成及调控的分子机制和挖掘关键基因;以高生物量烟草(Nicotiana tabacum)为宿主,应用基因工程组装虾青素生物合成途径,以期培育营养器官富含虾青素的烟草新种质,用于高效生产天然虾青素。主要研究结果如下:1.高光、高温和缺氮是诱导雨生红球藻虾青素富集的三个重要胁迫因子。分别表征雨生红球藻生长及在高光(≥7000 lx)、高温(≥30℃)、缺氮(0 N)及三重胁迫条件下,虾青素积累及其他相关代谢的时空响应,以建立调控虾青素富集的有效技术。试验数据揭示,诱导藻细胞积累虾青素效应强弱为:三重诱导>高光>无氮>高温。胁迫诱发细胞自噬、形成自噬泡。胁迫条件下,细胞自噬与虾青素积累、油脂合成及活性氧产生同步增强;脯氨酸含量由对照的12.61 μg/mg,上升到812.65μg/mg,增加了 64.4倍(P<0.01);钙(Ca)、铁(Fe)和镁(Mg)含量亦显著增加(P<0.05)。这些细胞生理生化的改变提高藻细胞抗逆性。2.为阐明细胞自噬介导胁迫条件下,虾青素合成积累调控机制,应用细胞自噬抑制剂3-甲基腺苷(3-MA,3-methyladenosine一种能有效地抑制自噬发生的化合物)处理高光胁迫培养的雨生红球藻,分析细胞自噬抑制对细胞生长、虾青素合成、油脂代谢等效应。试验结果显示,3-MA(0.02 mM)能有效地抑制自噬体形成,但不影响雨生红球藻细胞生长和生物量的积累(P>0.05)。抑制细胞自噬导致细胞活性氧(ROS)大量增加(P<0.01),以及虾青素、油脂和棕榈酸高水平富集(P<0.05)。3-MA处理的藻细胞虾青素合成关键酶基因即八氢番茄红素合成酶(PSY,phytoene synthase)、β-胡萝卜素酮化酶(CRTO,β-carotene ketolase)和β-胡萝卜素羟化酶(CRTR-b,β-carotene hydroxylase)基因表达显著高于对照藻细胞的数倍(P<0.05)。然而,油脂合成相关基因即生物素羧化酶(BC,biotin carboxylase)和二酰基甘油酰基转移酶(HpDGAT2D,diacylglycerol acyltransferase)基因表达与对照藻细胞相比仅小幅上调。在强光胁迫下,细胞自噬抑制导致的雨生红球藻虾青素积累与油脂生物合成呈不完全线性关系。研究表明细胞自噬参与藻细胞虾青素及油脂生物合成积累的调控,以及PSY、CRTO和CRTR-b是控制虾青素合成的关键酶基因。3.为进一步验证PSY、CRTO(BKT)和CRTR-b(BHY)酶基因是否能在异源宿主行使功能、促进虾青素富集,分别构建来自莱茵衣藻(***)的CrBKT和来自雨生红球藻(***)的HpBHY以及来自玉米(Zea mays L.)的ZmPSY酶基因的过表达载体,应用农杆菌介导烟草叶组织瞬时表达这些目的基因。烟叶组织生化测试发现,这些外源目的基因过表均能促进虾青素或类胡萝卜素富集。特别是共表达HpBHY+CrBKT基因5d烟草叶片不仅虾青素含量高达0.518 μg/mg(干重),而且叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素也显著增加至10.33 μg/mg,3.012 μg/mg和2.271μg/mg(P<0.01),预示着虾青素富集至少未减低烟叶正常光合作用。4.选用瞬时表达促进烟叶富集虾青素效果最显著的HpBHY和CrBKT酶基因,通过农杆菌介导叶盘转化法将这两个基因转入普通烟草,以期在烟草中组装虾青素合成途径。HpBHY和CrBKT酶基因前端分别融合来自烟草的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基(rbcS)的转运肽(NtTp),以使目的酶蛋白定位于质体。此外,分别采用花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子和拟南芥ubq10启动子驱动NtTpCrBKT和NtTpHpBHY过表达。经分子检测获得了HpBHY和CrBKT目的基因共转化的19个独立转基因烟草株系,其中13个转基因烟草株系的HpBHY和C

关键词： 胚胎干细胞   Polycomb   PRC2   Rbbp4   多能性   中内胚层   Oct4   Sox2  

摘要： 胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ES cells)是取自胚胎发育早期囊胚内细胞团(inner cell mass,ICM)中的一类细胞,具有自我更新和分化两大特点。然而,作为发育生物学和再生医学研究的最佳模型,ES细胞自我更新和多能性维持背后的分子机制尚未完全被阐明,这也一直是ES细胞从基础研究到临床应用所面临的主要挑战。多梳(polycomb group,Pc G)蛋白是一组在物理上相互结合的蛋白,它们在胚胎发育、干细胞多能性维持以及肿瘤的发生发展中起关键作用。Pc G蛋白通过形成功能型染色质复合物发挥作用,主要分为两大类:多梳抑制复合物1(PRC1)和PRC2。PRC1可通过核心亚基E3泛素连接酶RING1A/B在赖氨酸119位点单泛素化组蛋白H2A(H2AK119ub1)。PRC1根据组成成分不同,可进一步细分为经典和非经典的PRC1(c PRC1和nc PRC1)。也可根据包含PCGF蛋白的不同进一步分为PRC1.1-PRC1.6。PRC2由四个核心亚基EZH1/2、SUZ12、EED、RBBP4/7以及若干非核心亚基组成。组蛋白甲基转移酶EZH1/2可在赖氨酸27为位点将组蛋白H3单甲基化、二甲基化和三甲基化(H3K27me1/2/3),抑制发育相关基因表达。根据包含的非核心亚基不同可分成PRC2.1和PRC2.2,其中PRC2.1包含PCL1-3(PHF1,MTF2,PHF19);PRC2.2包含JARID2和AEBP2。最近研究表明,PRC2核心亚基RBBP4对小鼠早期胚胎发育至关重要。然而Rbbp4敲除导致早期胚胎死亡的确切原因及其在维持ES细胞多能性方面的潜在作用尚不清楚。在本研究中,我们利用CRISPR/Cas9介导的ES细胞打靶技术构建了Rbbp4条件性敲除的ES细胞系,通过瞬时表达Cre重组酶72小时后,获得Rbbp4敲除的ES细胞。我们发现Rbbp4敲除的ES细胞生长缓慢,多能性丧失且有致命的分化表型。为了揭示Rbbp4缺失的ES细胞多能性丧失的分子机制,我们利用RNA-seq分析了Rbbp4缺失ES细胞的表达谱,发现Rbbp4敲除导致核心多能因子表达剧烈减少和早期中内胚层谱系基因的上升。结合已发表的RNA-seq数据,我们发现Rbbp4缺失变化的基因与PRC2核心成员(Ezh2、Suz12、Eed)以及ES细胞核心多能因子(Oct4、Sox2、Nanog)的靶基因有相当一部分的重叠。为进一步探索在维持ES细胞多能性状态中RBBP4直接调控的基因,我们利用染色质免疫沉淀(Ch IP-seq)技术分析了RBBP4直接调控的靶基因,发现RBBP4可直接抑制Brachyury、Tbx2、Sox17、Gata4等中内胚层谱系基因。并且有趣的是,RBBP4也可直接激活多能因子Oct4和Sox2。进一步体内和体外分化实验中发现,Oct4和Sox2的强制共表达完全挽救了Rbbp4缺失的ES细胞的多能性。另外在PRC2中为了探究各个成员维持ES细胞多能性的能力,我们利用CRISPR/Cas9技术建立了单个或组合敲除的ES细胞系,我们发现PRC2核心亚基(除RBBP4外)和非核心亚基的任何一个组份的缺失都不影响ES细胞的自我更新和多能性。蛋白组学研究表明RBBP4与核心PRC2成员EZH1/2,SUZ12,EED结合,Rbbp4敲除并不影响PRC2的稳定性以及PRC2各个成员蛋白的表达,但RBBP4可通过招募PRC2复合物到早期中内胚层谱系基因的启动子区抑制基因表达。综上所述,本研究表明Rbbp4对于ES细胞多能性维持至关重要。在维持ES细胞多能性状态中,Rbbp4具有双重作用:一方面通过调控Oct4和Sox2等多能因子的表达来维持多能性;另一方面通过招募PRC2抑制中内胚层谱系特异性基因的表达。

关键词： 干细胞分化   巨噬细胞   转录因子   CRISPRa  

摘要： 巨噬细胞广泛存在于人体各种组织中,是免疫系统重要的组成部分。目前对于人类巨噬细胞的大部分研究都源于小鼠模型,但小鼠和人类的巨噬细胞在功能上存在很大的差异。而传统的人源供体和化学分子诱导人多能干细胞分化获得巨噬细胞的方法依然有一定的局限性。因此迫切需要建立一个提供稳定来源的人类巨噬细胞的方法,用于研究人类巨噬细胞的功能和相关疾病模型。这里,我们利用CRISPRa激活内源性转录因子进而诱导人类胚胎干细胞向巨噬细胞分化。通过比较分析人类胚胎干细胞和巨噬细胞的转录组差异,同时对已发表文献的交叉比对,筛选并确定与巨噬细胞分化有关的候选转录因子,包括CEBPA、CEBPB、SPI1和RUNX1。利用CRISPRa激活候选转录因子并且确定不同sg RNA的激活效率后,我们筛选出激活效果最佳的sg RNA导入人类胚胎干细胞,在不同时间点收集RNA样品进行RNA-seq。通过对测序数据的分析发现,对比对照组,CRISPRa在人类胚胎干细胞内激活了4种转录因子基因,进一步的分析结果显示激活RUNX1的第4天引起人类胚胎干细胞明显的分化。综合细胞形态变化、主成分分析和转录组差异化分析,我们确定了RUNX1引发了人类胚胎干细胞的上皮间充质转变,这是多能干细胞分化成巨噬细胞的过渡状态。该研究筛选了巨噬细胞关键转录因子,并利用遗传学方法在人胚胎干细胞中成功激活了这些转录因子,通过激活单个转录因子诱导人胚胎干细胞向巨噬细胞方向的分化方法,为建立人巨噬细胞分化模型提供了参考。

关键词： 间充质干细胞   细胞焦亡   缺血性脑卒中  

摘要： 目的:缺血性脑卒中是脑血管病变导致的一系列神经功能障碍的疾病,现已成为全球人类健康以及影响生存质量的重大疾病隐患,且其发病呈每年递增趋势。由于其狭窄的治疗窗口,使大量患者错过了治疗时机而遗留终身残疾。研究表明,间充质干细胞疗法能促进缺血性脑卒中后的恢复,但机制目前尚不明确。有研究表明细胞焦亡在缺血性脑卒中的神经损伤过程中发挥重要作用。因此,本研究探讨了人胚胎干细胞来源的间充质干细胞()(hES-MSC)移植治疗是否能通过抑制细胞焦亡来减轻急性缺血性脑卒中后的神经损伤。方法:采用大脑中动脉闭塞法(MCAO)制作大鼠缺血再灌注模型(t MCAO),在缺血1.5小时后,拔出线栓,再灌注24小时。运用量表对手术大鼠进行神经功能评分来判断造模是否成功。选评分在7～12分的大鼠随机分为3组(n=14),另设1组假手术组(n=12),分别经尾静脉注射人胚胎干细胞来源的间充质干细胞(hES-MSCs)、磷酸盐缓冲液(PBS)、以及NLRP3抑制剂(MCC950);为评价治疗效果,在t MCAO后第1、3、6天进行行为学评分(m NSS),第3天利用TTC染色分析脑梗死体积,第7天对Neu N,GFAP,DCX,NLRP3免疫组化标记,对Brd U/Neu N,Brd U/GFAP,Brd U/Iba1进行免疫荧光双染标记。t MCAO后第7天Western blot分析NLRP3,caspase-1,ASC蛋白表达水平,以及使用PCR检测NLRP3,caspase-1,ASC,IL-1β,IL-18 m RNA表达水平。结果:(1)在t MCAO后第3、7天,hES-MSC组行为学评分低于对照组(P<0.05)且梗死体积减少(P<0.05)。(2)hES-MSC促进神经元细胞的存活(P<0.05),并且促进神经元细胞增殖(P<0.05)。(3)hES-MSC抑制胶质细胞的活化及增殖(P<0.05)。(4)hES-MSC抑制NLRP3,caspase-1,ASC m RNA及IL-18,IL-1βm RNA上调(P<0.05),并且减少炎症小体蛋白表达(P<0.05)。(5)NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡加剧缺血性脑卒中后的神经功能损伤,并且促进胶质细胞的活化及增殖(P<0.05)。结论:hES-MSC通过抑制NLRP3炎症小体产生的细胞焦亡来减轻缺血性脑卒中后的神经功能损伤。