关键词：
贻贝粘胶蛋白
基因工程
大肠杆菌表达系统
酪氨酸酶
粘附性能
摘要：
贻贝足丝蛋白是海洋贻贝足丝腺分泌的一类能够在水环境中牢固粘附于礁石、船体等不同材料表面的复合蛋白簇,不仅具有高强度、高韧性、极强的防水性和广泛的基材粘附性,还具有良好的生物相容性和可降解性,这些显著优势使其在医药、海洋工程、有机涂料等领域具有广泛而独特的应用前景。早期人们用化学提取法从天然贻贝中获取贻贝足丝蛋白,但产量极低,成本昂贵,难以满足工业需求;后续又发展出通过人工合成方法制备类似贻贝粘胶的水凝胶,但其生物相容性不佳,应用领域受限。近年,学者开始运用基因工程方法生产贻贝粘胶蛋白,取得了一定进展,但仍难以大规模制备贻贝粘胶蛋白。为此,本论文基于前人的研究并考虑工程应用的实际需求,探讨通过基因工程方法在原核表达系统中构建了贻贝足丝蛋白及其融合蛋白表达菌株,并通过体内体外协同氧化方式对贻贝粘胶蛋白进行残基修饰,提高其粘附性能,以期满足工程应用需求。主要研究内容及结果摘要如下:(1)以贻贝足丝蛋白家族中富含酪氨酸的地中海紫色贻贝足丝蛋白5(Mgfp-5)为核心,运用基因工程技术设计融合基因,构建了p ET28a-mgfp-5、p ET28a-mgfp-151、p ET28a-mgfp-5-lc和p ET28a-mgfp-151-lc四种含有贻贝粘胶蛋白基因的表达载体,最终获得系列高表达菌株。在菌液OD≈0.8时开始诱导,诱导剂IPTG浓度为1 mM、诱导温度为37°C,诱导时间为6～8 h,此时蛋白表达量相对较高;四种贻贝粘胶蛋白M5、M151、5LC、151LC的粗蛋白产率分别约为170.55 mg/L、193.47 mg/L、203.10 mg/L和200.80 mg/L。然后,收集破碎上清液,经Ni柱纯化,用8 M尿素洗脱,得到贻贝粘胶蛋白纯溶液,对应的回收率分别为12.59%、11.97%、12.83%和14.46%。(2)以绿色荧光蛋白(eGFP)、红色荧光蛋白(RFP)作为报告蛋白验证了p ET28a和p ACYCDuet-1载体在大肠杆菌中共表达的可行性。在此基础上,将贻贝粘胶蛋白基因和酪氨酸酶基因分别克隆至上述载体中,成功构建了贻贝粘胶蛋白体内氧化系统,实现了对上述四种贻贝粘胶蛋白的体内氧化。以原始贻贝粘胶蛋白中3,4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)的含量为基准,共表达体系中四种贻贝粘胶蛋白M5、M151、5LC、151LC中DOPA的含量分别提高了4.4、3.3、5.0和5.3倍。(3)构建了另一种酪氨酸酶工程菌,探究了酪氨酸酶体外氧化条件,发现在底物浓度为2 m M、p H值为4～7时,获得的酪氨酸酶表现出较为稳定的氧化效果,均能在4 h内达到从酪氨酸到DOPA的最大氧化率(45%)。在此条件下,对贻贝粘胶蛋白进行体外氧化修饰,结果显示与未氧化的蛋白相比,只经过体外氧化的四种贻贝粘胶蛋白M5、M151、5LC、151LC中DOPA的含量分别提高了7.9、8.9、12.0和10.8倍;而经过体内体外协同氧化的四种贻贝粘胶蛋白中DOPA的含量分别提高了20.8、22.7、21.0和22.1倍,是仅体内氧化的4～5倍。同时,四种贻贝粘胶蛋白经过体内体外协同氧化后的酪氨酸氧化率分别达到9.06%、11.76%、11.80%和10.57%。(4)贻贝粘胶蛋白的粘附性能测试。利用梯度浓度尿素溶液对纯化后的贻贝粘胶蛋白洗脱液进行透析复性,冷冻干燥得到不同处理下的纯蛋白粉末,用万能试验机进行粘附性能测试,结果表明通过体内体外协同氧化,可将贻贝粘胶蛋白的粘附性能平均提高约5倍,最大粘附性能可达0.74 MPa,同时表明贻贝粘胶蛋白的粘附性能与DOPA的含量呈明显正相关关系。
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