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关键词： 乳清   D-塔格糖   β-半乳糖苷酶   L-阿拉伯糖异构酶   静息细胞转化  

摘要： D-塔格糖(D-tagatose)是一种天然存在的低热量甜味剂,具有改善肠道菌群、降低血糖、预防结肠癌和抗龋齿等功效,被广泛的应用于食品和医药领域。目前D-塔格糖的产量较低,难以满足日益增长的需求。化学法生产D-塔格糖具有污染大、成本高和纯化复杂等缺点,因而绿色环保的生物法生产D-塔格糖成了当前研究的热门领域。生物法的原理是利用L-阿拉伯糖异构酶(L-arabinose isomerase,L-AI)异构化D-半乳糖生成D-塔格糖,D-半乳糖又可以通过β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-GAL)水解乳清中的乳糖获得。乳清是一种廉价的乳制品工业副产物,其中乳糖的含量约为70%-80%。尽管当前已经有利用酶法转化乳清生产D-塔格糖的研究报道,但受限于酶学性质的不适和相对高昂的纯酶制备成本等因素,难以实现商业化。因此本研究致力于开发新来源的L-AI和β-GAL,构建相应工程菌并研究其酶学性质,最后制备工程菌静息细胞,来实现乳清粉到D-塔格糖的高效转化。主要的研究内容和结果有以下几个方面:(1)从Lactobacillus reuteri ATCC 53608中克隆得到β-GAL(LRGAL)的编码基因lac LM,大小为2830 bp,构建重组菌*** BL21/p ANY1-lac LM,通过IPTG诱导成功表达LRGAL,SDS-PAGE显示有两条大小分别为73 k Da和35k Da蛋白条带,比活力为25.63 U/mg。LRGAL的最适温度为50℃,最适p H为6.5,最适金属离子为Ca和Mn,以2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(o NPG)为底物时,LRGAL的V、K和K/K分别为2.19 m M,21.68 U/mg和9.3 m Mmin。制备重组菌静息细胞,利用单因素变量法探索其水解乳糖的最优条件:最适温度50℃,最适p H为6.5,最适细胞浓度40 g/L,最适反应时间为40 h,且无明显的底物抑制或产物抑制。(2)从Lactobacillus parabuchneri CICC 6004中克隆得到L-AI(LPAI)的编码基因ara A,大小为1425 bp,构建重组菌*** BL21/p ANY1-ara A,通过IPTG诱导成功表达LPAI,SDS-PAGE显示其蛋白条带大小为55 k Da,比活力为15.52U/mg。LPAI的最适温度为45℃,最适p H为6.7,最适金属离子为3 m M的Ca,以L-阿拉伯糖和D-半乳糖为底物时,LPAI的K、V和K/K分别为4.3 m M,63.1 U/mg,5.9 m Mmin和5.4 m M,35.5 U/mg,2.8 m Mmin。制备重组菌静息细胞,利用单因素优化法探索其转化D-半乳糖生产D-塔格糖的最优条件:最适温度45℃,最适p H为6.7,最适细胞浓度30 g/L,最适底物浓度为140 g/L,最适反应时间为50 h。(3)分别制备*** BL21/p ANY1-lac LM和*** BL21/p ANY1-ara A静息细胞,通过单因素优化法研究得到利用乳清粉生产D-塔格糖的最适条件:最适温度45℃,最适p H为6.5,最适*** BL21/p ANY1-lac LM和*** BL21/p ANY1-ara A细胞质量比为1,最适细胞浓度和为50 g/L,最适底物浓度120 g/L,最适反应时间50 h。利用以上条件进行第一阶段反应,得到的D-塔格糖产量为25.3g/L,乳糖到D-塔格糖的转化率为21.1%。以第一阶段的产物作为底物在相同条件下继续第二阶段的反应,结果显示D-塔格糖浓度从25.3 g/L增加到37.8 g/L,转化率提高到31.5%。

关键词： 肝细胞肝癌   肝移植   分子分型   循环肿瘤DNA   预后   复发监测  

摘要： 背景对于肝癌患者,肝脏移植手术可以通过彻底清除肿瘤组织及其以外的病变肝组织而达到肝癌的根治。而在肝癌肝移植患者中,约有三分之一以上的患者在术后因肿瘤复发、转移而死亡,它们严重影响了移植患者的预后。在目前器官紧缺的情况下,如何在术前对患者进行恰当的评级筛选是降低肝癌肝移植术后复发的关键。来自多中心的临床统计显示,我国的大多数肝癌患者首次就诊时肝癌已处于进展期,符合米兰标准纳入移植等待队伍的患者则不足5%。若严格执行米兰标准,即仅通过肿瘤的数目、大小来筛选患者,则可能使绝大部分的肝癌患者失去移植机会。而越来越多的临床证据显示:对于部分超米兰标准的肝癌患者,肝移植术仍能获得较好的预后。因此,对于我国的肝癌待移植患者来说,仅按照米兰标准筛选患者存在一定的局限性。而目前对于肝癌的诊断分级,除组织病理学分类及肿瘤分期外,针对分子分型的个体精准化诊断也逐渐受到重视。其中,通过对肝癌患者进行循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)的检测能更客观、精准、全面的反映其肿瘤负荷、恶性度、转移能力以及基因突变等信息。因此,检测肝癌待移植患者术前ctDNA可有助于掌握肿瘤的生物学特征,预判术后复发风险。目的通过高通量测序技术监测超米兰标准的肝癌患者移植术前、术后ctDNA相关高频突变基因的动态变化,评估监测ctDNA对分析超米兰标准肝癌分子分型的价值,以期为肝癌肝移植患者的预后判断、疗效评估和复发监测提供更为可靠的监测指标。方法本研究分为三个部分:第一部分,入组30名接受肝移植手术治疗的超米兰标准肝癌患者进行研究,留取其术前外周血及术中肿瘤组织标本。利用高通量测序技术,对采集的血液ctDNA、肿瘤组织DNA中的高频突变基因进行捕获测序,并将测序结果与该患者的临床病理资料进行综合对比,进一步分析ctDNA高频突变基因与肝癌组织生物学及临床病理特点的相关性。第二部分,同时监测该30名患者术前、术后1月、3月、6月、9月和12月ctDNA,术后3月、6月、12月的胸部CT、腹部强化CT检查,肿瘤复发、转移以及生存情况;以分析ctDNA与术后患者肿瘤复发、无瘤生存和总体生存的潜在关系。第三部分,在该30例患者中,9例患者于术后1年内出现肿瘤复发或转移,将该9例患者的ctDNA检测结果与AFP、PIVKAII及CT检查结果进行比对,以病例分析的方式探讨ctDNA对疗效评估和复发监测的价值。结果(1)肝癌肿瘤组织测序结果中排在前5位的高频突变基因为TERT、TP53、CTNNB1、ALB和PIK3CA,与TCGA数据库和COSMIC数据库的结果基本一致。将ctDNA测序结果与患者临床病理资料综合比较后发现,“最大肿瘤直径”与ctDNA突变频率之间存在显著相关性(p=0.02)。依据TCGA和COSMIC数据库数据,对比ctDNA与肝癌组织DNA检测结果,各患者ctDNA检测结果的一致性高于组织的。(2)将TERT、TP53和TSC2基因组成预后判断panel,根据该panel检测结果分析比较后发现,阳性患者术后无瘤生存率显著低于阴性患者(p<0.05),但两组的1年总体生存率近似(p>0.05)。(3)术后复发患者连续监测AFP、PIVKAII均呈现显著降低并接近或达到正常水平,对应时间点的血浆ctDNA中“3T”基因已经表现为阳性结果,随后在腹部强化CT扫描中均发现了 1-2cm的肝内复发病灶。且西罗莫司可有效靶向抑制TSC2缺失突变肝癌细胞,与TSC2扩增突变细胞相比,侵袭能力明显降低(p<0.05)。结论(1)本研究ctDNA检查结果与COSMIC数据库比对结果相似,研究结果真实性和有效性强,ctDNA检测可有效克服肿瘤异质性对检测结果的影响;(2)循环肿瘤DNA能够客观反映肝癌患者肿瘤基因组构成信息,具有“液体活检”的重要临床应用价值;(3)术前ctDNA三基因小panel(TERT、TP53、TSC2)对判断超米兰标准肝癌肝移植患者术后早期复发和预后监测具有潜在临床价值。

关键词： DNA测序   甲基化识别   二维材料   吸附机理   电荷输运  

摘要： DNA由四种天然碱基(腺嘌呤A、鸟嘌呤G、胞嘧啶C和胸腺嘧啶T)按照一定的排列次序组成,携带着生命及其发展的重要遗传信息。寻找快捷、低廉和精准的DNA测序方法,一直是生物、物理和化学等众多交叉领域的重要研究目标。近年来发展的第三代DNA测序,以单分子识别为主要特征,取得很多有意义的结果。这其中,飞速发展的二维材料,以其优越的特性,成为很有前景的测序候选材料。除了四种常见的天然碱基外,DNA还存在很多以胞嘧啶C的甲基化为主的产物。近年来很多研究表明,DNA甲基化水平的异常和很多癌症疾病的发生有着重要关联。因此研究天然DNA测序和甲基化产物的识别,具有重要的理论和潜在的应用价值。本文采用密度泛函理论(DFT)并结合非平衡格林函数方法(NEGF),分别从几何结构、电子性质和电荷输运性质三个方面,详细研究三种二维材料(硅烯、黑砷烯和三磷化锗)纳米条带和天然碱基(A、T、G和C)和甲基化碱基(5-甲基胞嘧啶5m C、5-羟甲基胞嘧啶5hm C、5-甲酰基胞嘧啶5f C和5-羧基胞嘧啶5ca C)之间的吸附作用,并基于实验上可测的电学信号,设计新颖的DNA测序和甲基化识别方案。通过研究,得到了一些有意义的结果,主要研究内容简述如下:(1)基于硅烯吸附的DNA测序和甲基化识别:二维材料硅烯,具有更易于和现有硅基半导体器件相兼容的优势,又由于自旋轨道耦合和褶皱的存在,使其具有一个较小且更容易调节的带隙。这些特点使其比零带隙的天然石墨烯更适合应用于电子器件中,也在分子传感器方面展现了巨大的潜力。基于以上考虑,我们设计了基于硅烯纳米条带吸附的DNA测序和甲基化识别。首先优化得到八种碱基与硅烯纳米条带的吸附构型,并做深入的电子性质分析。结果表明只有腺嘌呤A碱基,是通过范德华相互作用物理吸附在硅烯纳米带上,其余七种碱基则是通过弱的共价相互作用化学吸附在纳米带上。然后,我们详细研究碱基-硅烯吸附体系的电荷输运性质。通过对八种碱基吸附体系的透射谱和态密度曲线的分析,发现碱基的吸附降低了纳米带的导电性,并且碱基与纳米带间存在法诺共振。其创新之处在于,我们得到了实验上可以测量的电流-电压曲线(I-V曲线),并且基于此I-V曲线设计一种新颖的“High-Low”碱基识别方案。利用这种方案,分别在0.5和1.0V两种偏压下,很好地实现对八种碱基的识别。(2)基于三磷化锗吸附的DNA测序和甲基化识别:三磷化锗(Ge P)二维材料,是一种由Ge和P原子组成的层状材料,是近年来发现的一种新颖的二维材料,因其具有很小的间接带隙(0.79 e V)、很高的载流子迁移率(10 cm V s左右)以及对小分子高度敏感等特性,受到研究者的关注。本文在第四章主要阐述Ge P纳米带对八种单碱基的识别能力。在该部分研究基础上,我们在第五章还设计了以碱基为探针的基于错配碱基对吸附在该二维材料(以下简称为功能化的Ge P纳米带)上的识别方案。以碱基为探针,应该具有更好的生物兼容性,还明显提高其对小分子的识别能力。首先,计算并分析这些吸附体系的几何结构和电子性质,发现八种单碱基和九种错配碱基对都是通过范德华力物理吸附在纳米带上。其次,通过对I-V曲线的分析,发现在八种单碱基中,有四种天然碱基在1.0V偏压下可以轻松识别;胞嘧啶C及其甲基化碱基在0.2V偏压下可完全识别。而在九种错配碱基对中,以5f C为探针的四种错配碱基对在0.8V偏压下可区分开;以C为探针的五种碱基对在1.0V偏压下可完全区分。这表明探针分子的引入,可以提高纳米带对碱基分子的敏感性。最后,通过分析这些吸附体系的透射谱和态密度,发现单碱基和错配碱基对的吸附,都降低了Ge P纳米带的导电性,以错配碱基对5f CT的吸附最为明显。此外,我们还发现单个碱基和碱基对与Ge P纳米带吸附时,都存在法诺共振。(3)基于黑砷烯吸附的DNA测序和甲基化识别:本文在第六章系统研究了黑砷烯纳米带对八种单碱基的识别性能。黑砷烯是一种与黑磷烯结构类似的二维层状材料,具有0.72 e V的间接带隙、较高的载流子迁移率和良好的结构稳定性。近年来,已有研究表明在分子传感方面,黑砷烯具有各向异性敏感性和良好的选择性,因此在本部分中,我们从几何结构、电子性质和电荷输运性质三个方面,研究其对天然碱基和甲基化分子的识别能力。通过对八种碱基吸附体系的几何结构优化计算和电子性质分析,发现八种单碱基都是通过物理吸附作用在纳米带上,这与之前文献报道的碱基物理吸附在黑磷烯纳米带上的情况类似。另外,通过对透射谱和态密度曲线的分析,发现单碱基也明显降低黑砷烯纳米带的导电性。并且通过比较透射谱中下降谷(dip)和投影在碱基分子上的态密度峰的位置,发现二者位置具有很好的匹配性,这恰好证明,碱基分子与纳米带间存在耦合相互作用。最后,我们选择计算八种吸附体系的I-V曲线,发现根据1

关键词： 羟基磷灰石   双相磷酸钙   缺钙羟基磷灰石   钙磷比   物相比   结晶度   晶体形貌  

摘要： 羟基磷灰石(HA)具有很好的生物相容性和骨传导性,但是降解能力和成骨能力则较差。针对这一问题,本研究基于“材料基因组”计划,从仿生学角度出发,以期制备出与自然骨磷灰石结构、成分和性能更为接近的磷酸钙材料。通过不同的制备方法和条件得到了:钙磷比(Ca/P比)梯度变化的弱结晶HA和对应煅烧后的不同物相比的高结晶度磷酸钙、不同结晶度的HA、不同长径比晶粒的HA等一系列钙磷基材料,研究这些因素对材料理化性能和生物学性能的影响,筛选出比较优异的组别后,将材料结构和性能关联起来,并且进一步来确定和优化制备方案和参数,丰富材料基因库。首先,利用化学沉淀法制备了Ca/P比梯度变化(1.5、1.55、1.6、1.67)的弱结晶HA,将其煅烧后得到HA/β-TCP物相比梯度变化(0/10、3/7、6/4、10/0)的高结晶度磷酸钙。并通过XRD、FTIR、SEM等分析,对其物相、成分、形貌等进行了表征。随后对其理化性能和细胞学性能进行了研究,结果显示:减小Ca/P比可以有效提高弱结晶HA的蛋白吸附性能,1.5Ca/P比的弱结晶缺钙HA具有最佳的蛋白吸附性能;煅烧后不同物相比的高结晶度磷酸钙的蛋白吸附性能则随着β-TCP含量增加而下降,纯β-TCP的蛋白吸附性能最差;弱结晶HA整体上的蛋白吸附性能要明显优于高结晶度磷酸钙。弱结晶HA和高结晶度磷酸钙的P释放水平都随着Ca/P比的减小而逐渐升高,但是Ca离子的释放则存在很大变化,缺钙促进了弱结晶HA对Ca离子的吸附导致对应溶液中的Ca离子浓度降低;高结晶度磷酸钙释放的Ca离子浓度随着β-TCP含量的增加而升高。弱结晶HA的基本不存在矿化现象,而HA/β-TCP(物相比)为3/7的高结晶度双相磷酸钙(3/7BCP)相比于其他组发生了明显的矿化现象,可能与其特殊的微纳结构有关。Ca/P比为1.55的弱结晶缺钙HA具有最佳的细胞增殖活性,其碱性磷酸酶(ALP)活性和成骨相关基因的表达量也最高;其煅烧后对应的3/7BCP组的细胞学性能在高结晶度磷酸钙中也是最佳的,其增殖活性与成骨相关基因的表达量都是最高的;对弱结晶HA和对应煅烧后的高结晶度磷酸钙进行细胞学性能对比发现,两者的细胞增殖活性差距不大,但是弱结晶HA的更能提高间充质干细胞(BMSCs)的ALP活性,更能促进成骨相关基因的表达。随后对1.5Ca/P比的弱结晶缺钙HA进行了体外陈化实验,发现随着陈化时间延长弱结晶缺钙HA的结晶度和Ca/P比都有所提高,晶粒变大,并由球状向长棒状转化;随着陈化时间延长,弱结晶HA对成骨相关基因的表达上调作用越明显,陈化14天的弱结晶HA对m BMSCs成骨相关基因的上调作用最明显。根据前期体外成骨实验分别选择2组弱结晶HA(1.55HA和1.67HA)以及煅烧后得到的2组高结晶度磷酸钙(β-TCP和3/7BCP)与聚乳酸(PLA)复合后3D打印成多孔支架,并植入兔子股骨踝缺损,研究其体内成骨性能。实验结果显示:弱结晶HA复合支架比高结晶度磷酸钙复合支架具备更好的成骨效果,在6周时就已经有大量的新骨生成,12周时材料也有明显的降解,而高结晶度磷酸钙复合支架在6周时几乎不成骨或很少成骨;1.55Ca/P比弱结晶缺钙HA复合支架和1.67Ca/P比弱结晶HA复合支架成骨性能都非常优异,但是差距不明显;3/7BCP复合支架在12周时比β-TCP成骨更好,而且后者内部被大量的纤维组织包裹,造成其成骨量下降。将高通量和水热法结合起来,通过改变水热温度和原料初始Ca/P比这两个变量一次性批量制备了20组不同的HA,然后对其进行测试表征。结果显示:水热法都可以制备出物相纯度高的HA,随着水热温度提高,产物HA的结晶度提高,但是Ca/P比也会随之降低,针棒状HA长径比变大,直到170℃时转化为六方板片状;随着合成过程中初始Ca/P比的增加,得到的HA结晶度有小幅提升,形貌上开始由开始的长棒状向短棒状和球状转变。经过物相检测和形貌观察,初步筛选出了3个不同长径比的HA和5个不同水热温度下结晶度不同的HA进一步研究。随着HA晶粒的长径比增大,其蛋白吸附性能提高,但是释放Ca离子浓度较低,影响了细胞的成骨分化,因此球状的HA晶粒显著上调了细胞的成骨相关的基因表达;随着结晶度的提高,HA的蛋白吸附性能和离子释放性能下降,所以当水热温度为90℃时,所制备的HA具有较好的成骨活性。分别采用化学沉淀法、水热法以及化学沉淀法制备后热处理得到了Ca/P比梯度变化(1.5、1.55、1.6、1.67)的弱结晶HA,对比了制备方法、工艺以及Ca/P比对HA理化性能和细胞学性能的影响。结果显示:与化学沉淀法制备的HA相比,水热法制备的HA结晶度有所提高,形貌上以长棒状为主,且随其Ca/P增大而慢慢变短;化学沉淀法制备的HA经热处理后结晶度增加,且随着其Ca/P比

关键词： 单倍体   类精子单倍体胚胎干细胞   CRISPR/Cas9   小鼠疾病模型  

摘要： 类精子单倍体胚胎干细胞是源自小鼠孤雄囊胚中的一种新型单倍体胚胎干细胞,仅含有父源遗传物质,性染色体为X染色体,能在体外长期自我更新、增殖或诱导分化,并可以利用CRISPR系统进行单基因或多基因的编辑,能替代精子使卵母细胞受精。区别于原核注射、卵胞质内注射获得嵌合体或利用四倍体补偿技术等传统构建基因修饰小鼠模型的方法,通过将基因编辑后的类精子单倍体胚胎干细胞注射到卵母细胞中,可以高效稳定地一步获得基因型确定的半克隆小鼠,不会存在嵌合现象,原代小鼠即可用于研究。基于类精子单倍体胚胎干细胞获得的多基因精准编辑的复杂疾病小鼠模型,可以在生物个体水平上阐述多个基因协同互作的效应,从而更充分地模拟复杂的、可能受多个基因影响的人类疾病的各种病理特征,以挖掘新的诊断和治疗方法。

关键词： 微流控芯片   磁性振荡泵   人胚胎干细胞   细胞培养  

摘要： 芯片实验室是一种利用受控微流实现芯片上实验的技术。在芯片实验室发展的20年间,在各个研究领域展现出巨大的潜力。但是,由于芯片及控制设备的制造过程复杂、成本高、体积大、寿命短、不方便等因素,这项技术并不能像手机那样进入到日常生活中。本文建立了微流驱动理论并在该理论的框架下找到了最简化微流泵工艺的途径,这一技术克服了微流控芯片控制中的主要工程学困难,并设计制作出磁性振荡泵(O-pump),该泵性能稳定,尺寸小于1.5 mm,功耗在10 mW左右,这样低的功耗相当于一个可移动电源能够使用200天,且手机可以直接驱动。将控制信号通过音乐技术写入音频文件,可直接通过MP3或手机的音乐播放菜单进行模块化编程,这种驱动方式与材料无关,可应用与任何硬质芯片中,包括硅基的全玻璃芯片或硅晶片。在磁性振荡泵的基础上,设计出一种具有适合人胚胎干细胞生存条件的人工细胞巢环流芯片,其精密的流体微环境控制,能够在干细胞剪切力阈值内,将人工细胞巢外营养物质带入细胞巢内,提升物质交换速率,促进人胚胎干细胞增殖分裂。结合Matrigel基质胶覆盖法,达到在人工细胞巢微流控芯片上的三维细胞培养,使体外模拟微环境更加接近生物体内。微流控芯片是一种新型、方便的细胞或组织微环境模拟技术和研究方法,它以传统培养皿的操作和成本实现了芯片实验室的功能。

关键词： 胚胎干细胞   肝细胞   凝血因子Ⅷ、Ⅸ   分化  

摘要： 目的:多种诱导因子体外分步诱导人胚胎干细胞(hESC)分化为同时表达凝血因子VIII、IX的肝细胞,为血友病A、B的细胞替代疗法提供新型种子细胞来源.方法:将细胞因子活化素A(activin A)加入H9 hESC细胞株的培养液诱导3 d后,换为含有骨形成蛋白4(BMP-4)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的分化液继续培养4 d,然后以含有肝细胞生长因子(HGF)的分化液诱导分化5 d,最后换为含制瘤素M(OSM)及地塞米松(Dex)的分化液诱导4 d.免疫荧光检测分化细胞肝脏特异性蛋白白蛋白(ALB)、胆固醇7α-羟化酶A1(CYP7A1)和FVIII、FIX;结果:诱导的细胞呈现肝细胞特有的形态;免疫荧光显示分化中期细胞表达ALB,末期表达CYP7A1、FVIII、FIX.结论:体外分步诱导hESC可分化为同时表达FVIII、FIX的肝细胞.

关键词： DNA测序   纳米孔   CMOS传感阵列   跨导放大器   高通量  

摘要： 随着DNA双螺旋结构的发现,探究物种的DNA序列及其完整性,则成为世界各国的研究热点。传统的DNA测序技术一般以生化为基础采用光学检测的方法出对DNA分子进行测序。尽管这些测序方法准确度较高,但它们仍然需要许多复杂的化学修饰和生物处理,从而增加了成本和时间。基于纳米孔的第四代DNA测序技术以物理方法和电信号检测技术为主,在纳米孔两端施加电压,利用DNA穿过纳米孔时等效电阻发生变化而产生的微弱电流信号进行检测。无需对DNA进行化学修饰和标定物插入等化学或生物处理,具有低成本和快速检测的天然优势,从而被认为是具有广阔应用前景的第四代DNA测序技术。关于纳米孔DNA测序技术,其研究的主要问题是为纳米孔产生的信号设计合适的检测电路和平行测量的生物传感器阵列。纳米孔产生的信号通常微弱、嘈杂、快速并伴有较高的直流偏移。因此对纳米孔的检测电路的要求非常苛刻:高增益、低噪声、小面积以及高通量。目前国内外的研究集中在降低检测电路的噪声以提高检测精度的方向上,已报道的研究通常采用复杂的斩波调制和半数字反馈技术来降低检测电路的噪声。然而单个检测电路的面积和功耗很大,难以实现高通量的检测目标。此外,这些芯片仅实现了电流检测功能,这仅仅是实际DNA测序平台整体功能的一部分。为此,论文完成了纳米孔微流控系统的电特性检测方法以及高通量、低噪声的微弱电流传感器阵列设计,主要工作如下:面向高通量生物传感器设计,提出了共享运放半边电路的CTIA电路设计方案,仿真结果表明,在保证了高信噪比的同时,实现了检测单元中运放面积和功耗均50%的减小。此外,基于数字相关双采样技术,提出了利用未插入碱基和插入碱基之间量化得到的差值进行所插入碱基类型判别的设计方案,实现了运放失调减小及微流控系统生化参数偏差所带来的直流偏移的消除。本文还对纳米孔微流系统的电特性进行分析,提出了一种集纳米孔插入检测、膜电容检测和DNA测序于一体的多功能自动化集成CMOS平台。实现了从传感器制备到DNA测序的全过程在一个芯片上完成,大大降低了实验的复杂度和时间成本。本文基于TSMC 0.18μm CMOS工艺,实现了一款测序专用集成电路芯片,该芯片集成了16×5的传感器阵列,具有成膜检测、纳米孔插入检测和DNA测序功能。后仿真结果表明芯片可以完成1p F～20p F范围的膜电容容值检测和纳米孔插入检测;等效输入RMS噪声电流为3.36p A,单个检测单元的面积低至7×10μm2。

关键词： 胚胎干细胞   间充质干细胞   血管生成  

摘要： 人胚胎干细胞（hESC）是具有体外无限增殖和多向分化潜能的一类亚全能干细胞,在特定的条件下可以诱导分化为机体的各种细胞包括间充质干细胞（MSC）。MSC除了具有多向组织细胞分化功能之外,MSC还具有旁分泌功能,通过在血管生成中起调节作用,使多种缺血性疾病患者受益。目前基于细胞的促血管生成疗法,特别是MSC疗法,已越来越多地运用于缺血性疾病的治疗。但是目前针对h ESC衍生MSC（h ESC-MSC）血管生成特性的研究很少。本研究采用细胞增殖检测（CCK-8）、细胞迁移试验（细胞划痕和Transwell小室迁移）、细胞共培养试验、活细胞染色实验、细胞体外成血管试验、流式细胞技术和荧光定量PCR技术对h ESC-MSC在体外血管生成中的作用包括其条件培养上清对脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）的功能和向血管内皮细胞分化的潜力进行了系统的研究,并以人脂肪间充质干细胞（ADSC）和脐带间充质干细胞（UC-MSC）为对照。结果显示,h ESC-MSC的条件培养液上清可显著促进脐静脉血管内皮细胞的增殖和迁移,其促HUVEC增殖能力显著高于UC-MSC;h ESC-MSC经不同血管内皮细胞诱导方案分化后均具有体外血管网络生成的能力,其血管网络长度显著高于ADSC和UC-MSC经单一血管内皮细胞诱导方案分化后的血管网络长度。因此,h ESC-MSC可显著促进体外血管生成,提示该细胞有望成为一种有效的新型心血管疾病的治疗性细胞。

关键词： 鸢尾素   基因工程   蛋白纯化   力生物学   骨重建  

摘要： 运动有助于健康,但其中的科学机理还缺乏了解。肌肉和骨骼是主要的运动器官,在运动刺激下,会通过自、旁分泌功能对机体产生调控作用。Irisin(鸢尾素)是骨骼肌分泌的肌肉因子,对骨骼重建、脂肪、糖代谢都有调控作用,作为一种具有潜在治疗作用的蛋白类激素而受到关注。本文重组构建了含Irisin编码序列大肠杆菌工程菌,并成功表达了重组Irisin。建立了以层析技术为主的纯化工艺,得到高纯度的重组Irisin,验证了重组Irisin的活性,并初步分析了力学刺激与Irisin联合作用对骨细胞骨重建基因表达的影响。通过建立可行的Irisin生产工艺,为进一步的科学研究奠定了基础。主要研究内容和结论如下:(1)构建p MAL-c5X-Irisin重组质粒并转化的大肠杆菌BL21。诱导发酵表达得到了MBP-Irisin融合蛋白包涵体。优化发酵条件为:接种量为2%,发酵时间3 h,IPTG加入量为0.3 m M。(2)对重组Irisin进行了纯化。通过Q阴离子层析对MBP-Irisin进行了初步纯化,确立洗脱条件为:20 m M Tris 8 M尿素0.1%β-me 200 m M Na Cl p H 7.5。确立稀释复性为复性方法。并优化酶切比例为每1mg蛋白:2U酶。再用MBP亲和层析使Irisin与MBP得到分离。最后用Q阴离子层析进行纯化。通过HPLC检测,确定重组Irisin的纯度为91%。通过WB检测,证实所获得的产物为重组Irisin。(3)通过3T3-L1(小鼠胚胎成纤维细胞)前脂肪细胞分化成熟实验对重组Irisin活性进行分析。将Irisin处理后的3T3-L1进行油红O染色。在492 nm的吸光度值为:阴性对照组0.443±0.006,<实验组0.68±0.006,<阳性对照组0.75±0.01(n=3)。显示了重组Irisin的具有诱导3T3-L1分化的生物活性。使用PEG定点修饰Irisin的N末端氨基。修饰之后,通过反相色谱纯化得到纯度94%的Irisin-PEG。并验证其促进3T3-L1分化的活性为Irisin的81.3%,且热稳定性远高于Irisin。(4)研究力学环境下Irisin对骨重建基因表达的影响。使用Irisin与FSS(流体剪切力)共同刺激MLO-Y4细胞,通过RT-PCR法检测MLO-Y4中骨重建因子Sost(骨硬化蛋白)、OPN(骨桥蛋白)、RANKL(细胞核因子k B受体活化因子配体)因子的m RNA表达。发现FSS能促进由Irisin刺激产生的OPN m RNA表达量的增加;能抑制由Irisin刺激产生RANKL m RNA、Sost m RNA表达量的减少。表明Irisin能协同FSS影响MLO-Y4的骨代谢相关因子的表达。本研究建立了原核重组表达及Irisin纯化工艺;体外实验证实所制备的Irisin具有生物活性;PEG定点修饰能提高稳定性并维持一定的生物活性。