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关键词： 胚胎干细胞   primed   na(?)ve   多能性转变  

摘要： 在胚胎发育的过程中存在着不同阶段不同状态的干细胞,na（?）ve状态和primed状态是目前研究较多的两种不同状态的胚胎干细胞,na（?）ve状态和primed状态的胚胎干细胞在细胞形态、培养条件以及基因表达等方面都有着明显的差异。当前的研究普遍认为,na（?）ve状态的胚胎干细胞比primed状态具有更好的发育潜能,能够进行异种嵌合。许多科学家致力于研究胚胎干细胞primed状态向na（?）ve状态转变,获得具有更好发育潜能的na（?）ve状态的胚胎干细胞。利用小鼠或人胚胎干细胞通过异种嵌合获得组织或器官,该方向具有很大研究价值和应用前景,尤其是人胚胎干细胞,异种嵌合获得人源化的组织和器官,将为未来的医疗事业提供更多的选择。因此,揭示primed状态向na（?）ve状态转变的机制具有重要意义。当前对于na（?）ve和primed胚胎性状态的机制研究主要集中于分子水平,而在亚细胞水平研究相对较少。本研究主要致力于在primed状态向na（?）ve状态转变体系中进行药物筛选,包括钙信号、氧信号、细胞自噬以及线粒体未折叠蛋白反应等的相关药物,旨在找到有助于获得更高质量的na（?）ve状态的胚胎干细胞。 本研究在诱导表达Klf4促进小鼠胚胎干细胞primed状态向na（?）ve状态转变体系的基础上,对氧信号、细胞自噬、线粒体动力学、线粒体UPR以及细胞能量调控信号进行了药物筛选。经过筛选我们发现,在PNT转变8天后,L型钙离子通道的激动剂Bay-k8644与AMPK信号抑制剂Dorsomorphin处理后,GFP阳性克隆较对照组显著增加,而其他用于筛选的药物均对小鼠胚胎干细胞primed向na（?）ve的转变无促进作用;接着我们构建了检测胞质内Ca2+的探针,通过激光共聚焦显微镜进行拍摄并统计荧光强度,发现Bay-k8644药物处理后,平均荧光强度增加,说明胞质内Ca2+增加;通过蛋白质免疫印迹实验,我们发现Bay-k8644药物处理后Atp2b1蛋白表达降低,β-catenin蛋白表达增加,ERK的磷酸化降低,说明Ca2+外流减少,胞质内钙离子升高可能通过钙离子相关通路影响β-catenin和ERK信号通路。另外,我们也建立了人胚胎干细胞primed向na（?）ve状态转变的体系,探究在小鼠体系中的促进机制是否同样存在于人胚胎干细胞体系。 综上所述,Bay-k8644和Dorsomorphin可以促进小鼠胚胎干细胞primed状态向na（?）ve状态转变;且Bay-k8644可增加胞质内钙离子浓度,减少Ca2+外流,与细胞干性密切相关的蛋白β-catenin蛋白表达增加,ERK蛋白磷酸化被抑制,表明胞质内钙离子升高可能通过钙离子相关通路影响β-catenin和ERK信号通路,具体的机制需要我们进一步的研究。并且成功建立人胚胎干细胞primed状态向na（?）ve状态的转变体系。

关键词： 人胚胎干细胞   双酚类化合物   肝脏毒性   神经毒性   干细胞模型优化  

摘要： 现代科学技术发展速度惊人，各种新型化合物也随着现代科技的迅猛势头呈井喷式增加。因此，开发高通量的研究模型成为毒理学研究的当务之急。　　人胚胎干细胞是能自我无限增殖和分化成人体不同谱系细胞的一类细胞。因此，基于人胚胎干细胞的毒理学检测模型可以高效地对未知物质进行细胞毒性、胚胎毒性、发育毒性与功能毒性的多方面毒理学评价。同时，相比于动物实验和常规癌细胞实验，人胚胎干细胞不仅更加贴近人体真实的正常生理状况，也可在较短时间内进行多种化合物的多靶点检测。由此可见，基于人胚胎干细胞的毒理学评价模型具有明显的优势。　　在众多新型化合物中，双酚A作为一种工业原料，被广泛应用于日常生活生产中，研究表明其存在内分泌干扰、致癌、引起发育障碍等健康风险。因此，随着人们对双酚A毒性效应研究的逐渐深入，其在多国已被限制使用。然而，替代双酚A应用于工业制造的双酚类化合物却在未经完善的安全评价之前，大量生产并广泛使用。目前，流行病学研究报告在环境和人体样品中均可检测到多种双酚类化合物。由此，双酚A替代物的健康风险评估亟待完善。　　本文利用基于人胚胎干细胞的多向分化模型即拟胚体分化模型、肝分化模型与神经分化模型，结合转录组测序技术和高内涵技术，评价了双酚A及其六种替代物(双酚S、双酚F、双酚Z、双酚B、双酚E和双酚AF)潜在的健康风险。在研究过程中，本文还优化了干细胞毒理学评价模型，以便更好地筛查未知污染物的毒性效应。　　本文研究内容主要包含以下四个部分:　　1、双酚类化合物的胚胎发育毒性研究。这部分实验利用拟胚体分化技术，全面研究双酚类化合物在多向分化系统中对早期胚胎发育的影响。结果显示低浓度双酚类化合物在拟胚体分化过程中影响部分基因表达和许多生物通路。双酚类化合物影响的基因数量不同(双酚S(185)、A(135)、B(131)、E(103)、Z(103)、AF(60)、F(57))，且上调的基因数量超过下调的基因数量。发现主要受到干扰的效应基因为APO家族基因(APOA4、APOC3、APOA2、APOA1和APOB）与肝脏标志基因(AFP、FGA、FGB、FGG、TF和SERPINA1)。双酚类化合物还显著影响了胚胎发育过程(CellFateCommitment、EmbryoDevelopment等)、脂代谢过程（CholesterolMetabolism、LipaseInhibitorActivity等）、神经发育过程（NeuronFateCommitment、Neurogenesis等）、PPAR信号通路和Hedgehog信号通路。推测双酚类化合物可能有相对特定的效应靶点，在第3和4章进行相关定向分化模型进一步探究与验证。综合七种双酚类化合物的毒性效应，双酚E影响相对最小，提示双酚E未来作为双酚A的替代物应用可能相对安全。　　2、双酚类化合物的肝发育毒性研究。由于在拟胚体多向分化模型中发现双酚类化合物干扰了脂代谢相关基因和通路，且肝脏和脂肪均是脂代谢的主要场所。因此实验利用转录组数据深入分析肝脏与脂肪组织特异基因和差异表达基因的变化情况，从而确定了使用肝分化模型对双酚类化合物毒性进行深入探索。实验发现低浓度双酚类化合物没有显著干扰肝脏标志物基因与蛋白的表达量（HNF4A、AFP、ALB、FGA、FGB、FGG、PROX1和TBX3等）、及肝实质细胞功能（脂肪储存）。深入探究发现双酚类化合物可能通过干扰早期胚胎发育阶段的细胞命运决定，从而导致腊代谢相关基因与通路受到影响，且这些效应主要表现为HOX和APO家族基因的失调。强调双酚类化合物对于早期发育阶段的影响是值得重视的。此外，双酚E表现出相对最弱的毒性效应，提示双酚E可能是相对安全的替代物之一。　　3、双酚类化合物的神经发育毒性研究。除对脂代谢影响外，由于在拟胚体的多向分化实验中发现双酚类化合物对神经发生相关通路有干扰，且前期基于小鼠胚胎干细胞模型显示双酚A、S和F会显著影响轴突导向。因此本部分实验关注双酚类化合物对早期神经发育过程以及神经突发生过程的影响。结果显示，低剂量双酚类化合物没有明显影响神经发育(SOX1、SOX3、NES和PAX6等)、调控神经发生的WNT与NOTCH通路效应基因（AXIN2、LEF1、HES1和HES5等）及细胞骨架相关基因和蛋白（TUBB3、TAU、GAP43和CDC42）的表达量，但会改变神经细胞的形态，即出现神经突长度显著变短、胞体扩大的现象。表明双酚类化合物可能通过改变神经突长度致使神经系统受损。至此，双酚A与其六种替代物均表现出相似的毒性效应，在神经毒性方面，六种双酚A替代物均不安全。　　4、优化基于干细胞的毒理学评价模型。由于实验中发现毒理学评价模型可进行优化以更好适应于高通量多靶点的检测需求，本部分实验优化了三维细胞球制造、医用材料安全性筛查以及皮肤模型的实

关键词： 表观遗传   DNA甲基化   5-羟甲基胞嘧啶   DNA测序  

摘要： DNA甲基化是表观遗传中很重要的一部分，它能够在不改变DNA序列的情况下来控制基因的表达，从而使基因沉默、激活。DNA甲基化和去甲基化是一个动态过程，通过超高效液相色谱串联质谱方法(UHPLC-MS/MS)对过程中的5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)定量检测，可以发现它主要分布在哺乳细胞中。但这只能确定其含量，并不能确定甲基化位点具体在哪一段基因上，往往某一段基因上的DNA甲基化会导致疾病的产生或者影响生物体的生长发育。因此，为了更深入了解DNA甲基化的作用和功能，我们需要对其具体的位点进行精确定位。本文着眼于甲基化胞嘧啶中碱基上所含官能团在化学性质上的明显区别，开发对修饰碱基特异性的化学反应来对它们进行检测，研究开发基于化学反应的5-羟甲基胞嘧啶测序法，主要内容分为以下三个部分:　　第一部分:以KRuO4氧化和Friedl(a)nder反应为基础，开发了两步法的5hmC测序方法。我们以探针5hmC-ODN为研究对象，进行KRuO4氧化，优化出了最佳反应时间和KRuO4浓度，通过UHPLC-MS/MS定量分析，证明95.5％的5hmC氧化成5-醛基胞嘧啶(5fC)。琼脂糖凝胶电泳实验说明反应没有造成DNA的明显降解。然后以KRuO4氧化得到的5fC-ODN为研究对象，与不同的偶联剂进行反应，优化反应时间、反应温度、碱的种类等反应条件，筛选得到了偶联剂1-苊酮，它能与反应得到的5fC-ODN反应完全。超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱(UHPLC-Q-TOF-MS/MS)鉴定产物为5fC-A，测序确定5fC-A能够被识别成T，整个反应5hmC-to-T的转化率为86％。通过这一方法，我们能够在不影响其它修饰胞嘧啶的情况下实现5hmC的单碱基测序，且不需要重亚硫酸盐的参与。　　第二部分:以indirect-Friedl(a)nder反应为基础，开发了一步法的5hmC测序方法。通过测序我们发现偶联反应后的5hmC经过PCR后能够被识别成T，这一结果促使我们进一步对反应优化，以取得更高的C-T转化率。我们优化了五种偶联剂，UHPLC-MS/MS对5hmC转化率评价证明苯乙酮为最优偶联剂。通过优化反应时间、温度等条件，确定反应温度为90℃，反应时间为2h，此时5hmC转化率为84.3％，C-T转化率为41.1％。为了确定反应产物，我们用探针11mer5hmC-ODN进行反应，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对反应产物进行了鉴定，确定生成了目标产物11mer5hmC-A-ODN，并在此基础上提出了可能的反应机理。该方法时间短，操作简便，为全基因组中5hmC的检测提供了新思路，可替代传统的重亚硫酸盐法。　　第三部分:选择TiO2作为氧化剂用于光催化氧化5hmC，发现5hmC单体能够被选择性氧化成5fC，而其它修饰胞嘧啶不受影响。在此基础上，我们进一步将TiO2用于氧化5hmC探针。通过不断优化反应条件，确定在365nm的紫外光下，1mg/mL的TiO2在pH为12的50％乙醇溶液中，5hmC能够被选择性地氧化成5fC，通过UHPLC-MS/MS确定5hmC转化率为94.2％，5fC的产率为87.6％。最后得到的5fC-ODN用于丙二腈偶联，产物经过PCR后原5hmC位点会被识别成T，当使用Phusion高保真聚合酶时，得到的5hmC-to-T转化率最高，为48.3％。与传统的KRuO4氧化剂相比，材料廉价易得，反应后产物容易分离，该方法引入了光催化材料，为此类材料在生物领域的应用提供了一种新的方向。

关键词： 小鼠胚胎干细胞   早期胚胎   多能性   p-H2AX   抗损伤能力  

摘要： 小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)是从小鼠囊胚的内细胞团分离获得。本研究室建立的培养体系“Activin A+BMP4+CHIR99021+LIF”(ABC/L)获得的小鼠多能干细胞(ASCs)具有高甲基化、四倍体补偿能力、且由单细胞可得到嵌合体小鼠。本研究首次利用ABC/L培养体系建立来源于不同发育时期胚胎的干细胞系,包括2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑葚胚、囊胚及E 5.5早期原肠胚,然后对建立的ABC/L胚胎干细胞系(ABC/L-ESCs)的多能性进行检测及研究,最后将已建立的细胞系进行多聚甲醛损伤后,观察细胞的抗损伤情况。具体实验结果如下:1.利用ABC/L培养体系建立来源于不同发育时期胚胎的干细胞系利用ABC/L建立不同发育时期的小鼠新型胚胎干细胞,包括2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑葚胚、囊胚、E 5.5原肠胚,建系率分别是12.5%、25%、10.9%、28.6%、10%和6.67%。结果显示ABC/L-ESCs的AP染色均为阳性。通过细胞生长曲线和单细胞形成克隆效率与对照组(2i/L-ESCs)相比较,ABC/L-ESCs的生长速率及单细胞形成克隆效率较高。2.新型胚胎干细胞系的生物特性及多能性分析通过核型分析鉴定ABC/L-ESCs(来源于2-细胞)染色体数目为40条的比例为77.22%。在RNA表达水平上,与对照组2i/L-ESCs相比,ABC/L-ESCs的多能性基因Oct4和Sox2表达显著较高。其中,中胚层的标记基因T表达水平在不同时期来源的干细胞系中表达有如下特点:升高(来源于2-细胞)-降低(来源于4-细胞)-升高(来源于8-细胞)-降低(来源于桑葚胚),表明T基因可能在胚胎不同发育时期中起着不同的作用。同时部分细胞系(来源于2-细胞、8-细胞和桑葚胚)高表达DNA甲基化相关的基因(Dnmt3a、Dnmt3b、Dnmt3L)。通过免疫荧光染色显示多能性蛋白OCT4和SOX2在所有ABC/L-ESCs中表达,且部分细胞系表达中胚层标志蛋白T,这与RT-q PCR的结果一致。体外分化实验证明ABC/LESCs(来源于2-细胞)具有分化为三胚层的能力,同时细胞系可嵌合至小鼠的胎儿和卵黄囊组织。***/L-ESCs抗损伤能力的检测将相同数量的来源于囊胚期ABC/L-ESCs和2i/L-ESCs置于不同浓度的多聚甲醛中,对细胞进行损伤实验。在恢复的第4天后,发现ABC/L-ESCs存活数量显著多于2i/L-ESCs存活数量。在相同浓度和相同时间损伤后,Western Blotting证明与2i/L-ESCs相比较ABC/L-ESCs表达低水平的p-H2AX(DNA损伤标志性蛋白),两者在恢复和对损伤反应的时间完全不同,ABC/L-ESCs比2i/L-ESCs在面对PFA损伤后反应更加敏感且抗损伤能力更强。综上所述,ABC/L干细胞培养体系能够维持来源于不同发育时期胚胎建立的干细胞系的自我更新、多能性及体外分化能力,与2i/L-ESCs相比较具有更强的抗损伤能力。本研究为研究维持干细胞自我更新及多能性提供了新思路,并且还可以为干细胞治疗疾病提供了新途径。

关键词： 生长素诱导降解系统   小鼠胚胎干细胞   CRISPR/Cas9   Oct4  

摘要： 有效地敲除或降解蛋白对于探究目标蛋白在细胞发育过程中的功能至关重要。传统的基因敲除方式作用缓慢,对于研究细胞短时间内发生的直接表型变化存在局限性。生长素诱导降解系统可以快速可逆的降解目标蛋白质,该系统已被广泛应用于研究真核细胞和模式生物中的基因功能。本研究利用CRISPR/Cas9 技术构建了 AID(auxin-inducible degron)标记的Mpp8,Fam208a 及Dpf2 小鼠胚胎干细胞系(mouse embryonic stem cell,mESCs),在生长素IAA(Indole-3-acetic acid)诱导下,mAID标记的蛋白均被快速降解。AID系统存在基础降解现象和双等位基因标记效率低的缺陷,我们对一种新型的AtAFB2-miniIAA7方法在克服基础降解方面的功能进行了探究。最后,我们开发了一种新的方法,通过抑制内源性Oct4或Nanog基因的表达,并同时过表达外源OCT4-mAID或NANOG-mAID融合蛋白来维持胚胎干细胞的干性,从而成功的构建了胚胎干细胞中关键多能因子OCT4-AID和NANOG-AID细胞系。我们的策略不仅能有效地解决靶蛋白的基础降解,还避免了传统AID系统中mAID在内源性靶位点双等位基因敲入效率低的缺陷,从而为利用AID系统研究胚胎干细胞和其他类型细胞的关键基因提供了一种有效地新途径。

关键词： 植物基因工程  

ISBN: (纸本)9787518981229

摘要： 本书是植物学方面的著作，由植物细胞与组织、植物的形态结构、植物的生长发育及其调控、植物的繁殖、植物基因组与基因组学、植物基因工程的工具酶、植物基因工程及应用、植物基因工程与生物信息学等部分组成。本书以植物个体发育和系统演化为主线组织内容，系统介绍植物科学的全貌，突出植物学知识的基础性和综合性；深入浅出地介绍植物基因工程相关知识，分析植物基因工程的应用现状，注重理论与生产实际的结合。本书可供植物学专业的教师、学生及其他生物学从业者学习和参考。

关键词： 高粱   转基因   籽粒营养品质   游离赖氨酸   农艺性状  

摘要： 选育高赖氨酸含量的高粱品种一直是重要的育种目标。然而,由于控制籽粒赖氨酸含量的基因与籽粒皱缩紧密连锁,使得常规育种一直没有突破。本研究利用基因工程的手段,将控制籽粒赖氨酸合成和降解的基因AK、DHPS和RNAi-LKR基因导入高粱,通过修饰代谢工程的途径,提高高粱籽粒赖氨酸的含量。通过测定不同转基因株系高粱籽粒赖氨酸含量以及高粱籽粒理化性质,并对农艺性状进行评价,为进一步筛选高赖氨酸含量高粱提供理论依据和种质资源。主要研究结果如下:采用超声波花粉介导法成功将p SB2250载体转入到高粱中,经过PCR鉴定,得到14个转基因高粱株系,转化率为16.47%。通过实时荧光定量PCR测定10株转基因高粱的基因表达量,发现其中8株AK基因和5株DHPS表达量提高,范围分别在24%-31%和11%-23%;10株RNAi-LKR基因表达量降低,范围在7%-29%。运用氨基酸分析仪测定高粱籽粒的结合态和游离态氨基酸含量。与野生型相比,发现转基因SX260的结合态氨基酸含量提高15.92%,结合态赖氨酸含量提高7.12%;游离态氨基酸含量提高16.01%-35.69%,游离赖氨酸含量提高12.95%-59.72%。转基因晋梁五的游离态氨基酸含量提高22%-150%,游离态赖氨酸含量提高13.24%-84.31%。其他游离氨基酸,如谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸的含量也显著增加。综上所述:与结合态氨基酸相比,转基因高粱籽粒游离态氨基酸含量显著提高,可提高达150%;游离赖氨酸含量比野生型提高84.31%。通过谷物分析仪对高粱籽粒主要理化性质进行测定。测定的58份转基因材料中有25份蛋白含量比野生型提高,淀粉含量变化范围在1.2%-3.5%,脂肪和单宁含量均比野生型显著提高。田间调查实验发现:与野生型相比,转基因SX260的农艺性状差异不显著;晋梁五的株高显著变高,穗长变短,穗重减少,但籽粒表型未见差异。