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关键词： 雷帕霉素衍生物   遗传操作   六氢哒嗪-3-羧酸   糖肽类抗生素  

摘要： 抗生素对人类健康具有重要作用,雷帕霉素（rapamycin,RAPA）作为微生物来源的天然产物药物,它具有多种生物学、药学活性,如抗真菌活性、免疫抑制剂活性、抗肿瘤及延缓皮肤衰老等活性,号称“神药”。但临床活性研究报道,rapamycin并不能起到强大、广泛的抗癌活性,主要体现在rapamycin不能完全抑制mTORC1与下游靶标的结合,且rapamycin与mTORC1结合产生的负反馈信号能激活PI3K-AKT信号通路,从而增加癌细胞的存活率。近些年来,虽然已有相关研究对rapamycin C37-C42的碳六元环进行改造以获取不同的雷帕霉素衍生物（rapalogues）,但尚未发现一种rapalogue与mTORC1结合产生的信号不引起后续的一些系列负反馈,且能有效地抑制mTORC1与下游靶标的结合,因此继续开发新型rapalogues具有十分重要的意义。糖肽类抗生素（GPAs）在治疗耐药菌引起的疾病或者致病性疾病方面具有较为突出的优势,且其能通过自身调节机制消除细菌耐药性的建立,以往被作为治疗多种细菌感染疾病的最后防线,因此发掘更多的糖肽类化合物同样具有十分广阔的应用前景。目前rapamycin改造主要围绕4-羧基-3-甲氧环己基,而对哌啶环的改造较少,本课题以rapamycin产生菌（GIM4.111）为出发菌株,拟敲除rapamycin生物合成所需底物哌啶酸（piperidine acid）的编码基因rapL,同时添加piperidine acid类似物六氢哒嗪-3-羧酸（piperazic acid）,以期获得含有 piperazic acid 的 rapalogue。目前已在 GIM4.111 的基础上成功获取rapL敲除株,并向rapL敲除株添加piperazic acid进行发酵检测,同时在rapL敲除株的基础上引入ktzI-ktzT,成功获取整合ktzI-ktzT的rapL敲除株,并对其进行发酵检测,另外,向rapL敲除株引入突变rapP（rapP*）,成功获取整合rapP*的rapL敲除株,并对其添加piperazic acid进行发酵检测,有望获取新颖rapalogue。GPAs基因组挖掘方面,本研究通过文献调研发现X-domain是存在于所有GPAs中至关重要的保守结构域,并以X-domain为探针发现本实验室万株放线菌库中具有潜在的GPAs生物合成基因簇,通过系统进化树构建发现LS2102是潜在的新颖九肽GPA产生菌株,以LS2102为出发菌株,设计敲除LS2102中编码GPA的关键基因簇,根据差异峰导向及基因簇克隆、异源表达策略用于挖掘新颖GPA,目前已成功获取关键基因簇敲除株,并完成关键基因簇克隆,可用于异源表达,进行发酵检测,有望发现新颖GPA。综上所述,本研究基于基因工程和基因组挖掘策略,对GIM4.111和LS2102进行遗传操作,成功建立适于新型rapalogue和新颖GPA表达的环境,有望获取含有piperazic acid的rapalogue和新颖九肽GPA,后续可进一步开发应用于临床治疗用药,进而助力解决目前严重的耐药菌问题。

关键词： 壳寡糖   壳聚糖酶   细胞表面展示   温度诱导   大肠杆菌  

摘要： 壳聚糖经降解后生成的氨基糖类化合物称为壳寡糖（Chitooligosaccharides,COSs）。COSs分子量小、水溶性高,生物相容性好,具有多种功效,在医药、保健食品、化妆品、农业等领域都有广泛应用。目前,制备COSs的方法主要有化学法、物理法和酶解法,其中酶解法具有反应条件温和、无污染、特异性较强、产物分子量集中等特点,是一种较理想的天然COSs工业化生产的方法。然而,传统酶法制备COSs存在壳聚糖酶纯化步骤复杂且成本昂贵、从COS-壳聚糖酶混合物中纯化产物COSs的过程复杂等不足,使得酶法制备COSs的工业化生产难以实现。本文将冰晶核蛋白N端结构域基因inaQ-N与编码枯草芽孢杆菌壳聚糖酶编码基因序列csn46A融合构建inaQ-N-csn46A,将其插入温度诱导型表达载体pBLMVL2,转化至Escherichia coli BL21（DE3）中,构建了温敏型壳聚糖酶细胞表面展示重组菌株MB101。在此基础上,利用限制性内切酶同尾酶的原理,构建了具有两拷贝串联重复InaQ-N作为锚定单位的温敏型壳聚糖酶细胞表面展示重组菌株MB102。对重组菌MB101和MB102诱导表达融合蛋白InaQ-N-CSN46A和2InaQ-N-CSN46A的最佳条件进行优化。结果表明,菌种培养至OD600=0.9时开始诱导最佳;最佳诱导温度为41.5℃,最佳诱导时间为4 h。SDS-PAGE结果显示融合蛋白InaQ-N-CSN46A和2InaQ-N-CSN46A的分子量大小分别为46 k Da和65 k Da。测定了两种重组菌株的生长曲线,结果表明两种融合蛋白的表达对大肠杆菌的生长无显著影响。酶学性质分析表明,表面展示的融合蛋白InaQ-N-CSN46A和2InaQ-N-CSN46A的最适反应温度为50℃,在37℃-42℃内较稳定;最佳反应pH为5.5,在pH 5-6内较稳定;Mg2+和Ca2+有助于提高重组壳聚糖酶的催化效率,Co2+、Fe3+、Zn2+、Cu2+对重组壳聚糖酶有抑制作用。最佳反应条件下,2InaQ-N-CSN46A的最高比酶活达到761.34±0.78 U/g细胞干重,较InaQ-N-CSN46A提高了约45.6%。比较了两种表面展示体系在不同温度下的重复使用性,两种体系均能在37℃经过5次循环反应后仍保留原始酶活的65%,温度升高后酶活性显著下降。表面展示壳聚糖酶的水解特性分析结果显示,在最佳反应温度（50℃）下的终产物是壳二糖和壳三糖,无单糖产生,说明CSN46A是一种内切型壳聚糖酶,当酶解温度升高（55℃）后,终产物以壳三糖为主。酶解曲线结果表明,2InaQ-N-CSN46A的酶解效率较InaQ-N-CSN46A快,说明串联的双拷贝InaQ-N具有协同作用,可显著提高靶蛋白的活性、增加锚定蛋白的稳定性。因此,2InaQ-N-CSN46A是更适用于COSs工业化生产的最佳体系。该体系避免了酶纯化的繁琐步骤,不需添加诱导剂即可实现蛋白的表达,成本较低,可控性较高,可以重复使用,酶活高,为COSs的生产提供了一种更高效且低成本的新方法。

关键词： 转录调控   转录因子   胚胎干细胞   增强子转录   序列分析  

摘要： 在不同的细胞类型或环境中，染色质结合蛋白尤其是表观调控因子往往展现出动态的结合模式，它们在染色质上的差异结合精细调控了细胞类型特异性基因转录谱的建立和维持。ChIP-seq技术被广泛地用于刻画这些蛋白在全基因组范围内的结合情况。通过比较来自不同细胞类型的ChIP-seq样本，并进一步鉴定与其差异结合事件存在显著关联的转录因子，能够帮助我们了解细胞类型特异性的转录调控机制是如何建立的。本论文首先描述了一个新开发的计算生物学工具MAmotif。它能调用MAnorm模型来定量地比较同一蛋白在两个不同细胞类型下的ChIP-seq样本，并与MotifScan工具在这些样本ChIP-seq信号峰区中所识别出的转录因子结合motif出现位点信息进行整合分析，鉴定与该蛋白的差异结合具有显著关联的转录因子，作为其候选的细胞类型特异性调控因子或辅因子。我们应用MAmotif工具比较了成人阶段和胎儿阶段原成红细胞的H3K4me3组蛋白修饰ChIP-seq数据，发现IRF2的结合与成人阶段特异性的基因启动子区域H3K4me3修饰有着显著的关联。基因表达数据证实IRF2直接调控了这部分有着成人阶段特异性高H3K4me3修饰的基因的转录激活，其中包含了大量免疫和病毒防御相关的基因。通过系统应用MAmotif比较人类胚胎干细胞系与其他细胞系中H3K4me3、H3K27ac和H3K9ac三种组蛋白修饰的ChIP-seq数据，我们新发现了一个转录因子ZNF-TF显著地关联于胚胎干细胞系特异的基因启动子组蛋白修饰。基因表达数据确认它在启动子结合直接调控的基因更倾向于在胚胎干细胞系中特异性高表达。通过进一步整合其他转录因子的ChIP-seq数据，我们发现ZNF-TF不倾向与POU5F1(OCT4)，NANOG和SOX2这些核心多能性因子有染色质共定位关系，而是形成一个独立的转录调控模块。　　本论文的第二大部分主要探讨了增强子元件上转录起始的序列特征。转录起始在早期研究中被认为主要发生在基因启动子上。随着CAGE、GRO-seq等实验技术的发展，研究者们发现全基因组中广泛分布着转录起始事件，其中涵盖了增强子等转录调控元件。转录机器在增强子上起始转录的机制以及相关核心启动子序列在增强子与基因启动子之间的异同仍有待全面系统的研究。本论文基于收集的FANTOM项目CAGE数据，对增强子元件的核心启动子序列进行了深入的分析。本论文发现增强子元件上同样有着大量和基因启动子相似的转录起始相关序列特征，如转录起始位点上游30bp附近的TATA-boxmotif、转录起始位点-1/+1处INRmotif和嘧啶-嘌呤二核苷酸序列的富集等。本论文利用增强子上的核心启动子序列构建了基于机器学习手段的分类模型。该模型能对增强子转录单元内的转录起始位点和背景位点进行精准地区分。基于该模型的预测结果，本论文发现核心启动子序列以及每个基因组位点在增强子元件中的相对位置共同决定了该位点被观测到发生转录起始的可能性。

关键词： Polycomb   小鼠胚胎干细胞   复制应激反应   基因组稳定性  

摘要： 胚胎干细胞(ESCs)由于快速增殖的特性存在持续高水平的复制压力,这会危害ESCs基因组的稳定性。然而,ESCs是如何调控复制压力反应来保护其基因组的分子机制还不是很清楚。本研究发现Phc1作为经典的多梳抑制复合物1(Polycomb Repressive Complex 1,PRC1)的一个亚基,通过维持minichromosome maintenance protein 5(Mcm5)和Chk1活性调节小鼠胚胎干细胞(mESCs)的复制应激反应。机制上,我们发现在mESCs中Phc1独立于PRC1与Mcm5相互作用并维持其表达。在mESCs应对羟基脲(hydroxyurea,HU)诱导的复制压力中,Phc1的缺失通过下调Mcm5的表达,使Chk1的活化受损,而过表达Phc1或Mcm5则可以恢复Chk1的活化。Phc1的缺失,使mESCs应对HU时复制应激反应受损,进而引起mESCs细胞周期阻滞,细胞发生凋亡。Phc1敲降也降低mESCs应对HU后的细胞存活。综上所述,我们的研究首次发现了Phc1在维持mESCs基因组稳定性的新作用,并探究其机制,揭示了Phc1通过保证Chk1激酶活性,从而参与复制应激反应,维持mESCs基因组稳定性。

关键词： 胚胎干细胞   基因编辑   N6-甲基腺嘌呤修饰   细胞增殖  

摘要： RNA的m6A修饰在许多生物学过程中具有重要功能，但其在细胞命运变化过程中的功能尚不清楚。Ythdc1是RNA的m6A修饰在核内的识别蛋白，会参与RNA的剪接加工及mRNA的出核过程。不仅如此，作为主要在核内发挥功能的蛋白，Ythdc1会通过结合一些非编码RNA上的m6A，如XIST等，来调控基因的表达。在本课题组的研究中发现，Ythdc1敲除的小鼠胚胎干细胞在血清+Lif（简称SL）的条件下会产生进入2C-like状态的细胞并获得全能性。本课题通过建立m6A编译蛋白Mettl3和Mettl14敲除细胞系探究m6A在2C转化过程中的作用。实验结果表明，敲除Mettl3后细胞的2C相关基因会上调，小鼠胚胎干细胞会发生向2C-like状态的转变，而敲除Mettl14后2C相关基因没有上调。这暗示Ythdc1蛋白调控的小鼠胚胎干细胞的转化可能是通过识别RNA上的m6A介导的，且这些m6A修饰是由Mettl3修饰。由于Mettl14敲除后细胞并没有向2C-like状态转化，说明Mettl3可能具有独立于Mettl14的功能或有其他蛋白可以代替Mettl14稳定Mettl3结构。通过EdU染色实验，我们确定了Ythdc1敲除后细胞增殖会受到抑制，且这种增殖抑制在未转变为2C-like细胞的细胞中也会发生。同时统计发现，当细胞处于2C-like状态时，没有发现分裂相的存在，说明2C-like细胞不能分裂。另外，本课题通过建立Ythdc1-AID细胞系这一可逆且高效的体系进一步探究Ythdc1在调控小鼠胚胎干细胞全能性转化中的功能。我们共获得了6株Ythdc1-AID细胞系。通过对加入IAA浓度的摸索，确定了实验中处理细胞的最佳IAA浓度为500μM。Ythdc1-AID细胞中加入IAA诱导降解Ythdc1蛋白后小鼠胚胎干细胞会向2C-like状态转变，但Ythdc1-AID细胞诱导降解Ythdc1的表型与Ythdc1敲除后的表型并不完全相同。在本课题中利用CRISPRCas9技术构建的凡株细胞系具有重要意义，为后续继续深入研究m6A与细胞命运的关系打下基础。

关键词： 六价铬   生物修复   转录组学   基因工程  

摘要： [目的]铬(Chromium,Cr)污染主要来源于工业活动中废水的排放。自然环境中,以六价铬(Hexavalent chromium,Cr(Ⅵ))和三价铬(Trivalent chromium,Cr(Ⅵ))最为常见,其中Cr(Ⅵ)具有强烈的遗传毒性以及致畸、致癌、致突变作用,严重危害公众健康。近年来,随着Cr(Ⅵ)在环境介质(水、土壤)以及食物中检出增多,如何安全、有效、快速地去除环境中的Cr(Ⅵ)污染备受关注。微生物修复虽然具有绿色环保、高效简便等优势,但微生物种类繁多、修复机制不够明确,限制了微生物修复在环境领域的应用。本研究基于前期分离得到的耐Cr(Ⅵ)菌株Sporosarcinasaromensis M52(简称M52),通过转录组学测序分析对菌株耐受/还原Cr(Ⅵ)的分子机制进行探究,并利用筛选出来的两个Cr(Ⅵ)还原基因构建共表达基因工程菌,探讨其耐受/还原Cr(Ⅵ)的能力、最优还原条件及可能除Cr(Ⅵ)的机制,以期为微生物修复Cr(Ⅵ)污染的实际应用提供理论基础。[方法]本研究以耐Cr(Ⅵ)菌株M52为实验菌株,在确认菌株信息无误后制备种子液,分别接种到对照组(0 mg/LCr(Ⅵ))、低浓度组(50 mg/LCr(Ⅵ))和高浓度组(400mg/LCr(Ⅵ))中进行培养至对数后期,每组设3个平行样,离心菌体,提取M52的总RNA并构建cDNA文库后进行Illumina Hiseq转录组学测序分析。以编码FMN还原酶的Orf2987和编码硝基还原酶的Orf0415为目的基因,与载体pET-30a(+)连接后转化至层coli BL21(DE3),得到共表达基因工程菌,对融合蛋白进行SDS-PAGE可溶性和定位分析,Western Blot实验进一步确认目的蛋白成功表达。在37℃,pH 8.0的条件下,将本次构建的共表达基因工程菌2987&0415、菌株M52、转入空质粒的对照菌株、基因工程菌2987和基因工程菌0415(前期构建)分别置于0、50、100、200、400、800mg/LCr(Ⅵ)溶液中培养,探究其Cr(Ⅵ)耐受和还原能力;设置温度为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃,pH7.0、7.5、8.0、8.5、9.0各五个水平,采用析因实验设计,探究不同温度、pH对菌株Cr(Ⅵ)还原效率的影响,优化最佳还原条件;将菌株置于100mg/L Cr(Ⅵ)中培养48 h,制备菌体样本,经SEM-EDX、XPS、TEM表征分析菌株表面形态和元素组成、官能团变化,对铬酸盐还原产物进行定位,初步探究菌株的Cr(Ⅵ)耐受/还原机制。[结果]转录组学测序分析显示:随Cr(Ⅵ)浓度的提高,越来越多的基因高量表达,参与到对Cr(Ⅵ)胁迫的响应中;与对照组相比,低、高浓度组中分别有633、912个差异表达基因,包括342、477个基因表达显著上调,有291、435个基因表达显著下调。表达上调的基因主要包括Cr(Ⅵ)转运相关基因(如ABC转运家族蛋白、MFS超家族转运蛋白、多重耐药家族外排泵蛋白等)、Cr(Ⅵ)还原酶(如硝基还原酶和FMN还原酶等)、硫氧还蛋白、细胞色素家族、DNA损伤修复、双组分信号转导蛋白、转录调控因子等。成功构建Orf2987和Orf0415共表达基因工程菌,SDS-PAGE显示融合蛋白主要存在于上清中,Western-Blot实验确认两个目的蛋白成功表达。随初始Cr(Ⅵ)浓度升高,菌株生长受到一定程度的抑制,对Cr(Ⅵ)的耐受能力有所下降,各工程菌耐受能力大小为:菌株0415>菌株2987&0415>菌株2987,耐受能力均不如菌株M52;随时间延长,菌株还原率逐渐升高,36h内对50mg/LCr(Ⅵ)的还原率达到87.29%,72h对不超过100 mg/L Cr(Ⅵ)的还原率超过86%,但对200 mg/L及以上浓度Cr(Ⅵ)还原效果低于50%,综合来看,各工程菌Cr(Ⅵ)还原能力大小为:菌株2987&0415≈菌株2987>菌株0415,还原效果均不如菌株M52。共表达基因工程菌对Cr(Ⅵ)的还原受温度和pH的影响,二者呈交互作用,最优还原条件为35～40℃,pH 7.5～8.5。共表达基因工程菌株在Cr(Ⅵ)胁迫下,形态发生改变,主要对Cr(Ⅵ)进行还原,伴有少量的生物吸附。C-C单键、C-O单键、羰基、羟基、羧基等官能团可提供电子,将细胞表面的Cr(Ⅵ)还原为Cr(Ⅲ)并吸附在菌体表面。[结论]转录组学分析揭示了菌株M52对Cr(Ⅵ)的耐受/还原机制:利用多种转运蛋白以及跨膜外排泵实现Cr(Ⅵ)外排,维持细胞生存,增强对Cr(Ⅵ)的耐受;利用胞内可溶性还原酶还原Cr(Ⅵ),并以硫氧还蛋白、细胞色素家族作为电子供体;利用DNA损伤修复系统维持细胞内遗传物质的稳定。成功构建Orf2987和Orf0415

关键词： SHMT2   hESC   红系细胞   分化   扩增   HUDEP-2   丝氨酸代谢  

摘要： 研究目的 多能干细胞是体外诱导获取大量红系细胞的理想种子细胞来源,对于解决临床上红细胞成分输注供需矛盾的问题具有重要价值。但体外诱导人多能干细胞向红系细胞分化面临着诱导效率低下、体外诱导获得的造血干/祖细胞及成熟血细胞存在功能性缺陷的问题。因此,探索关键分子及信号通路在人多能干细胞向造血谱系分化中的作用及分子调控机制,对于优化多能干细胞向红系细胞分化体系具有重要价值。 丝氨酸羟甲基转移酶2（Serine hydroxymethyl transferase 2,SHMT2）是在细胞有氧呼吸和线粒体代谢中发挥重要作用的一种催化酶。大量文献研究表明SHMT2蛋白调控多种肿瘤的发生、肿瘤细胞的存活及增殖。近年来的研究表明Shmt2基因敲除会导致小鼠胚胎发育至13.5天死亡,小鼠胎肝发育缺陷,存在胚胎贫血,提示Shmt2基因在小鼠胚胎期红细胞的发育分化成熟或增殖过程中可能发挥了重要的调控作用。该基因是否参与调控人胚胎期造血发育及红系细胞的定向分化与增殖呢?为研究这一问题,本研究选择人胚胎干细胞（Human embryonic stem cells,hESC）作为研究的起始细胞。hESC具有近乎无限的自我更新能力,并具有向三个胚层组织细胞分化的能力,其向造血细胞分化的模型是研究人类胚胎血谱系细胞发育调控的理想模型。因此,本研究拟基于hESC向造血细胞及红系细胞分化的模型揭示SHMT2基因在人类红细胞发育分化过程中的作用。文献研究表明干细胞分化产生的早期红系细胞具有极强的扩增能力,从而生成足够数量的红细胞以满足机体的需要。为进一步考察SHMT2蛋白对红系细胞扩增的影响,本课题选择人脐带血来源的红系祖细胞系（human umbilical cord blood-derived erythroid progenitor-2,HUDEP-2）作为研究对象来考察SHMT2对红系祖细胞增殖的影响,并对其发挥作用的分子机制进行初步研究。拟通过本课题研究,阐明SHMT2蛋白在人胚胎干细胞向红系细胞分化及扩增过程中的作用,为体外优化以人类干细胞为种子细胞高效制备红系细胞的体系提供理论及实验依据。 研究方法 本研究使用电转染的方法,将已构建的SHMT2基因敲除质粒导入hESC（H9细胞系）,通过嘌呤霉素加压筛选的方法获得SHMT2敲除表达的hESC细胞株,即SHMT2-KO-H9;使用q PCR、Western blot与免疫荧光染色等方法评价SHMT2-KO-H9细胞内SHMT2、多能性相关基因及蛋白的表达情况。进一步将SHMT2-KO-H9细胞植入NOD-SCID小鼠体内进行畸胎瘤形成实验,评价SHMT2-KO-H9细胞是否具有与野生型H9（Wild type H9,WT-H9）相似的多能性。采用基于拟胚体形成的诱导方法建立WT-H9与SHMT2-KO-H9向生血内皮细胞、造血干/祖细胞及红系细胞分化的体系,使用多色流式细胞术、细胞计数等方法检测SHMT2敲除是否影响hESC向造血干/祖细胞及红系细胞的分化;使用q PCR方法检测SHMT2敲除是否影响造血相关及红系特征性的转录因子基因的表达。进一步选择人脐带血来源的红系祖细胞系HUDEP-2作为研究对象。由于丝氨酸是SHMT2作用的底物,选择对其培养基中SHMT2代谢需要的丝氨酸进行干预及添加阻断SHMT2作用的抑制剂SHIN1,使用流式细胞术与细胞计数来考察SHMT2对红系细胞增殖的影响。 研究结果 本研究运用CRISPR/Cas9基因编辑技术,使H9 hESC的SHMT2基因碱基序列出现缺失突变,成功构建了SHMT2敲除的H9 hESC细胞株。对WT-H9与SHMT2-KO-H9细胞的表型进行对比分析,结果表明SHMT2敲除的H9细胞具有与野生型H9相似的细胞克隆形态,其染色体核型维持正常。SHMT2-KO-H9细胞的多能性相关基因和多能性表面标志的表达水平与WT-H9无显著差异,两种细胞均能够在NOD-SCID小鼠体内形成含有三胚层组织结构的畸胎瘤,表明SHMT2敲除不影响hESC的多能性。 在此基础上,本研究基于拟胚体分化策略建立了分阶段诱导WT-H9与SHMT2-KO-H9向中胚层祖细胞、生血内皮细胞、造血干/祖细胞及红系细胞定向分化的体系。流式细胞术结合总细胞计数的检测结果表明SHMT2-KO-H9细胞经该体系诱导分化14天,产生的CD34+CD45+、CD34+CD43+细胞的比例与细胞数显著高于WT-H9。q PCR的检测结果表明,在诱导分化至10天及14天时,SHMT2-KO-H9衍生的细胞内RUNX1和SCL转录因子的表达显著高于WT-H9。流式细胞术分析红系细胞表面标志物表达的结果表明,经该体系诱导分化14天后,SHMT2-KO-H9分化的CD71+CD235a+红系细胞的比例及数

关键词： DNA快速提取   转基因作物   重组酶聚合酶扩增技术   现场检测  

摘要： 在诸多基于核酸的检测方法中,PCR技术(如普通PCR,实时荧光PCR等)是目前国内外已开发的数量最多的一类转基因检测方法,被许多国家作为有关食品法规的标准检验方法。但PCR检测法依赖于精密仪器,且耗时长,无法用于现场检测。本研究基于重组酶聚合酶等温扩增技术(RPA),以转基因玉米和转基因大豆为研究对象,建立了一种可以用于现场的核酸检测技术,简便快捷、低成本,从DNA的提取到核酸扩增结果的检测,均可在现场完成。主要研究结果如下:1.根据硅膜吸附DNA的特异性,结合过滤膜和注射器,建立一种可用于现场的快速提取植物基因组DNA的方法,该方法无需使用液氮、离心机,5分钟内完成DNA的提取。所提取的大豆、棉花、油菜、玉米、水稻5种作物种子和叶片的DNA进行18Sr RNA内源基因的普通PCR和普通RPA扩增,结果良好。2.用普通PCR、荧光RPA和荧光定量PCR对DNA快速提取法提取的转基因大豆SHZD32-1 DNA进行模拟实际检测,3种方法的检测结果一致,均能准确检出大豆SHZD32-1的转基因成分。3.基于荧光RPA,以转基因玉米双抗12-5为研究对象,建立了一种用手持蓝光灯照射扩增产物,佩戴防护镜肉眼直接对扩增产物进行分析判断的可视化检测方法。所建立的转基因玉米双抗12-5可视化检测体系特异性强,检测灵敏度可达10拷贝。4.荧光RPA具有很好的温度适应性,本实验所尝试的使用暖贴和加热包对样品进行加热的方法,20分钟均可使样品完成扩增,且扩增产物可结合可视化检测法用于现场检测。5.本研究将DNA快速提取法与荧光RPA可视化现场检测法相结合,以转基因大豆SHZD32-1为研究对象,建立从DNA提取到核酸扩增结果检测的完整的现场快速检测技术,并进行实际检测验证。结果表明,建立的转基因大豆SHZD32-1可视化检测体系特异性强,检测灵敏度达到10拷贝,实际检测结果与q PCR法检测结果一致,不仅满足了转基因大豆SHZD32-1的现场快速检测的需要,也为其它现场快速检测方法的开发提供新思路。

关键词： 脊髓损伤   NEP1-40   神经干细胞   基因工程  

摘要： 目的1.构建NEP1-40基因工程神经干细胞(Neural stem cell,NSC),探究其自身分化的潜能以及对成熟神经元轴突生长的调节作用;2.通过检测NEP1-40过表达对Rho A/ROCK信号转导通路下游关键调控因子的影响,明确NEP1-40-NSCs促进轴突再生的机制,为脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)的治疗提供理论依据。方法***1-40基因过表达载体的构建:检索已知大鼠的NEP1-40基因序列,合成引物,通过PCR方法扩增NEP1-40基因;将扩增的NEP1-40基因与酶切线性化的载体pc DNA3.1(+)进行定向连接后转化*** DH 5α感受态细胞;利用PCR技术对长出的克隆先进行菌落鉴定,然后对PCR鉴定结果为阳性的克隆进行双酶切鉴定及测序验证;将构建成功的质粒转染原代神经干细胞,分别采用RT-PCR、Western Blot和ELISA方法检测NEP1-40在转录、翻译水平及细胞外的表达情况。***1-40-NSCs的培养、分化及鉴定:提取孕20天SD大鼠的胎鼠原代神经干细胞并采用悬浮培养技术进行培养、传代,应用免疫荧光染色方法行Nestin鉴定;并用不同分化培养基诱导其贴壁分化,行Tuj-1、GFAP、Oligo2及MBP免疫荧光染色对其分化潜能进行鉴定,在免疫荧光显微镜下观察染色结果,同时采用RT-PCR、Western Blot实验方法检测Tuj-1、GFAP、Oligo2及MBP在转录和翻译水平的表达。***1-40-NSCs与大鼠海马组织神经元共培养:实验设计NEP1-40-NSCs为实验组,NSCs组为对照组,以1n M浓度Nogo-66干预,共培养5天后行β-tubulinⅢ免疫荧光染色检测,测量各组大鼠海马组织神经元轴突新增面积,Phalloidine染色观察生长锥及丝状伪足结构;采用Western Blot方法检测轴突及树突再生的标记物如生长相关蛋白43(Growth-associated protein 43,GAP-43)、微管相关蛋白2(Microtubule-associated protein 2,MAP-2)、淀粉样蛋白βA4(AmyloidβA4,APP)的相对表达量;对Rho A/ROCK信号转导通路下游多种调控生长锥的蛋白质底物包括LIMK1,LIMK2,Cofilin以及MLCⅡ在蛋白质水平、磷酸化程度方面进行检测。结果1.经测序和双酶切验证成功构建NEP1-40基因过表达载体,转染NSC后检测NEP1-40在转录和翻译水平的表达量及细胞培养液中的NEP1-40表达量,NEP1-40-NSCs组均显著高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。***大鼠原代NSCs采用悬浮培养技术进行培养、传代,3天后镜下可见大小不一的细胞球形成,长至第7天时检测所有的神经球Nestin表达阳性,达到NSC的鉴定标准;诱导分化实验结果显示,NEP1-40-NSCs组Tuj-1、Oligo2及MBP所标记的阳性细胞数明显高于对照组(P<0.05),然而GFAP标记的阳性细胞数低于对照组(P<0.05),该结果与RT-PCR以及Western Blot检测结果一致。***1-40-NSCs与大鼠海马组织神经元共培养发现NEP1-40-NSCs组的轴突新增面积明显大于NSCs组,差异具有统计学意义(P<0.05);Phalloidine染色能够观察到与NSCs组相比,NEP1-40-NSCs组的生长锥面积增宽,伪足数量增多且长度增加(P<0.05);Western Blot检测轴突再生的标记蛋白相对表达量,结果显示NEP1-40-NSCs组GAP-43、MAP-2蛋白相对表达量上调,而APP蛋白相对表达量下调(P<0.05);与NSCs组相比,Rho A/ROCK通路下游的关键调控因子LIMK1,LIMK2,Cofilin和MLCⅡ的磷酸化程度均明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论1.本研究成功构建NEP1-40基因工程NSCs,在转录和翻译水平以及细胞外均检测到NEP1-40因子的大量表达。***1-40-NSCs在体外能够诱导分化为神经元和神经胶质细胞,并显著提高大鼠海马神经元细胞的存活率。***1-40-NSCs能够克服Nogo-66的抑制作用,促进与其共培养的海马组织神经元轴突的延长,影响生长锥的结构发育,并且其作用机制可能是通过调控LIM激酶,Cofilin和MLCⅡ的磷酸化水平实现促进轴突生长从而实现修复脊髓损伤的效果。