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关键词： L-组氨酸   大肠杆菌   诱变育种   基因工程   响应面优化  

摘要： L-组氨酸被称为半必须氨基酸,它作为营养素被运用到了多种领域中。近些年,越来越多的人开始利用微生物法来生产L-组氨酸,但大部分研究都是以谷氨酸棒杆菌、粘质沙雷氏菌、黄色短杆菌为主,大肠杆菌在这一方面的研究较少。本研究以大肠杆菌作为出发菌株,通过对L-组氨酸合成途径的研究,利用诱变技术和基因工程手段来筛选L-组氨酸高产菌,还对其发酵培养成分以及培养条件进行了优化。以下为主要研究成果: (1)高产L-组氨酸突变菌的筛选:利用化学诱变剂硫酸二乙酯(DES)对大肠杆菌BL21进行两次诱变处。第一次诱变处理后,将处理过的菌液涂布在含有结构类似物D-组氨酸浓度为1 mg/m L的固体培养基中,筛选出10个长势较好的单菌落进行L-组氨酸的测定,将L-组氨酸产量最高的菌进行二次诱变处理,并将诱变菌液涂布在含结构类似物D-组氨酸浓度为2 mg/m L的固体培养基中,挑取5个单菌落,测定L-组氨酸产量,最高产量为1.57 g/L,将其命名为*** BL21-Y1025。 (2)L-组氨酸工程菌的构建:以大肠杆菌K12的基因组作为模板,PCR扩增zwf、prs基因,通过overlap PCR技术克隆出zwf-prs基因片段。以p ETDuet-1质粒为载体,重组构成新的p ETDuet-1-zwf-prs质粒。把重组质粒导入到*** BL21中,目的蛋白成功表达。再通过电转的方法将重组质粒导入*** BL21-Y1025中,用0.1 m M的IPTG进行诱导,测定L-组氨酸产量,结果为1.91 g/L,相比未导入质粒的菌株产量有所提高。 (3)响应面优化:分别从碳源、氮源、无机盐这几个方面进行了培养基优化,对装液量、接种量、IPTG、温度这几种条件进行了发酵条件优化。再先后通过Two-Level设计试验和Box-Behnken试验,得到最优培养基为:硫酸铵浓度为10.24 g/L、酵母提取物浓度为26.92 g/L、磷酸二氢钾浓度为0.98 g/L、蔗糖40 g/L、硫酸镁1.0 g/L、氯化钠10g/L,在接种量为3%、IPTG浓度为0.5 m M、装液量为100 m L、诱导温度为30℃的条件下发酵24 h,产量为4.12 g/L,还从发酵曲线上确定了发酵时间为36 h,产量为4.33g/L。

关键词： 大肠杆菌   维生素B6   磷酸吡哆醛(PLP)   基因工程   响应面优化  

摘要： 磷酸吡哆醛(Pyridoxal-5’-phosphate,PLP)是由维生素B与磷酸结合形成的,是维生素B的主要辅酶形式,还是140多种细胞酶的辅酶,在生物体内发挥广泛、重要的作用。目前PLP的合成方法有化学合成法和酶催化合成法,利用基因工程手段研究PLP产量的较少。所以本文以基因工程手段为基础,在大肠杆菌体内构建表达载体,并优化发酵条件,提高PLP的产量。主要研究结论如下:(1)本课题以实验室保藏的*** K12基因组为模板,通过PCR反应扩增磷酸吡哆醛(PLP)合成过程中的关键酶基因pdxj,以pETDuet-1质粒为载体构建表达载体pETDuet-1-pdxj。以野生型*** BL21为出发菌株,将重组质粒导入*** BL21感受态细胞,得到工程菌株*** BL21/pETDuet-1-pdxj。(2)以构建得到的重组质粒pETDuet-1-pdxj为载体,通过PCR体系扩增关键酶基因zwf-dxs,将其作为目的基因片段连接到载体质粒pETDuet-1-pdxj上,得到重组质粒pETDuet-1-pdxj-zwf-dxs。以实验室保藏的野生型*** BL21为出发菌株,得到基因工程菌株*** BL21/pETDuet-1-pdxj-zwf-dxs。通过SDS-PAGE蛋白电泳验证,三个关键酶基因在细胞内高效表达相应蛋白。(3)以野生型*** BL21菌株作对照,确定两菌株发酵液中PLP的产量差异显著,并对工程菌株的发酵培养基和发酵条件在摇瓶水平上进行优化。设计单因素实验和Two level factorial试验,筛选出对PLP发酵过程影响最显著的因子,分别为葡萄糖浓度,酵母浸膏浓度和培养基初始p H。用三个显著因子设计Box-Behnken响应面实验,通过回归方程分析获得显著影响因子的最佳组合条件:葡萄糖浓度34.89g/L,酵母浸膏浓度31.17g/L,初始p H10.07时,PLP的预测产量为2.49g/L。对上述结果进行验证试验,得到PLP的产量为2.23g/L。在1L摇瓶条件下,制作PLP的发酵曲线,最终确定发酵培养时间为12h,发酵液中PLP的产量为2.32g/L。对比*** BL21菌株,PLP的产量提高了38.76倍左右,确定得到磷酸吡哆醛(PLP)高产菌株*** BL21/pETDuet-1-pdxj-zwf-dxs。

关键词： 四环素诱导系统   c-Myc   角膜上皮细胞   多西环素   小分子化合物   胚胎干细胞   扩增  

摘要： 【目的】构建四环素系统调控c-Myc基因表达的人胚胎干细胞模型;探究c-Myc基因对人胚胎干细胞来源角膜上皮样细胞扩增及分化的影响。【方法】实验细胞:人胚胎干细胞H9细胞系(h ESCs H9)。1.采用拟胚体联合2种小分子化合物(S B505124和IWP-2)及碱性成纤维细胞生长因子的方法对人胚胎干细胞H9细胞系(h ESCs H9)进行诱导,分别于诱导10d、15d和20d观察细胞形态,取材,用免疫荧光法和定量实时PCR法对特征性标志物OCT4、SOX2、ΔNp63、CK14、CK3、CK12进行基因及蛋白水平检测。2.利用成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9(CR ISPR/C as9)基因编辑技术,通过设计网站http://***/htgt/wge/在h AAVS1位点设计出c-Myc小向导RNA(sg RNA),根据所选的sg RNA设计并构建打靶载体和sg RNA/Cas9表达载体,两载体经酶切和测序鉴定后共电转入h ESCs H9细胞中,嘌呤霉素进行抗性筛选并挑选单克隆,扩增培养后对挑选的克隆进行PCR鉴定。培养过程中,通过向阳性克隆H9细胞的培养基中加入不同浓度的诱导药物多西环素(Dox),诱导外源c-MycB F P基因表达,采用荧光显微镜及流式细胞术对BFP标记进行观察,进一步验证系统(Tet-On-c-MycB F P-h ESCs)的有效性。3.选用(2)中获取的阳性克隆1-D07作为种子细胞,采用(1)中方法对1-D07与野生型H9细胞(WT H9)进行同步诱导培养。根据h ESCs H9中是否转入Tet-On-c-MycB F P、诱导过程中是否向培养基中加入Dox及加入时间的不同,将实验分为4组,分别为野生型(WT)组、未加入Dox的1-D07(1-D07 Dox-)组、诱导7d加入Dox的1-D07(1-D07 Dox+d7)组和诱导9d加入Dox的1-D07(1-D07 Dox+d9)组。分别对ESCs、诱导10d、15d和20d的4组细胞取材,用免疫荧光法和定量实时PCR法对特征性标志物c-Myc、OCT4、SOX2、ΔNp63、CK14、CK3进行基因及蛋白水平检测。采用CCK-8实验观察诱导20d-节点4组细胞的增殖能力。【结果】1.诱导后细胞形态改变,类似角膜上皮细胞形态,与胚胎干细胞明显不同。相比ESCs,诱导后细胞干性标志物OCT4和SOX2基因的m RNA表达下调(P<0.01),免疫荧光染色无OCT4荧光表达;诱导后角膜上皮祖细胞及角膜上皮细胞标志物ΔNp63、CK14、CK3和CK12的m RNA表达均上调(P<0.05),免疫荧光染色观察到ΔNp63和CK3荧光表达。2.电转后经PCR鉴定挑选出6个插入片段依次正确整合的阳性克隆1-A06、1-B06、1-D05、1-D07、1-E06和1-E07,选择1-D07克隆进行后续实验。荧光显微镜下观察可见,加入不同浓度Dox培养的1-D07显示出不同强度的蓝色荧光,其中10.0mg/m L浓度组荧光最强。流式细胞分析也显示出相似结果,野生型H9无BFP表达,而1-D07各组均可见不同程度的BFP表达,其中10.0mg/m L浓度组细胞的荧光强度与荧光表达率均最高。尽管未加入Dox的1-D07也显示有BFP表达,但在荧光显微镜下不能观察到,且荧光强度的定量分析显示,未加入Dox的1-D07荧光强度明显低于加入Dox的分组,差异有统计学意义(P<0.01)。3.免疫荧光结果显示,电转后的阳性克隆1-D07与野生型H9可见干性标志物OCT4和c-Myc表达。诱导第20天,4组细胞均不再表达OCT4,仅2个加入Dox诱导的分组持续表达c-Myc,WT组与1-D07 Dox-组则未见c-M yc表达。诱导第20天,WT组、1-D07 D ox-组与1-D07 D ox+d9组可见角膜缘干细胞标志物ΔNp63和角膜上皮标志物CK3的表达,而1-D07Dox+d7组ΔNp63表达较弱,不表达C K3。定量实时PCR也显示相同结果,诱导后,4组细胞的干性标志物OCT4和SOX2 m RNA较ESCs均下调,未加入Dox的2组细胞干性标志物c-Myc m RNA显著下调,加入Dox的2组细胞c-Myc表达呈不同程度的上调,其中1-D07 Dox+d7组上调更为明显。诱导后,WT组、1-D07 Dox-组与1-D07 Dox+d9 3组细胞的角膜缘干细胞标志物ΔNp63、角膜上皮前体细胞标志物CK14和角膜上皮标志物CK3 m RNA相较ESCs均有上调,且随时间大致呈上升趋势,1-D07 D ox+d7组细胞仅见ΔNp 63 m RNA轻度上调,表达水平低于其余3组,CK14及CK3则未见明显上调。诱导20d,加入

关键词： 酰胺类化合物   平邑甜茶   根系生长   MhTIR1  

摘要： 根系调控是果树优质丰产的基础,是果树遗传育种和果园栽培管理的核心。寻找新型绿色环保小分子化合物并探究其在苹果生长发育中的作用,对苹果产业的提质增效具有重要推动意义。本团队合成了10种新型酰胺类化合物,初步研究发现这些化合物能够促进模式植物根系生长。为明确新型酰胺类化合物对根系发育的调控效果,探究其在苹果产业中的应用,本研究以‘平邑甜茶’为实验材料。通过幼苗试验,探索新型酰胺类化合物对根系生长与功能的生理机制;利用组织培养和栽培试验,探究新型酰胺类化合物在苹果产业中的应用模式;通过研究植物自身对酰胺类化合物的响应,利用基因工程技术推动苹果根系遗传改良。将环境调控的外因与遗传改良的内因相结合,实现苹果理想根系构型调控。主要结果如下:(1)在偏苯三酸酐的羧基和酸酐基上添加不同的酰胺侧链,合成了10种能调控植物生长发育的新型酰胺类化合物。幼苗试验证明,2-(4-甲氧基苄基)-5-(2-氧代噻唑烷-3-羰基)异吲哚啉-1,3-二酮(编号XA-9)和2-(3-氯苄基)-7-(2-氧代吡咯烷-1-羰基)-2,3-二氢异喹啉-1,4-二酮(编号XA-19)对苹果根系生长具有明显的促进作用。酰胺类化合物处理根系后,主根长度较对照分别提高了52.9%、112.5%。(2)XA-9在2 nM、10 nM和50 nM三个浓度均能促进主根的伸长,对侧根发生具有低促高抑的效果,10 nM时侧根密度最高,50 nM时促进效果消失。XA-19对主根伸长具有低促高抑的效果,在2 nM和10 nM浓度主根长度增加了76.89%、136.20%,当浓度达到50 nM时,对主根生长的促进效果消失。(3)组培生根培养基中添加XA-9,不定根数量、侧根密度、根长和根系活力较对照组分别增加64.3%、62.3%、39.9%和21.8%。添加XA-19后不定根数量增加60.5%,但侧根密度、根长和根系活力较对照组分别降低95.0%、44.5%和9.9%。(4)盆栽试验中,XA-9处理后‘平邑甜茶’组培移栽苗的根长、根尖数量和根系活力较对照分别提高86.5%、75%和86.9%。XA-19处理后根长、根尖数量和根系活力分别提高15.2%、17.8%和24.3%。XA-9和XA-19处理均能增加根系中抗氧化酶SOD和POD酶活,提高‘平邑甜茶’根系的抗逆能力。(5)利用RNA-seq技术分析XA-9和XA-19对‘平邑甜茶’根系转录组的影响。XA-9诱导4946个差异表达基因,XA-19诱导4131个差异基因表达。1851个基因在两种处理下表达均发生变化,占差异表达基因总数的25.62%。两种处理下大部分差异表达基因主要参与苯丙素的生物合成、植物激素信号转导途径和细胞周期等代谢等通路。利用RT-q PCR技术对转录组测序结果进行验证,选取的8个基因(TIR1,IAA31,GH3.17,LAX2,ARR9,ERF1,BSK2,MYC2)表达变化趋势与转录组数据一致,证明转录组数据可信度高。(6)构建35S::MhTIR1-GFP过表达载体,通过发根农杆菌转化‘平邑甜茶’叶片得到转基因根系,发现MhTIR1能促进‘平邑甜茶’主根的生长,并增加侧根密度。

关键词： 微生物酯酶   酶抑制法   有机磷农药残留检测  

摘要： 多年来有机磷和氨基甲酸酯类农药在农业生产中被广泛用于消灭害虫,为农业增产保产作出了重要贡献。但其中毒性较大的农药已被陆续禁止或限制使用,然而仍存在超量使用、超范围使用和隐性添加等违规行为,导致农产品质量安全事件频发。实现上述农药残留的快速简便检测是农产品质量安全监管的重要抓手。酶抑制方法于上世纪60年代Ellman等人提出,多年来关于酶抑制法的研究不断深入,我国于2001起陆续颁布了5个相关国家/行业标准,可分别针对12种/18种有机磷和氨基甲酸酯类农药进行检测,已成为农产品质量安全监管的主要技术手段,虽然存在灵敏度低、准确性差等问题,但对规范农产品市场起到了重要作用。二十年过去了,我国农药残留限量标准越来越严格,农产品中高风险的有机磷和氨基甲酸酯类农药种类也发生了很大变化,这些标准方法检测结果的假阳性假阴性比例超过了允许范围,已不适应新时代监管的需求,急需针对该方法的改进和创新。在此背景下,本研究选取敌敌畏、敌百虫等高风险有机磷农药,旨在对基于课题组通过基因技术获得一种催化效率高、农药敏感性强的微生物酯酶进行分离纯化及酶学性质表征,优化反应条件,进一步建立一种基于微生物酯酶与荧光分析的有机磷农药残留快速检测方法,开发出敌敌畏残留快检试剂盒。主要研究内容和结果如下:1.大肠杆菌表达重组微生物酯酶纯化及其表征。采用镍柱亲和层析纯化前期获得的重组微生物酯酶,除杂蛋白,并采用SDS-PAGE电泳分析验证。电泳结果表明:微生物酯酶的分子量为36k Da,在电泳中呈单一条带,获得了高纯度的酶液。进一步研究其酶学性质,发现该酶的K=0.033mmol/L,最适p H为7.5,最适温度为50℃。该酯酶对乙腈表现出较差的耐受性,但能耐受低浓度的甲醇和乙醇,Fe、Fe和Cu对该酶的活性有一定的抑制作用,其中Cu的抑制作用最为明显,在加入0.1%BSA作为稳定剂后,其活性在放置240 min后依旧较为稳定。2.基于微生物酯酶和荧光分析的有机磷农药残留检测方法的建立。通过对微生物对4种底物水解情况的结果分析,选择吲哚乙酸酯作为最适水解底物,确定检测方法的最优条件为:酶浓度0.067 U/m L,底物浓度0.5 mmol/L,抑制反应时间15 min,在最优条件下测定敌敌畏等5种有机磷农药的抑制率并建立标准曲线。结果显示:敌敌畏、敌百虫、甲胺磷、丙溴磷和对氧磷最低检出限分别为0.0032 mg/L、0.0096 mg/L、0.0990 mg/L、0.0990 mg/L和0.0074 mg/L,各农药的标曲方程的R均大于0.99,满足国家标准限量检测要求。选择梨和大白菜为代表性样品,对该法在果蔬样品中有机磷农药残留检测进行可行性验证,平均回收率80%-105%,RSD低于5%,表明该方法可应用于实际样品中有机磷农药残留的检测。3.冻干微生物酯酶稳定性及其检测敌敌畏残留的应用。通过研究微生物酯酶冻干液浓度、冻干方式,选择冻干液浓度为15%,液氮速冻作为冷冻处理方式,在该方案下冻干微生物酯酶在30天内酶活力仍保持在80%以上;进一步对酶浓度、底物浓度以及抑制反应时间等条件进行优化,建立敌敌畏检测标准曲线,计算半数抑制浓度和检出限,拟合方程R2=0.9903、IC≈0.026 mg/L和LOD≈0.006 mg/L,与国标《GB5009.199-2003蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测》中提出的IC进行对比,该方法的灵敏度更高。在此基础上开发了基于微生物酯酶的敌敌畏残留速测产品,经梨实际样品检测,该产品检测的平均回收率80%-90%,表明能满足实际样品中敌敌畏农药残留的快速检测。

关键词： Prmt1   胚胎干细胞   扩展多能性干细胞   滋养层干细胞   类囊胚  

摘要： 本论文包含两部分工作。第一部分:探究Prmt1在小鼠早期胚胎发育中的作用该部分工作是与医科院基础所张业教授课题组合作完成。蛋白质翻译后修饰是调节蛋白质功能的重要方式,参与了机体内几乎所有的生物学过程。精氨酸甲基化是蛋白质翻译后修饰的一种重要形式,其功能主要由精氨酸甲基转移酶(protein-arginine methyltransferases,PRMT)家族完成,该家族包含9个成员:PRMT1-9。其中,PRMT1是最重要的一个成员,承担了哺乳动物细胞内85%以上的蛋白质精氨酸甲基化事件。有文献报道,纯合敲除Prmt1基因会导致小鼠在胚胎6.5天(E6.5)前发生死亡,提示Prmt1在小鼠早期胚胎发育中发挥了重要作用,但其作用机制尚不清楚。张业教授课题组的前期研究发现,在小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)中敲除Prmt1后,Gata4和Gata6基因的表达水平显著升高。经单细胞RNA测序(single-cell RNA sequencing,scRNA-Seq)分析,发现在 Prmt1敲除的细胞中,出现了一个高表达Gata6且低表达Nanog的细胞群,与原始内胚层(primitive endoderm,PrE)细胞的基因表达谱较类似,提示Prmt1可能在胚胎发育的第二次细胞命运决定中发挥重要作用,因此,我们通过囊胚(blastocyst)显微注射和体外培养囊胚的方法进行验证。盐酸呋喃脒(Furamidine dihydrochloride,Fur)是PRMT1的抑制剂,在小鼠ESC培养基中加入10μM的Fur,培养24小时后就可以明显抑制PRMT1的活性。将Fur处理后的ESCs注射到E3.5的小鼠囊胚中,然后将囊胚移入到假孕母鼠子宫内,待发育至6.5天时,将胚胎取出并观察注射的ESCs在胚胎中的分布情况。与未处理的细胞相比,经Fur处理后的ESCs不但可以嵌合到上胚层(epiblast,Epi),还可以嵌合到脏壁内胚层(Visceral endoderm,VE)部分,而VE正是由PrE发育而来。表明PRMT1的活性被抑制后,部分ESCs获得了更强的向PrE分化的能力。随后,我们在体外培养的E3.5囊胚中进行验证,当KSOM培养基加入10μMFur后,经24小时培养后的囊胚中GATA6阳性细胞(代表PrE部分)与NANOG阳性细胞(代表Epi部分)的比例显著上升,证实PRMT1的存在会抑制内细胞团(Innercell mass,ICM)向 PrE 分化。综上所述,我们经体内和体外实验证明在早期胚胎发育的第二次细胞命运决定过程中,PRMT1具有维持ICM向Epi分化的能力;其活性被抑制后会导致更多的细胞向PrE分化,为解释Prmt1纯合敲除小鼠为何会发生胚胎致死提供新的线索。第二部分:利用两类囊胚来源的干细胞在体外构建小鼠“类囊胚”在哺乳动物早期胚胎发育研究中,常常面临早期胚胎较难获得、胚胎数量不足等问题,极大地限制了对胚胎早期发育的深入研究。此外,由于伦理的限制,人的早期胚胎更加难以得到。为了解决胚胎学研究中存在的这些问题,近年来随着多种类型干细胞在体外成功培养建系,人们开始尝试利用多种类型干细胞在体外构建类似于胚胎的3D组织结构。2018年,荷兰科学家Niels Geijsen等人使用ESC与滋养外胚层干细胞(Trophoblast stem cell,TSC)混合培养,获得形态结构与E3.5囊胚较类似的结构,将其定义为类囊胚(blastoid)。这为研究胚胎发育过程及相关机制提供了新的模型。虽然类囊胚与自然的囊胚结构和细胞组成上都比较类似,但其在体外继续培养或者移植回小鼠子宫内后,均不能进一步正常发育至原肠期,分析表明类囊胚中PrE的细胞数量明显少于自然囊胚,为解决这一问题,我们尝试使用新建立的扩展多能性干细胞(Extended pluripotent stem cell,EPSC)与TSC进行类囊胚的构建。EPSC是2017年北京大学邓宏魁教授,英国Sanger研究所刘澎涛研究员分别提出的新型多能干细胞。与ESCs类似,EPSC在体外培养均具有自我更新能力和多能性。此外,EPSC细胞还可以参与到胚外组织的发育过程,如胎盘、卵黄囊等,这是ESC一般不具备的能力。我们使用EPSC与TSC混合培养,成功构建了“类囊胚”。另外,借鉴经典“四倍体补偿实验”的策略,我们首先成功建立了四倍体TSC系(TTSC),然后使用EPSC与TTSC细胞进行混合培养,也能够成功获得类囊胚。将这些类囊胚移植回假孕母鼠的子宫内,观察到类囊胚成功着床并诱导蜕膜结构的产生。表明我们成功构建了新型类囊胚。但它们是否具有进一步的发育潜能,还需要深入研究。

关键词： 人孤雄单倍体胚胎干细胞   精子核移植   受精胚胎   前原核去核法   单倍体核型  

摘要： 单倍体胚胎干细胞(haploidembryonicstemcells，haESCs)是从含有卵子或精子核遗传物质的单倍体囊胚中建立的胚胎干细胞系（分别称为孤雌和孤雄单倍体胚胎干细胞）。孤雌和孤雄单倍体胚胎干细胞可以结合CRISPR-Cas9基因编辑技术实现细胞水平的大规模遗传筛选，为哺乳动物的功能基因研究提供新的手段。另外，孤雄单倍体胚胎干细胞还可以作为精子的替代物通过卵子注射产生健康半克隆小鼠（又被称为类精子干细胞），其结合CRISPR-Cas9技术可以开展个体水平的遗传筛选研究。到目前为止，啮齿类小鼠和大鼠，灵长类食蟹猴、恒河猴和人类的孤雌单倍体胚胎干细胞均已成功建立，而孤雄单倍体胚胎干细胞只在小鼠和大鼠中成功建立，因此，灵长类动物的精子是否可被重编程成为孤雄单倍体胚胎干细胞是重要科学问题。　　通过改良的基于受精胚胎前原核去核法构建人的精子核移植胚胎，结合优化的人胚胎干细胞低氧环境建系方法，成功建立了两株只携带精子遗传物质的人孤雄单倍体胚胎干细胞系(HumanandrogenetichaESCs，hAG-haESCs)。单倍体细胞会自发二倍体化，hAG-haESCs可通过定期流式细胞分选(FluorescenceActivatedCellSorting，FACS)富集单倍体细胞的方法长期稳定维持单倍体核型;另外，通过比较不同的培养体系发现，我们采用的KSR/bFGF培养体系和MEF（mouseembryonicfibroblasts）饲养层细胞是稳定维持单倍体特性的两个重要因素;该细胞具有体内体外三胚层分化能力，并且在分化过程中，具有非常稳定的单倍体维持能力。　　进一步，围绕hAG-haESCs开展了三方面的应用研究。第一，结合全基因组甲基化测序技术(WholeGenomeBisulfiteSequencing，WGBS)和转录组测序技术(RNAsequencing，RNA-seq)，我们发现hAG-haESCs和人孤雌单倍体胚胎干细胞(hPG-haESCs)可以维持广泛的印迹基因的甲基化修饰特征和亲本特征的转录本表达模式，进而通过比较hAG-haESCs和hPG-haESCs的转录组和DNA甲基化修饰的特征发现一系列潜在的新的印记基因。第二，单倍体细胞二倍体化后形成了携带两条X染色体的二倍体细胞，为开展X染色体失活调控机制提供了新的手段。我们系统分析了二倍体化来源的人孤雄二倍体胚胎干细胞X染色体状态，发现单倍体二倍体化得到的人孤雄胚胎干细胞呈现两条X染色体都活化、XIST基因启动子到第一个外显子范围内的CpG岛高甲基化、且不表达XIST的状态;而这些细胞在体内形成的畸胎瘤中分化的体细胞建立了一条X染色体活化而另一条X染色体失活的典型体细胞X染色体失活的状态。第三，我们建立了人卵子胞浆内单倍体胚胎干细胞注射技术，发现hAG-haESCs可以替代精子使卵子“授精”，并在体外发育到囊胚。进一步对重构囊胚开展了单细胞转录组测序（singlecellRNAsequencing，sc-RNAseq）研究，发现其与正常受精来源囊胚高度相似。最后，我们从重构囊胚中建立二倍体胚胎干细胞系，发现这些细胞具有正常胚胎干细胞相似的特征。这些研究首次证明了灵长类（人类）精子可以被成功重编程成为可体外长期培养的单倍体胚胎干细胞，建立了基于人类精子干细胞的半克隆技术，为人类早期胚胎发育研究提供了新工具。

关键词： 微囊藻   胞外碱性磷酸酶   PhoX   噬菌体展示技术   驼源纳米抗体   免疫荧光技术  

摘要： 以微囊藻为优势种的蓝藻水华问题已备受关注。磷是微囊藻大量生长所必须营养元素,因此,弄清磷代谢的过程十分必要。水体中的有机磷是蓝藻的重要磷源,胞外碱性磷酸酶PhoX在这一代谢过程中起关键作用,微囊藻的PhoX迄今尚未被研究确认。对微囊藻PhoX进行准确定量,也是厘清水华暴发水体中磷代谢过程所的重要环节,然而迄今并无有效手段。本实验基于对铜绿微囊藻Microcysits aeruginosa *** PCC7806（*** PCC7806）基因组的分析,寻找到了一个可能是胞外碱性磷酸酶PhoX的基因（Accession ***79942.1）,并对这一基因进行了大肠杆菌表达,继而对表达的酶进行了一系列的酶学性质分析,对该酶进行了确认;探究了*** PCC7806中碱性磷酸酶基因phoX,phoA在不同磷条件下的表达响应;以*** PCC7806的胞外碱性磷酸酶蛋白作为抗原,基于噬菌体展示技术,在商品化的驼源纳米抗体库中筛选特异性的基因工程抗体,为PhoX的定量开发精确有效的工具。具体研究结果如下:（1）通过构建表达载体,表达、纯化微囊藻phoX基因,对该蛋白进行一系列性质分析。Western-blot和SDS-PAGE结果表示该目的蛋白的分子量大小约为88 k Da,与预期表达的大小吻合。生物信息学分析显示该蛋白含735个氨基酸残基;其二级结构的α-螺旋主要分布在氮端;蛋白质翻译后修饰的预测存在大量的糖基化和磷酸化位点;该蛋白为亲水蛋白,无跨膜结构域,但具有氮端Tat-way信号肽;以上这些均与胞外碱性磷酸酶的特征相符。表达出的PhoX表现出磷酸二酯酶和磷酸单酯酶活性,确认该蛋白为碱性磷酸酶。该酶的最适温度为37℃,最适p H值为10;作为辅酶的二价金属离子中Mg2+活性最高,其他依次为Co2+、Ca2+、Zn2+和Mn2+,Ni2+抑制该酶。（2）将在BG11培养基中培养到对数期的*** PCC7806分别转移到无磷(BG11（-P）)、无机磷（BG11）和有机磷(BG11（-P+AMP）)培养基中进行培养,分别在0,2,4,6 h取藻细胞进行RT-q PCR实验,分析胞外碱性磷酸酶蛋白编码基因phoX和胞内碱性磷酸酶phoA基因的表达以及细胞总体碱性磷酸酶活性的变化。结果显示不同环境磷对phoX的表达有显著的响应。在缺磷培养基(BG11（-P）)中培养时,phoX表达在2 h时达到最高水平,然后在4 h下降到一个低水平。（3）基因分析显示PhoX在微囊藻属中的高度保守性,与其他蓝藻均有较大的差异。以*** PCC7806的PhoX蛋白为抗原,基于噬菌体展示技术,从驼源纳米抗体库中筛选基因工程抗体。经过三轮的淘筛,最终得到4个VHH抗体。对其中（阳性/阴性）P/N值为10.35的3H进行表达His-tag亲和柱纯化,获得了18 k Da的抗体蛋白VHH-3H。对该抗体进行FITC荧光化标记,免疫荧光反应验证了荧光化抗体FITC-VHH-3H对微囊藻胞外碱性磷酸酶有特异性结合能力。并通过ELISA对纳米抗体VHH-3H的特异性进行了验证。该抗体可用于水体中微囊藻碱性磷酸酶的分析,也可用于环境水样中微囊藻细胞的鉴定。

关键词： 小桐子   种子   叶片   油脂   脂肪酸   甘油三酯  

摘要： 小桐子(Jatropha cucas L.)被认为是最具有潜力的能源植物之一,其种子含油率高达40%以上,富含油酸。作为非食用油料作物,小桐子不与粮争地,而且可以适应贫瘠的生存环境,是具有发展潜力的能源植物资源。但由于目前小桐子的产油量较低,经济价值较低,难以大规模商业化推广种植。为了提高小桐子经济价值,本研究主要致力于提高小桐子油产量,改善油的品质,使其能更好地满足生物能源产业化的需求。在植物油脂合成代谢途径中,二酰基甘油酰基转移酶(Diacylglycerol acyltransferase,DGAT)是唯一能催化 sn-1,2-二酰基甘油(sn-1,2-Diacylglycerol,DAG)酰基化生成三酰基甘油(triacylglycerol,TAG)的酶,是肯尼迪途径的限速酶。小桐子中主要的DGAT酶是JcDGAT1和JcDGAT2,这两种酶以前仅在异源系统中被验证功能。本研究在小桐子中超量表达了JcDGAT1和JcDGAT2,显著提高了其油脂含量,同时对JcDGATs在小桐子油脂代谢中的功能有了进一步的了解。结果表明JcDGAT1和JcDGAT2具有相似的表达模式,主要在小桐子种子积累油脂阶段即种子发育后期表达量升高。我们用35S启动子驱动JcDGAT1和JcDGAT2在小桐子中超量表达,发现35S:JcDGAT1和35S:JcDGAT2转基因小桐子种子含油量显著提高,分别达到了种子干重的53.7%和55.7%,比对照组提高了 25%和29.6%。种子中油脂含量的升高伴随着可溶性糖和蛋白含量的降低。在转基因叶片中TAG的含量达到了对照组的2-4倍。同时,转基因种子和叶片油脂中的脂肪酸组分百分比发生了显著变化。与对照组相比,在转基因种子中,JcDGATs更倾向于选择亚油酸(linoleic acid;C18:2)作为底物加入到TAG分子中;而在转基因叶片中,则更倾向于选择棕榈酸(hexadecanoic acid;C16:0),硬脂酸(octadecanoicacid;C18:0)以及油酸(oleicacid;C18:1)。我们的结果进一步确定了 JcDGAT1和JcDGAT2在小桐子中合成油脂的重要性。在植物非种子组织器官中合成和积累油脂近年来备受关注,很多油脂代谢通路基因被应用在叶片和块茎等非种子组织的油脂代谢基因工程研究中。为了提高小桐子油产量,我们希望能在生物量很大的叶片中提高其油产量。为此我们采用包含拟南芥WRINKLED1转录因子(AtWRI1),拟南芥DGAT基因(AtDGAT1)以及芝麻油体蛋白基因(SiOleosin)的植物表达载体pOIL040转化小桐子,通过三个基因共同表达来提高小桐子叶片油脂含量和品质。结果显示在转基因叶片中,TAG含量提高到了 342 μg/100 mg,是野生型叶片TAG含量的10倍,同时伴随着叶片可溶性糖和淀粉含量显著下降;蛋白质含量升高为野生型叶片总蛋白的4倍。与定量测定分析结果一致的是通过激光共聚焦显微镜观察中性脂滴,发现在转基因叶肉细胞中脂滴密度明显增加变密。另外转基因叶片TAG脂肪酸组分发生了显著变化。TAG分子中棕榈酸(C16:0),油酸(C18:1)以及亚油酸(C18:2)分子百分占比显著增加,同时亚麻酸(C18:3)百分比显著下降。表明脂肪酸组分的饱和程度变高,氧化稳定性增强。为了增强对小桐子叶片油脂代谢途径的了解,本研究对pOIL040转基因小桐子和对照组叶片进行了转录组和脂质代谢组联合分析。转录组数据分析结果显示,多个糖酵解以及脂肪酸合成,甘油酯和甘油磷脂代谢通路相关基因在转基因叶片中受到了调控。我们用qRT-PCR验证了这些基因的表达数据,结果显示与转录组数据结果一致。脂质代谢组定量数据说明,转基因株系叶片中游离脂肪酸(FFA)、二酰基甘油(DAG)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油酯(PG)、双半乳糖甘油二酯(DGDG)以及单半乳糖甘油二酯(MGDG)的绝对含量都显著提高;但是其叶片脂质种类的百分比发生了变化。TAG在叶片中的百分比显著提高,而极性脂质如PC,PG,DGDG百分占比降低,只有MGDG略微提高。同时与野生型相比,每一种脂质的分子种类都发生了变化。这些脂质代谢组数据与转录组数据综合分析结果表明:三个基因协同表达对整个叶片油脂代谢通路产生了极大的影响。这些结果对于我们进一步找到优化叶片油脂代谢通路的方法具有重要意义。