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关键词： 非整倍体   双三体   胚胎干细胞   增殖   分化   畸胎瘤  

摘要： 该文旨在研究双三体胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)在细胞增殖、分化以及畸胎瘤形成等方面的特征,揭示非整倍体与肿瘤发生之间的关系。首先建立了两株常染色体双三体的小鼠ESC株系,通过微阵列比较基因组杂交(array comparative genomic hybridization,array CGH)和荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)实验对双三体ESC株系进行了染色体拷贝数分析和核型鉴定;通过绘制细胞生长曲线检测了双三体ESCs的增殖能力;通过流式细胞术检测了双三体ESCs的细胞周期和细胞凋亡情况;采用细胞克隆形成实验分析了双三体ESCs的克隆形成效率;通过实时荧光定量PCR和免疫荧光染色实验检测了双三体ESCs中多能干细胞标志物的表达;通过撤掉培养体系中的白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)诱导分化和进行拟胚体(embryoid body,EB)形成实验检测了双三体ESCs的分化能力;通过重度联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency,SCID)小鼠皮下接种细胞实验分析了双三体ESCs的畸胎瘤形成能力和体内分化能力。结果显示,这两株双三体细胞分别是3号与6号染色体双三体并伴有Y染色体丢失的ESCs(DTs-3+6),以及6号与8号染色体双三体的ESCs(DTs-6+8)。双三体ESCs表现出相对于野生型细胞较强的生长增殖能力和OCT4、SOX2、NANOG等多能干细胞标志物的高表达。当培养液中不添加LIF时,野生型细胞基本完全走向分化,而双三体细胞形成许多未分化或部分分化的克隆,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)染色阳性。在EB分化早期,双三体细胞中Fgf5、T、Foxa2等三胚层标志物的表达水平较野生型细胞明显降低,分化滞后。当被接种到SCID小鼠皮下后,双三体ESCs形成畸胎瘤的能力较野生型细胞增强,畸胎瘤中包含大量未分化区域。因此,双三体ESCs的生长增殖能力增强,它通过限制细胞分化能力而促进畸胎瘤形成。双三体ESCs是研究非整倍体在肿瘤发生发展过程中作用的重要模型。

关键词： 视网膜类器官   3D培养   胚胎干细胞   光感受器前体细胞  

摘要： 目的利用CRISPR/Cas9技术构建Crx-iCreERT2红色荧光报告人胚胎干细胞(ESCs)系及其3D视网膜类器官培养。方法对H9细胞系靶位点序列进行PCR扩增并测序验证后,利用CRISPR/Cas9技术设计多条sgRNA并对其进行活性检测,根据活性、特异性等因素选择最合适的sgRNA。经酶切鉴定和测序确认打靶载体构建完成后,将打靶载体电转H9细胞系,在hES-ZLM-001基因Exon4和3’-非翻译区之间终止密码子前插入P2A-tdTomato-P2A-iCreERT2,进行药物筛选、阳性克隆富集。设计引物对目标区域进行PCR扩增并测序,根据测序结果和测序峰图选出纯合去抗性敲进阳性细胞克隆。培养所得1-A07细胞系,通过流式细胞分析法检测OCT4阳性细胞比例,采用细胞爬片免疫荧光染色法观察干细胞标志物SOX2、NANOG和SSEA4表达情况。采用核型分析方法检测细胞核型。应用3D培养技术获得视网膜类器官,于分化后不同时间点行冰冻切片,免疫荧光染色法检测不同种类细胞分子标志物的表达分布情况。结果H9细胞系靶位点序列与Genebank和Ensembl所提供序列一致。根据H9细胞系靶位点序列共设计16条sgRNA,最终选择sgRNA8和sgRNA12作为sgRNA。电转后通过PCR筛选得到4个去抗性敲进阳性克隆,其中1-A07细胞系经流式细胞仪分析OCT4阳性细胞比例约为98.7%,所得细胞系外源性tdTomato-P2A-iCreERT2片段重组位置正确,正常表达干细胞标志物,核型分析结果正常。应用3D培养技术可定向诱导1-A07细胞系分化为表达tdTomato红色荧光的视网膜类器官。分化后30 d,出现BRN3A阳性神经节细胞、CALBINDIN阳性水平细胞、CHAT阳性无长突细胞,分化后45 d,出现RECOVERIN阳性光感受器细胞,分化后90 d出现PKCα阳性双极细胞。神经节细胞分布于视网膜类器官深层,水平细胞、无长突细胞、双极细胞分布于中深层,光感受器细胞主要分布于顶层。结论成功构建Crx-iCreERT2红色荧光报告人ESCs系,该细胞系可经3D培养诱导分化为表达tdTomato红色荧光的视网膜类器官。得到的视网膜类器官同人类正常视网膜的神经细胞组成一致,且发育的时间和空间顺序接近于正常的人类视网膜。该细胞系是一种强大的工具,可帮助实现人类视网膜发育和疾病产生的相关研究,并促进致盲疾病治疗方法的开发。

关键词： 基因工程T细胞   临床研究   专家共识   指导意见  

摘要： 目前,越来越多的基因工程T细胞临床研究在中国开展,但尚无适用于临床研究中供临床研究医生参考的指导意见。因此,中国医药质量管理协会细胞治疗质量控制与研究专业委员会针对基因工程T细胞临床研究的特点,从开展临床研究医生的角度,对患者的选择、细胞的采集与制备、细胞的储存与运输、围细胞输注期治疗及疗效评价等多方面,组织细胞治疗领域的多名专家,综合国内外研究最新进展并结合临床实践经验,经多次讨论和修改,最终形成基因工程T细胞临床研究专家指导意见(2021)。本指导意见旨在为基因工程T细胞的临床研究医生提供专业指导,保护临床研究中患者的安全并争取最大的获益。

关键词： 猪伪狂犬病毒   基因工程疫苗   基因编辑   同源重组   位点特异   CRISPR  

摘要： 猪伪狂犬病是一种由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染引起的急性高度接触性传染病,可造成不同日龄的猪发病,给养猪业造成了严重的经济损失。预防、控制甚至消灭猪伪狂犬病的主要措施之一是疫苗免疫接种。通过基因重组技术对PRV关键毒力基因进行改造,敲除毒力基因或插入免疫增强基因,是降低PRV毒力或提高病毒免疫保护效果的有效方法之一,也是研制安全高效PRV基因工程疫苗的重要手段。从基因同源重组、Cre/lox P位点特异性重组、细菌人工染色体和CRISPR基因编辑等不同基因重组技术应用方面对猪PRV基因工程疫苗的研制进行综述,为PRV重组疫苗的进一步深入研究提供参考。

关键词： 胚胎干细胞   自我更新   分化   七氟烷   ERK  

摘要： 目的探讨不同浓度七氟烷对人胚胎干细胞凋亡、维持未分化状态以及分化为神经细胞的影响。方法将正常培养的人胚胎干细胞分为3组,对照(七氟烷未处理)组、2.1%七氟烷处理(低剂量)组和4.1%七氟烷处理(高剂量)组,均干预6 h;利用碱性磷酸酶染色、荧光实时定量PCR、Western blot以及免疫荧光等方法,检测细胞凋亡蛋白、干细胞自我更新和分化标志基因以及神经细胞相关基因的表达情况;同时检测SMAD和ERK总蛋白和磷酸化水平的变化情况。结果与对照组相比,低剂量处理组内的人胚胎干细胞的凋亡、未分化状态和神经分化均没有明显变化;高剂量处理组里的人胚胎干细胞发生凋亡,凋亡蛋白CASPASE-3的水平增加(P<0.05)。同时,部分人胚胎干细胞克隆的边缘出现了分化表型,所以自我更新基因OCT4,SOX2,NANOG和PRDM14的表达下调(P<0.01),而分化基因GATA4和GATA6的表达上调(P<0.01)。神经定向分化实验显示,高剂量处理会抑制人胚胎干细胞分化为神经细胞的效率,表现为神经细胞标志基因TUJ1、ASCL1和MAP2的表达水平较低(P<0.05)。高剂量处理会降低人胚胎干细胞中ERK的磷酸化水平,表明高剂量的七氟烷发挥作用可能与ERK信号有关(P<0.05)。结论高浓度的七氟烷对人胚胎干细胞的自我更新和神经分化具有一定的抑制作用,其部分机制是通过抑制ERK信号通路的活性实现的。

关键词： PEDV   亚单位疫苗   免疫保护  

摘要： 本研究用PEDV基因工程亚单位疫苗(A组)和商品苗(B组)分别在母猪产前40d、20d进行两次免疫,然后随机抽取4日龄正常吸食母乳的免疫母猪以及未免疫过疫苗的母猪(C组)所产仔猪,每组5头,用临床流行毒株分别做攻毒试验,观察临床保护效果。结果攻毒后A组仔猪不腹泻、不死亡,B组仔猪100%腹泻、不死亡,C组100%腹泻、全部死亡,亚单位疫苗临床免疫保护效果良好。

关键词： 食品加工   基因工程   安全检测  

摘要： 当前阶段,食品领域科学技术的不断创新与技术成果的快速转化,为食品生产与加工相关产业的规模化、多元化发展提供了支持。在食品领域中合理的运用生物技术,不仅可以提升食品生产质效,降低生产成本与消耗,还可为食品安全保障提供技术支持,为食品市场的健康、有序发展奠定基础。本文从当前食品生产、加工、存储和检测等领域常见的生物技术特征出发,对生物工程的基因、生物酶、蛋白质与细胞相关技术的实践应用方向进行具体的探析。

关键词： 人胚胎干细胞   红细胞   血红蛋白类   珠蛋白类   体外诱导   色谱法   高压液相  

摘要： 目的探讨人胚胎干细胞(hESC)体外诱导制备成熟红细胞的潜能。方法通过三阶段方案诱导hESC向红细胞分化,并通过流式细胞术检测造血干/祖细胞及红细胞表面标志物的变化,通过细胞染色和形态学分析判断红细胞的成熟程度;用实时定量PCR(qRT-PCR)分析不同时间点关键调控基因和珠蛋白链的表达,并以高效液相色谱法(HPLC)检测诱导所得红细胞(cRBC)不同珠蛋白链的表达量;应用血氧分析仪对诱导所得红细胞的血红蛋白(cRBC-Hb)进行功能分析。结果定向诱导可获得CD235/CD71双阳性>80%的红细胞,细胞具有红系细胞形态和携氧能力,但hESC诱导获得的cRBC中β类珠蛋白的表达以γ-珠蛋白为主,cRBC-Hb氧饱和度为50%时的氧分压(P50)也低于成人Hb标准品检测值。实时定量PCR检测发现,伴随诱导过程胚胎干细胞干性基因表达迅速下调,与造血干细胞自我更新、增殖、分化相关基因SCF、HOXB4、Notch-1、Runx1、WNT5、PU.1和SCL,以及红系定向分化调控基因EPOR、EKLF、GATA1和MYB阶段性开启表达,但调控成人型β-珠蛋白表达的EKLF和BCL11A在诱导结束阶段处于较低的表达水平。结论 hESC在体外能向红系诱导分化,关键调控基因程序化地表达,hESC具有体外制备功能红细胞的潜能,但现有的诱导体系获得的cRBC类似于胎儿红细胞。

关键词： 结构熵   科学突破   知识网络   主题识别   科学预测  

摘要： [目的/意义]科学突破主题是对领域发展起关键性作用的主题,对此类主题的发展规律进行探索有助于展开后续识别与预测工作,可更早地进行科学布局,优化科技决策。[方法/过程]文章以基因工程疫苗领域(GEV)为例开展实证研究。从科学突破主题会对知识网络状态带来影响这一基本点切入,以主题词共现网络表征知识网络,首先利用结构熵对知识网络的状态进行测度;之后挖掘对知识网络状态影响较大的主题,作为科学突破主题的候选项;最后借助专家和既有科学成果评估方法的识别效果。[结果/结论]以结构熵测度知识网络的整体性变化,适用于科学突破主题的识别,但其效果的稳定性以及是否具备领域迁移性有待进一步验证。

关键词： conflicts of interest   coronavirus   prioritization   research ethics   triage  

摘要： Much of the ethical discourse concerning the coronavirus pandemic has focused on the allocation of scarce resources, be it potentially beneficial new treatments, ventilators, intensive care beds, or oxygen. Somewhat ironically, the more important ethical issues may lie elsewhere, just as the more important medical issues do not concern intensive care or treatment for COVID-19 patients, but rather the diversion towards these modes of care at the expense of non-Covid patients and treatment. In this article I explore how ethicists can and should prioritize which ethical issues to deal with, and develop a method of triage for identification and prioritization of ethical issues both in the next public health emergency and in bioethics more widely.