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关键词： 胚胎干细胞   人胶质瘤细胞   PI3K/AKT信号通路   微环境   SH-SY5Y  

摘要： 第一部分为探讨干细胞微环境治疗帕金森疾病的可行性及可能机制。方法:实验分四组,以单独培养的SH-SY5Y细胞为空白对照组(SH组);SH-SY5Y与ES按3:1比例间接共培养组(SE组);SH-SY5Y与ES按3:1共培养后加MPP+化疗药(SEM组);SH-SY5Y加MPP化疗药阳性对照组(SM组);四组均于培养72h后收获SH-SY5Y细胞,分别行细胞增殖实验、细胞凋亡实验、活性氧检测、实时定量反转录聚合酶链式反应(quantitative real-time RT-PCR,qPCR)、蛋白质免疫印迹实验(Western Blot,WB),研究胚胎干细胞对SH-SY5Y胶质瘤细胞生物学功能和JNK/P53/Bax信号通路的影响,比较各组间差异。结果:ESc微环境促进MPP+诱导损伤的SH-SY5Y细胞凋亡进展,加速SH-SY5Y细胞死亡。ES与SH-SY5Y共培养组活性氧(ROS)表达明显增加,且凋亡相关蛋白JNK、P53、Bax表达增加。结论:ESc可以通过JNK/P53/Bax通路促进SH-SY5Y细胞凋亡,具有治疗神经母细胞瘤的潜能。第二部分研究目的:探讨胚胎干细胞微环境降低人胶质瘤恶性程度的可能机制及治疗方法。研究方法:选择神经系统最常见的恶性肿瘤细胞系,胶质瘤母细胞系(U118),实验总共分为四组,以单独培养的胶质瘤细胞(U118)为空白对照组(GB);U118与ES按3:1比例直接混合共培养组(GE);U118与ES按3:1共培养后加PI3K激动剂(GA);U118加替莫唑胺化疗药阳性对照组(GT);四组均于培养72h后收获U118细胞,分别行细胞增殖实验、细胞凋亡实验、活性氧检测、微血管生成拟态实验、实时定量反转录聚合酶链式反应(quantitative real-time RT-PCR,qPCR)、蛋白质免疫印迹实验(Western Blot,WB)研究胚胎干细胞对U118胶质瘤细胞生物学功能和PI3K/AKT信号通路的影响,比较各组间差异。结果:GE共培养组及化疗药物对照组与空白对照组GB相比,共培养组及化疗药物组细胞增殖能力均减弱、凋亡增多、活性氧增多、血管生成拟态形成减少甚至消失,促进肿瘤增生蛋白如Cyclin B、Cyclin D明显减少,而促进肿瘤细胞凋亡及抑制增生的相关蛋白如BAX、BCL-2、P53、Caspase3和Gsk-3B、P21、P27的表达明显增多,有明显统计学差异,PI3K/AKT通路中正性调节因子PI3K、PDK、AKT、mTOR等表达减少,负性调控因子PTEN表达增多,差异均有统计学意义;而加PI3K激动剂组(GA)较共培养GE组正性调节因子表达增多且负性调节因子减少,差异有统计学意义。结论:胚胎干细胞微环境通过下调PI3K/AKT信号通路、抑制肿瘤细胞增殖、抑制蛋白合成、促进肿瘤细胞凋亡,降低胶质瘤恶性程度。

关键词： 胚胎干细胞   硅酸钙浸出液   基底硬度   肝向分化   定型内胚层  

摘要： 干细胞是一种具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的早期未分化细胞，在特定条件下可分化成不同的功能细胞，形成组织和器官。胚胎干细胞(ESCs)是可以在体内外分化为内、中、外三个胚层的几乎所有类型细胞的多潜能干细胞，既可作为细胞分化和发育调控机制的体外研究模型，亦可用作细胞治疗及组织器官构建的种子细胞，使其成为研究的热点。模拟体内ESCs生长微环境中化学、物理因素，可探究其对ESCs定向分化的影响，提升分化效率和细胞成熟度。无机纳米粒子硅酸钙(CS)，已被证实能够促进间充质干细胞的成骨向分化，但其对人ESCs(hESCs)的分化（尤其是肝向分化）是否具有调控作用还鲜有研究;基底硬度作为典型的生理力学调控因素，对hESCs分化调控的作用亦不明朗。因此本文从细胞生长的生物化学因素(CS浸出液)及基于生理病理的力学微环境（基底硬度）两方面分别探究hESCs的定向分化，分述如下:　　***浸出液对hESCs肝向分化的影响　　在优化的hESCs(H9细胞系)分化诱导方案，即干性维持阶段(STEM)→定型内胚层阶段(DE)→前体肝细胞阶段(Pre-H)→成熟肝细胞阶段(M-H)，的不同阶段，分别加入高(1/64)、低(1/256)两种不同稀释浓度CS浸出液，研究hESCs不同分化阶段对CS添加顺序和浓度的依赖性。结果表明，分化的前两个阶段，高浓度浸出液可迅速启动分化，而低浓度浸出液则有利于持续性的DE向分化。基于此，筛选出hESCs肝向分化的四个阶段最适的CS添加方式及浓度组合条件，所得到的肝细胞能显著改善CCl4注射小鼠的早期肝纤维化症状。上述研究揭示了CS浸出液浓度与作用阶段对hESCs肝向分化的贡献，确定CS促分化的最适添加条件，验证了所获得的肝细胞对疾病模型的治疗作用。　　2.基底-细胞间粘附影响hESCs的DE向分化机制　　基底-细胞间粘附是hESCs(H1细胞系)维持干性和启动分化的重要力学因素。使用硬度可调的聚丙烯酰胺水凝胶、制备了可模拟生理/病理条件下肝脏硬度的三种基底(0.14kPa、6.1kPa、46.7kPa)，将接种于其上的H1细胞系定向诱导分化为DE细胞。结果表明，随着硬度的增加，DE分化标志物增加，基底-细胞间β1-integrin、粘着斑组成蛋白vinculin、磷酸化FAK的表达量增加、细胞受到基底的牵引力变大，力学敏感蛋白YAP的活化入核比例升高。阻断β1-integrin后DE分化减弱、解聚F-actin纤维、或使用YAP小分子抑制剂，均可促进YAP活化、增强hESCs的DE向分化。硬基底可增强YAP活化并入核、进而促进H1分化为DE细胞;在ESCs的DE向分化过程中不同硬度基底上细胞所受牵引力与YAP活化呈现正相关。上述研究深化了对基底硬度调控ESCs向DE细胞分化的生物力学机制的认识。　　综上，本文通过CS浸出液和基底硬度对胚胎干细胞H9/H1细胞系肝向分化进行调控的研究，证实了CS能够促进ESCs体外肝向分化，验证了基底硬度通过β1-整合素调控细胞牵引力、并影响干细胞分化这一作用机制，揭示了YAP活化对ESCs向DE细胞分化的促进作用及YAP活化与牵引力之间的正相关关系。以上研究丰富了对ESCs肝向分化的力学-化学-生物学耦合规律的认识。

关键词： 卵巢癌   早期诊断   二代测序   线粒体DNA突变   mtDNA拷贝数  

摘要： 背景 卵巢癌（Ovarian Cancer,OC）是常见的妇科恶性肿瘤之一,因早期患者缺乏典型症状以及临床中尚无有效的早期诊断方式,导致约75%的患者确诊时已处于中晚期。据报道,早期患者5年生存率可达71-89%,而晚期患者仅为31%。现阶段临床常用的卵巢癌辅助诊断方法主要为血清学检测和经阴道B超检查（transvaginal sonograph,TVS）,但在早期诊断中其灵敏度和特异度低。因此寻找卵巢癌早期诊断标志物,准确识别患者并及时干预,从而实现患者生存期的延长,具有重要的临床意义。线粒体广泛存在于所有真核细胞中,是给细胞提供能量的重要细胞器。线粒体中特有的DNA（mtDNA）,具有基因组小、拷贝数多和突变率高等特点,正在逐渐成为一种新型的肿瘤生物标志物。已有研究表明,几乎所有类型的肿瘤组织中均可检测到mtDNA变异,当mtDNA变异积累到一定程度可直接影响线粒体功能,而线粒体功能障碍被证实与肿瘤发展关系密切。另有研究发现肿瘤组织或转移灶中mtDNA可释放到外周血循环中,提示血浆中游离mtDNA（cf-mtDNA）变异检测在肿瘤早期诊断、预测和评估肿瘤进展以及转移方面有巨大的临床应用前景。 目的 1.通过病例及对照样本收集及mtDNA测序,完成卵巢癌mtDNA变异特征研究; 2.比较入组患者配对组织mtDNA及血浆cf-mtDNA拷贝数及体细胞突变情况,寻找卵巢癌cf-mtDNA特征性变异;3.结合临床信息,初步探究cf-mtDNA作为卵巢癌早期诊断标志物的可行性。 方法 1.使用西京医院HIS系统,收集于2020年05月至2020年09月间在西京医院妇产科就诊的卵巢癌患者及卵巢良性肿瘤患者手术信息,建立患者样本收集、DNA提取、DNA文库构建、mtDNA捕获及测序流程。2.分析48例良性卵巢肿瘤患者以及43例上皮性卵巢癌（Ovarian Cancer,OC）患者组织及血浆中以及19例健康志愿者血浆中mtDNA变异情况,绘制上皮性卵巢癌mtDNA特征性图谱。3.找寻OC患者血浆中组织来源的mtDNA特征性变异,并结合入组研究对象的临床资料,探究血浆cf-mtDNA特征性变异作为卵巢癌早期诊断标志物的可行性。 结果 第一部分:根据制定的纳入及排除标准,收集了2020年05月至2020年09月间在西京医院妇产科就诊的卵巢癌患者及卵巢良性肿瘤患者的新鲜样本及临床信息。通过HE染色确定肿瘤组织中癌细胞比例,仅入组癌细胞占比超过80%的样本,共入组43例OC患者及48例良性肿瘤患者。根据FIGO分期,将43例OC患者分为两组,包括17例早期（FIGO I-II期）患者及26例中晚期（FIOG III-IV期）患者。对于健康对照组,在征得本人知情同意后,仅收集来西京医院进行健康体检的健康志愿者外周血5 ml,共收集19例。最终共入组110例研究对象。对本研究中所涉及样本进行DNA提取、文库构建、mtDNA捕获及测序。对测序质量进行分析,本研究中所测样本平均测序深度大于2000X,Q30均在90%以上;所得测序结果稳定可靠,可以用来进行后续的数据分析。 第二部分:1.卵巢癌组织与良性卵巢肿瘤组织的拷贝数之间无显著差异（P=0.8341）。mtDNA拷贝数与年龄之间无相关性（P=0.7579）。早期及中晚期OC组织mtDNA拷贝数之间无显著差异（P=0.9703）。***组织样本体细胞突变异质性水平和突变数量、突变密度均显著多于良性卵巢肿瘤组（P1=0.0290;P2=0.0131）。早期及中晚期OC组织间突变数量无显著差异（P=0.7703）。***组织与良性卵巢肿瘤组织中突变密度的分布特征不同,OC组织中ATP8区域突变密度最高,在早期OC组织中更加明显。 第三部分:***患者血浆cf-mtDNA拷贝数高于良性卵巢患者及健康志愿者（P1=0.0042;P2=0.0022）。年龄与cf-mtDNA拷贝数之间无相关性(POC=0.5547)。中晚期OC患者cf-mtDNA拷贝数显著高于早期OC患者（P=0.0419）。***患者血浆中平均突变数量及突变密度显著高于良性卵巢肿瘤组及健康志愿者（P1=0.0023;P2=0.0194）。早期及中晚期OC患者cf-mtDNA平均突变数量及突变密度无显著差异（P=0.7140）。3.在OC患者血浆中,ATP8区域突变密度较高,突变密度排序高于其他两组中ATP8区域突变密度排序的位次。早期OC患者较晚期OC患者,ATP8区域突变密度排序位次更高。4.在OC患者血浆中,发现组织来源的mtDNA体细胞突变共44个,在良性卵巢患者血浆中发现组织来源的mtDNA体细胞突变共21个,OC患者与良性肿瘤患者血浆中组织来源的mtDNA突变位点只有2个重合。OC患者的44个特异性突变中,有24个来自早期O

关键词： 己二酸   反向己二酸降解途径   大肠杆菌   发酵工艺   气相检测   生物合成  

摘要： 己二酸是一种被广泛应用的大宗化学品，利用可再生资源生物法可以克服化学法生产己二酸高污染、高耗能的弊端，是当前研究的热点之一。本研究在大肠杆菌体内构建反向己二酸降解途径实现己二酸的生物合成，取得如下研究成果。　　本研究将反向己二酸降解途径分模块构建到大肠杆菌中，通过蛋白表达条件优化确定途径中五步反应对应酶同步表达条件，初次发后经气相色谱质谱联用成功检测到己二酸。　　本研究建立了基于乙酸乙酯萃取并以N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(MSTFA)试剂进行衍生化后以气相色谱检测己二酸的高灵敏度方法，检出限达0.309mg/L。　　本研究对己二酸合成途径进行调控，通过过表达编码乙酰辅酶A合成酶的acs基因构建乙酸回补途径，促进副产物乙酸向前体物质乙酰辅酶A的转化，副产物乙酸产量由1.5g/L降低至1.1g/L，但己二酸产量提高不明显。另外研究发现用lac启动子调控RADP途径相较于T7启动子有更高的己二酸产量，产量提高至1.842mg/L。　　本研究对产己二酸发酵条件进行了优化，发现通气方式及氮源种类对己二酸的积累有较大影响。以甘油为碳源的M9培养基(M9 minimal medium)进行发酵，添加终浓度为0.5mMIPTG，经37℃、18℃两段温度控制，微好氧条件下发酵，己二酸产量可达31.01mg/L，是原始工程菌产量的38倍。

关键词： 无创产前检测   cfDNA   全基因组测序   单基因病  

摘要： 目的随着孕妇血浆胎儿游离DNA的发现以来,在其基础上进行的无创产前胎儿染色体病及基因组病的检测日臻成熟,而在单基因病中的检测受到多种因素的影响未能走向临床应用。本研究旨在建立一种基于孕妇外周血血浆游离DNA的非靶向的全基因组测序方法,并将其用于单基因病无创产前检测,为未来单基因病无创产前检测的临床应用打下实验基础。方法收集孕期无创产前常见染色体非整倍体筛查阴性且胎儿无超声异常的46例家系作为健康家系进行方法学的构建和可行性分析,其中孕妇血浆游离DNA进行深度为1×至266×的全基因组测序,父母外周血细胞进行深度为1×至42×的st LFR(single-tube long fragment read)测序,胎儿脐血DNA进行深度为30×的全基因组测序并用于验证cf DNA(cell-free DNA)测序数据推断的胎儿基因结果,分析不同测序深度、胎儿浓度以及分析策略对母胎基因型推断准确性的影响。JK-4、JK-16健康家系的测序数据同时用于分析本研究对于胎儿新发突变的检测效能。同时纳入23例胎儿有单基因病风险的家系,分别进行深度为121×的孕妇血浆游游离DNA全基因组测序,深度为24×的父母外周血细胞st LFR测序以及深度为30×的胎儿产前诊断样本全基因组测序,评估cf DNA测序结果对胎儿致病性变异位点的推断准确性,评估方法学的效能。结果通过46例健康家系的测序结果分析表明,cf DNA测序深度、st LFR测序深度以及胎儿浓度分别与胎儿位点推断的准确性呈正相关,且结合父母st LFR测序数据的家系分析比单独使用cf DNA测序数据的推断准确性明显增加。对JK-4、JK-16家系胎儿新发突变的检测敏感度分别为94.6%和91.3%,阳性预测值分别为81.5%和53.9%。对23个疾病家系的孕妇血浆游离DNA高深度测序的结果进行分析,涉及的32个突变位点中包含胎儿新发突变8个、遗传突变24个,两类突变的推断准确性均为75%。结论本研究通过孕妇血浆游离DNA的高深度测序数据获得胎儿全基因组数据,可以在单碱基分辨率下不依赖父母单倍型信息准确预测胎儿的基因型,该方法在更低的测序深度下对胎儿新发突变的推断准确性较既往研究有提高,本方法未来有望用于胎儿全基因组范围的单基因病无创产前检测。

关键词： 脊髓挫伤   尼莫地平   运动   神经病理性疼痛   痉挛   脊髓挫伤   细胞移植   化学遗传学   运动   神经病理性疼痛  

摘要： 尼莫地平治疗大鼠脊髓损伤的临床前研究目的:脊髓损伤是一种极具破坏性的疾病,可导致严重的运动、感觉和自主神经功能障碍。最初的创伤会导致持续的级联继发性损伤,包括细胞凋亡、缺血、血管痉挛、离子稳态失调和炎症反应,这些损伤过程都能促使损伤范围扩大并导致功能恶化。尼莫地平是一种L/T型钙通道阻滞剂,已被美国食品和药物管理局批准用于蛛网膜下腔出血的治疗。尼莫地平的作用主要包括特异性中枢神经系统血管舒张作用并能阻断胞外钙离子通过L/T型钙通道流入胞内。尼莫地平的疗效已经在脊髓损伤的临床前研究和临床试验中测试过;然而,其有效性仍有待进一步论证。其中原因之一可能是治疗时间较短。本研究旨在评估长期给予尼莫地平在临床前脊髓损伤模型中的有效性及可能的作用机制。方法:本研究采用雌性大鼠,造成25 mm脊髓挫伤模型。本研究选择雌性大鼠是因为雌性大鼠的尿道比雄性大鼠更短、更宽,手动排空膀胱更容易。另外,脊髓挫伤模型被认为是贴近临床病理生理的脊髓损伤模型。脊髓损伤的大鼠随机分为尼莫地平治疗组和对照组。从损伤后1小时开始,尼莫地平治疗组和对照组分别皮下注射尼莫地平(10 mg/kg)或溶剂,每天1次,持续6周。本研究通过监测脊髓损伤大鼠的运动功能、后爪抓力、疼痛相关行为、膀胱功能、痉挛样症状以及旷场自发性活动来评估尼莫地平对脊髓损伤大鼠的疗效。组织学上,本研究通过检测脊髓损伤病灶体积、病灶周围神经元数量、腰段脊髓后角的胶质细胞增生和降钙素基因相关肽阳性纤维密度及腰段运动神经元钾-氯共转运体2进一步评估了尼莫地平可能的作用机制。结果:长期给予尼莫地平治疗改善大鼠的运动功能、疼痛相关行为和痉挛样症状,但在旷场自发性活动、后爪抓力和膀胱功能方面未见明显改善。与对照组相比,尼莫地平治疗组的大鼠病灶体积更小,组织残余和病灶周围神经元数量更多,其腰段脊髓后角的胶质细胞增生和降钙素基因相关肽阳性纤维密度均降低,并且腰段运动神经元钾-氯共转运体2细胞膜表达量更高。结论:本研究结果提示长期给予尼莫地平治疗可改善大鼠脊髓损伤后的功能恢复。尼莫地平作为一种可能对脊髓损伤有效的药物值得更进一步的研究。人胚胎干细胞分化的脊髓dI4区GABA能神经元治疗大鼠脊髓损伤后神经病理性疼痛的临床前研究目的:神经病理性疼痛是慢性脊髓损伤患者最严重的后遗症之一。这种严重的感觉障碍会发生于约70-80%的脊髓损伤患者中,并妨碍了这些患者的生活质量和康复效果。目前,神经病理性疼痛通常采用药物治疗。然而,药物治疗往往伴随不良的副作用,并且许多患者疼痛的缓解往往是不彻底的。此外,长期使用止痛剂可能引起药物耐受、镇静,甚至是成瘾。目前已有临床前研究采用胎儿前体细胞或人胚胎干细胞来源的内侧神经节隆起样前体细胞来治疗脊髓损伤后神经病理性疼痛。然而,由于这些细胞具有多潜能或胎儿来源的特性,可能不适合临床应用。因此,本文旨在评价人胚胎干细胞分化的脊髓d I4区GABA能神经元对大鼠脊髓损伤后神经病理性疼痛的作用。方法:本研究采用雌性大鼠,造成25 mm脊髓挫伤模型。由于在脊髓损伤后,雌性大鼠比雄性大鼠更容易手动排空膀胱,因此本研究仅使用雌性大鼠。脊髓损伤大鼠随机分为细胞移植组和培养基移植组,分别于脊髓损伤后7天移植人胚胎干细胞分化的脊髓GABA能神经前体细胞或培养基。采用BBB评分评价大鼠的运动功能。采用Von Frey测试和Hargreaves测试评估大鼠疼痛相关行为。此外,基于移植的细胞带有DREADD受体,本研究于移植后12周和24周分别评估了化学遗传学调控药物CNO(细胞激活)或SALB(细胞抑制)是否能调控移植组大鼠的行为。移植后24周处死大鼠,采用免疫荧光染色脊髓切片检测细胞存活、成熟、神经支配、纤维投射、潜在突触形成和化学遗传学有效性。结果:移植组大鼠的运动功能和疼痛相关行为得到一定程度改善。激活或沉默移植细胞对移植组大鼠的运动功能无明显影响。然而,基于CNO或SALB的移植物功能控制可分别缓解或增强疼痛相关行为。组织学上,移植的细胞在损伤脊髓内存活、表达成熟的神经元标记物、接受潜在的宿主支配、投射到腰段脊髓,并与宿主神经元之间形成潜在的突触联系。此外,通过c-Fos染色作为神经元活动的标志,本文的结果表明表达DREADD受体的细胞能被CNO激活。结论:本研究提示移植脊髓GABA能神经前体细胞是一种潜在有效的治疗脊髓损伤相关神经病理性疼痛的方法。未来可能需要将多种类型的细胞进行混合移植以取得更好的疗效。

关键词： 光自养   蓝藻   苯丙烷   代谢工程   对香豆酸  

摘要： 鉴于气候变化和温室气体排放引起的环境问题,碳固存的潜力已成为研究热点。蓝藻可以利用太阳能和二氧化碳产生有机分子,并且无需碳水化合物作为原料。这一宝贵的特质率先在生物生产领域使用,并最终应用于代谢工程。作为一种天然酚类化合物,对香豆酸广泛存在于植物中,其像其他次要代谢物一样,主要为了保护植物免受压力而产生。作为活性成分的前体,对香豆酸具有许多抗氧化和抗炎特性,对制药、食品、化妆品和农业行业非常重要。本研究旨在将来源于粘红酵母的苯丙氨酸解氨酶（PAL）和来源于拟南芥的肉桂酸4-羟化酶（C4H）外源基因在集胞藻PCC 6803中表达,从而生产对香豆酸。首先,我们设计了一个质粒,在蓝藻Pcpc560启动子驱动PAL/C4H外源基因的条件下,以集胞藻PCC 6803的中性对接位点为靶点。将质粒在野生型集胞藻中表达,将突变菌株Syn407-PAL/C4H置于新鲜制备的BG11溶液中,在30℃、50μmol光子m-2s-1的白光照射下,暴露于空气进行培养。在光自养生长7天后,对香豆酸的产量为73 mg/L。为了进一步增加合成产量,对草莽酸途径进行研究并敲除了氰化物脱水酶,该酶由集胞藻PCC6803基因组中的slr2081位点编码。芳酸酯是酪氨酸生产的前体,是苯丙烷合成的竞争途径。一种新的质粒被设计用来从野生型的集胞藻中剔除芳基脱水酶。质粒还在Pcpc560启动子的驱动下注入了PAL/C4H外源基因。在野生型集胞藻中表达质粒后,在30℃,50μmol光子m-2s-1光照条件下,以1%（体积/体积）以50平方厘米的流速注入二氧化碳进行曝气。对香豆酸在光自养生长7天后产生197mg/L。总之,我们成功设计了工程集胞藻PCC 6803用于对香豆酸的光自养生产路径。其竞争性代谢途径的缺失进一步增加了生产的产量。在相同实验条件下,比较实验中设计的两个突变的蓝藻菌株,这两个菌株都是在正常条件下生长。Syn001-PAL/C4H产生的对香豆酸约为67 mg/L,这一产量高于Syn407-PAL/C4H。

关键词： c-Jun   人胚胎干细胞   多能性   定向分化   CRISPR/Cas9  

摘要： 多能干细胞具有自我更新和向三胚层细胞分化的潜能,是细胞命运调控机理研究的理想细胞模型,在再生治疗方面具有广阔应用前景。然而,在实际应用到临床上时仍存在很多问题,主要原因包括对多能干细胞在命运决定过程中的机理研究还不够透彻,多能性维持与退出调控机制仍未清楚。本实验室前期研究结果表明c-Jun通过调控Ss18形成相变等途径显著影响小鼠胚胎干细胞多能性维持与退出,同时作为核心多能性基因Oct4的“平行镜面因子”拮抗多能性获得,并提出了体细胞与多能干细胞的界面假说。然而,c-Jun在人胚胎干细胞命运决定过程中所起的作用还知之甚少,与小鼠体系存在哪些异同点仍不清楚。本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建c-Jun敲除的人胚胎干细胞系,结合形态特征、检测多能性基因表达与畸胎瘤形成等实验判断,发现c-Jun敲除对人胚胎干细胞多能性维持和三胚层分化早期阶段没有显著影响。为了进一步确定c-Jun在人胚胎干细胞多能性退出及其向三胚层后期终末谱系功能细胞分化过程中的功能调控作用,本研究分别通过人胚胎干细胞定向分化至心肌细胞、肝脏细胞、肾脏细胞、神经细胞、体节前体细胞、定型内胚层细胞,发现c-Jun敲除显著抑制人胚胎干细胞向心肌细胞分化,但促进向肝脏细胞分化,这与已报道的c-Jun敲除小鼠抑制肝细胞分化、对心肌细胞分化无影响的表型不同。另外,c-Jun敲除对人胚胎干细胞向定型内胚层细胞、体节前体细胞、肾脏细胞以及神经细胞分化没有显著影响,这与已报道的c-Jun敲除小鼠对这些细胞发育分化没有影响的表型一致。本研究对c-Jun在人胚胎干细胞多能性维持与退出中所起的作用进行了初步研究,为进一步探索多能干细胞命运决定以及比较研究c-Jun在不同物种的谱系功能细胞命运调控中的作用机制奠定理论基础,对未来多能干细胞更加安全有效应用于临床研究与疾病治疗具有重要的理论指导意义。

关键词： 情境   模型建构   核心素养   智慧课堂   基因工程   高中生物学  

摘要： 在“基因工程及其应用”一节教学中，创建工程学情境，以科学前沿进展为支架，选择“制备生产蛛丝蛋白的大肠杆菌”为主线，驱动课堂教学。通过构建实物（纸片）重组DNA分子模型，转变学生的角色，在分析问题和解决问题的过程中，提升学生学科核心素养。