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关键词： 幽门螺旋杆菌   脲酶   纳米抗体   基因工程  

摘要： 幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染可导致严重的健康问题。截止2022年,幽门螺杆菌已经在全世界44亿人的胃部定植。目前针对Hp的治疗主要以抗生素为主,但随着抗生素的滥用,导致Hp耐药性增加,治疗失败可能会逐渐导致原发感染发展为更严重的并发症。脲酶是Hp在胃中定植和致病的关键因素,抑制脲酶的活性对降低Hp感染风险是至关重要的。本研究构建了特异性针对Hp脲酶亚单位(UreB)的重组纳米抗体Ab的基因工程表达系统,并对其在食品级益生菌中的表达进行了探索,主要研究内容如下:(1)Hp脲酶的制备及活性测定:对Hp扩增培养后,提取菌体内得脲酶,通过透析除盐和浓缩后,经Quick Start Bradford方法测定,脲酶含量为0.73 mg/m L。依次利用酚红指示剂法和靛酚法对提取的脲酶分别进行定性与定量的活性测定,结果显示所制备的脲酶具有很高的活性,其酶活力为27.77 U/mg。(2)抗Hp UreB纳米抗体(UreB-Ab)的结构分析:I-TASSER软件分析显示UreB-Ab与PDB数据库中的6EHW结构模型的匹配评分最高,从而得到评分最高的结构模型,再利用Cluss Pro2软件进行UreB-Ab对接预测,应用Pmyol软件进行分子间作用力分析。结果显示为UreB与抗体Ab分子间有较强的相互作用力(氢键)。(3)UreB-Ab在大肠杆菌中的异源表达及活性检测:分别构建了p ET-28a(+)-Ab、p E-SUMO-Ab、p Mal-c2x-Ab等重组载体,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达后分别获得Ab、SUMO-Ab、MBP-Ab等抗体蛋白。单向免疫扩散实验结果显示脲酶与Ab在孔周围可形成白色沉淀环,活性测定结果显示Ab、SUMO-Ab、MBPAb对脲酶的抑制率依次为48.0%、74.0%、12.5%,表明重组抗体具有很好的对Hp UreB抗原的亲和力及抑制活性。(4)UreB-Ab在益生菌中的异源表达及活性检测:分别构建了PTM151-Ab、PNZ8148-Ab、PNZ8148-Usp45-Ab等重组载体,依次在益生菌株大肠杆菌Nissle1917(Ec N)、乳酸乳球菌NZ9000中获得了表达。单向免疫扩散实验证实所获抗体均能与UreB抗原有效结合,活性测定结果显示Ec N表达的Ab对脲酶抑制率为67.4%,而乳酸乳球菌表达的Ab对脲酶抑制率为85.7%,均可作为幽门螺杆菌抗体药物潜在的口服益生菌递送系统。研究结论:本研究应用基因工程方法,得到了特异性针对Hp脲酶亚单位B(UreB)的重组纳米抗体(UreB-Ab)益生菌表达系统,将有望以活菌形式递送进入体内,实现对Hp的直接精准防控。此外,特异性识别Hp抗原的抗体不仅能应对感染,还能克服细菌耐药性的发展。因此,本研究为Hp的免疫药物疗法开发奠定了良好的基础,具有良好的创新性与应用潜力。

关键词： 无创DNA产前筛查   游离DNA   胎源占比   质量控制   质量评价  

摘要： 目的: 无创DNA产前筛查（noninvasive prenatal screening,NIPS）在全世界范围广泛使用,其室内质量控制和室间质量评价都非常重要。本研究旨在通过回顾性分析探讨影响胎源占比的因素来指导NIPS室内质量控制;制作人工模拟样本,通过其重复性和稳定性研究,并在不同的NIPS检测平台应用,探讨其适用性及其作为不同NIPS检测平台室间质评样本的可行性。 材料和方法: 通过对2015年5月至2020年6月在四川大学华西第二医院进行NIPS并成功获得胎源占比和测序结果的共155734例怀有单胎的孕妇血浆样本的基本信息和测序结果进行分析,对孕妇的年龄、孕周、身体质量指数（Body mass index,BMI）、孕产史、受孕方式、肿瘤、乙型肝炎病毒病史、胎儿颈后透明带厚度、血清学筛查结果和产前诊断结果等信息进行分层,比较不同组间胎源占比的差异,然后通过单因素和多因素回归分析来对分层的结果进行验证和补充,从而发现胎源占比的影响因素。再将胎源占比按照百分比大小分为<4%、4%-10%、10%-20%和≥20%四组,比较不同组间NIPS筛查目标染色体和性染色体非整倍体(21三体综合征（Trisomy 21,T21）、18三体综合征（Trisomy 18,T18）、13三体综合征（Trisomy 13,T13）、45,X、47,XXX、47,XXY和47,XYY)的阳性预测值（Positive predictive value,PPV）的差异。同时,通过向阴性背景血浆中加入片段化的染色体非整倍体检测结果为T21、T18或T13的男胎流产组织DNA来配制人工模拟样本,在不同的温度和时间保存之后进行检测来探讨其稳定性,再在Next Seq CN500、Next Seq 550AR、Bioelectron Seq 4000、BGISeq-500和DA8600共5种不同的NIPS平台检测来探讨其适用性。 结果: 分析155734例样本的测序结果,胎源占比中位数为11.55%（8.85%,14.65%）。随着孕周增大,胎源占比逐渐增加,并且孕期各阶段胎源占比增加的速度不同,从21-24周（胎源占比中位数为12.26%）开始加快增加速度。胎源占比有随着母体BMI升高而降低的趋势,从<18.5 kg/m2到30-34.9 kg/m2逐渐下降,到35-39.9 kg/m2趋于平稳而到了≥40 kg/m2开始有少量上升。胎源占比也有和母体年龄负相关的趋势。而胎源占比与其它因素间的关系均不如这3个因素明显。NIPS提示为T21（P=0.0051）和47,XXY（P<0.0001）的PPV在四个胎源占比分组间存在差异,NIPS提示为T21的样本中胎源占比<4%组与另外三组的PPV均存在差异（P分别为0.0484;0.0236;0.0236）,且NIPS提示目标染色体和性染色体非整倍体的病例中,胎源占比<4%组NIPS筛查非整倍体的总PPV为15.38%,而≥4%组的总PPV为46.74%。 人工配制的T21模拟样本的胎源占比为11.907%±0.571%,T18模拟样本的胎源占比为19.102%±0.744%,T13模拟样本的胎源占比为14.380%±0.946%,测序结果分别提示为胎儿T21、T18和T13高风险。T21、T13模拟样本在-80℃和-20℃保存180天后胎源占比和Z值均无差异,T21模拟样本在4℃保存30天后胎源占比和21号染色体的Z值均无差异,而T13模拟样本在4℃保存20天后胎源占比和13号染色体的Z值开始出现差异。24℃保存时,T21和T13模拟样本均在保存5天后Z值开始有差异,而胎源占比均在保存10天后开始有差异。37℃保存时,T21模拟样本在保存5天后开始有差异,而T13模拟样本保存2天即出现差异。三种模拟样本在5种NIPS检测平台结果符合率均为100%。 结论: 胎源占比受到多种因素的影响,受孕周、孕妇BMI和年龄的影响最明显,胎源占比随着孕周的增加呈增加,随着BMI和母体年龄的升高而有降低的趋势。NIPS胎源占比≥4%时,筛查目标染色体和性染色体非整倍体时的PPV明显高于胎源占比<4%的样本,但是一旦≥4%,胎源占比和PPV之间不存在明显正向或负向的关系。因此,在进行NIPS室内质量控制时需要将胎源占比重点考虑。通过本研究方法配制的人工模拟样本的测序结果理想,重复性和稳定性好,可以在-80℃或-20℃保存半年、4℃保存20天或24℃保存5天,且适用于不同的NIPS检测平台,将其作为室间质评样本用于不同检测平台具有可行性。

关键词： 尿酸氧化酶   毕赤酵母   信号肽   分泌途径  

摘要： 本文选用毕赤酵母X-33作为宿主,分别对黄曲霉来源、微细菌ZZJ4-1来源、假丝酵母来源、枯草芽孢杆菌来源的尿酸氧化酶基因进行了异源表达,通过对胞内胞外酶活的测定,发现黄曲霉来源的尿酸氧化酶基因在毕赤酵母X-33中的表达量以及分泌量最高,胞外酶活为0.122 U/m L,胞内酶活为1.6 U/m L,因此选用了黄曲霉来源的尿酸氧化酶基因作为目的基因。为了使更多的酶分泌到胞外,对酿酒酵母α-MF信号肽进行了优化,以及对内源信号肽和外源信号肽进行了大量的筛选,包括10种内源信号肽和8种外源信号肽。在初始α-MF信号肽的作用下,摇瓶中的胞外酶活为0.122 U/m L,5 L生物反应器中的胞外酶活为0.201 U/m L。在经过大量筛选之后得到了2种对于尿酸氧化酶分泌性较强的信号肽,分别是信号肽Fre 2和信号肽Dse 4,摇瓶中胞外酶活分别为0.474 U/m L和0.426 U/m L,相对α-MF信号肽分别提高了3.88倍和3.5倍。在5 L生物反应器中的胞外酶活分别为10.8 U/m L和8.4 U/m L,分别是α-MF信号肽分泌效果的51.4倍和41.8倍。在以Fre 2作为分泌信号肽的基础之上,对尿酸氧化酶分泌途径中的相关模块进行了优化,包括转录因子模块、内质网分子伴侣模块、易位蛋白模块、囊泡COPⅡ转运模块、泛素化模块、磷酸戊糖途径模块、抗氧化模块七个模块进行了探究,发现对于尿酸氧化酶的分泌有较大促进作用的是囊泡COPⅡ模块的Sar 1蛋白,对Sar 1过表达之后,胞外酶活为0.662U/m L,相对提高了39.7%,过表达Uso1后,胞外酶活为0.597 U/m L,相对提高了25.9%,易位蛋白相关的YDJ 1、Sec 61过表达之后胞外酶活分别为0.637 U/m L,0.6 U/m L,分别提高了34.4%、26.6%。在5 L生物反应器中菌株XFU-Sar 1、XFU-Uso 1、XFU-Sec 61、XFU-YDJ 1的胞外最高酶活分别达到11.4 U/m L、10.96 U/m L、10.86 U/m L、11.2 U/m L。推断过表达相关基因后的菌株在5 L生物反应器中的胞外酶活没有明显提高的原因是发酵后期前体供应不足或者分泌受限。

关键词： 人胚胎干细胞   全能性   细胞分化   表观遗传调控   MRG15  

摘要： 胚胎干细胞的全能性维持与分化潜能的调控机制,尤其是有哪些关键转录因子及其作用机制并不完全清楚。针对此问题,我们结合体外人胚胎干细胞（hESCs）定向神经外胚层细胞（h NECs）分化平台和全基因组CRISPR/Cas9敲除库,筛选在该分化过程中的关键调控因子。结果发现基因MRG15(mortality factor on chromosome 4（MORF4）-related gene on chromosome 15)敲除后显著促进hESCs向h NECs分化。MRG15是多种组蛋白修饰复合体的关键组成成分,通过调控组蛋白修饰的增加或去除参与调控相关的生物学过程。另一方面,MRG15和不同的辅助因子（Co-factor）互作参与细胞的DNA损伤应答和同源重组等生物学过程的调控。MRG15对维持人多能性神经前体细胞的增殖至关重要。但在hESCs向h NECs分化过程中,MRG15是否通过影响组蛋白修饰对分化进行调控,及对hESCs的全能性维持是否有作用并不清楚。本论文将深入研究上述问题。 我们研究结果发现MRG15敲降后,hESCs的细胞形态由饱满的全能性球形状态变为褶皱较多的偏向于分化的状态。多能性基因在MRG15敲降后表达水平显著下调,而三胚层标志基因均显著上调。MRG15敲降后显著上调的基因均富集在与三胚层分化相关功能通路上。这不同于在自发分化的培养基中hESCs定向分化为神经干细胞,而中内胚层相关基因不表达或低表达。这表明MRG15敲降后hESCs丢失多能性开始无偏好地向三胚层分化。转录组主成分分析进一步证实MRG15敲降前后,hESCs呈现出两条完全不同的分化路线。 进一步研究发现,MRG15敲降后,hESCs中染色质开放区域富集的全能性转录因子基序（motif）显著下降,分化相关的转录因子基序富集程度显著上升。有意思的是,MRG15敲降后,hESCs中关闭的增强子富含全能性转录因子的靶点,如OCT4、SOX2、NANOG等;而新打开的增强子则富含分化调控转录因子的靶点,如ZIC3、TFAP2A等。这些结果表明MRG15敲降后,降低全能性转录因子的结合,促进分化转录因子的结合,从而导致hESCs丢失多能性向三胚层分化。 为了探究MRG15是通过什么机制调控了这一分化表型,我们进行了MRG15染色质免疫共沉淀的高通量测序实验（Ch IP-seq）以鉴定hESCs中MRG15的结合靶点。结果发现MRG15特异性地结合分化相关的基因上抑制其表达。MRG15敲降后分化相关的靶基因被异常激活转录,导致hESCs向三胚层分化。其中,MRG15敲降后,下游靶基因TFAP2A表达显著上调,且MRG15在TFAP2A基因上有结合。通过构建MRG15KD/TFAP2AKO hESC细胞系进行挽救实验,多能性基因表达显著上调,而中内外胚层基因表达显著下调,维持干细胞全能性。该结果揭示了MRG15-TFAP2A调控轴在hESCs全能性维持与分化命运决定中的关键调控作用。 接着,我们探究MRG15敲降后hESCs中的表观状态变化及其对全能性维持与分化命运决定的潜在调控机制。结果发现,MRG15敲降后,全局上DNA甲基化水平没有发生显著变化,与基因表达变化也没有相关性;全基因组范围内染色质开放度、H3K9ac与H3K4me3信号下降,但RNA Pol II信号略有上升。此外MRG15敲降后,对应靶基因表达下降、不变、上升三组MRG15靶点的染色质开放度、不同组蛋白修饰均呈现相同的变化趋势。这些结果表明MRG15对靶基因的表达调控与靶点表观修饰变化没有直接关系。有趣的是,MRG15敲降后对应靶基因表达下降与上升两组MRG15靶点的H3K9ac与H3K4me3修饰在hESCs中没有显著差别,但其组蛋白修饰信号显著低于不变组;此外,表达发生变化的靶基因（上升和下降组）结合位点的H3K27me3信号显著高于不变组。这些发现暗示,hESCs中MRG15靶点的组蛋白修饰状态可能决定MRG15结合从而确保靶基因正确表达,在全能性维持与细胞命运决定中发挥调控作用。 综上所述,我们筛查出对hESCs全能性维持与细胞命运决定有重要调控作用的转录因子MRG15,阐述MRG15敲降后表观状态的变化,揭示MRG15-TFAP2A调控轴在hESCs全能性丢失无偏好地向三胚层分化过程中的作用机制。研究结果进一步完善了hESCs全能性维持与细胞命运决定的调控机制。

关键词： 可变剪接   造血干细胞   转录本多样性   胚胎干细胞  

摘要： 单细胞转录谱极大的促进了我们对细胞身份以及细胞状态转换的理解。过去十年,单细胞RNA测序技术被广泛的应用于鉴定细胞亚群或描绘细胞发育轨迹等研究之中。然而,大多数的单细胞转录组学研究主要停留在基因水平,只有极少数研究是针对转录本水平的。由于真核生物基因经过可变剪接会产生功能各异的转录本异构体,以基因为中心的研究可能会掩盖这些转录本异构体的功能。因此,以转录本异构体为中心的研究或许能更准确的表征细胞身份和描述细胞发育状态。在此,我们对小鼠造血干细胞发育过程中七个连续的细胞群体进行了覆盖全转录本长度的单细胞RNA测序,并构建了整个造血干细胞发育过程中的动态剪接图谱。此外,我们还识别了数百个可能影响造血干细胞造血形成的阶段特异转录本异构体,并采用单细胞纳米孔全长转录本测序验证了它们的表达。随后,体外敲低实验表明敲低部分造血特异转录本异构体确实会影响造血干细胞的形成能力。接下来,模体富集分析结合敲除实验发现RNA结合蛋白SRSF2可以通过调控Runx1和Myb等关键转录因子的可变剪接来影响内皮细胞向造血干细胞特化。此外,为了进一步探索RNA结合蛋白调控干细胞分化的作用,我们将生物信息学分析与功能筛选相结合,识别了七个可能潜在调控胚胎干细胞退出多能性的RNA结合蛋白。接下来,表达和可变剪接分析表明hnRNPLL可以促进胚胎干细胞多能性的退出。最后,进一步分析揭示hnRNPLL可通过调控Bptf和Tbx3这两个对维持胚胎干细胞多能性很重要的转录因子的可变剪接来调控胚胎干细胞退出多能性。同时,我们还从亚细胞水平探索了可变剪接在不同亚细胞位置中的动态分布规律。总之,我们使用高通量转录组测序数据构建了干细胞发育的动态剪接图谱,并识别了在干细胞发育过程中的阶段特征转录本异构体和可变剪接事件。结合体内、体外实验,我们成功识别并验证了特异性调节造血干细胞和胚胎干细胞发育的剪接因子。本研究从转录组水平重新定义了我们对干细胞,特别是造血干细胞发育的认识,并为干细胞的体外诱导以及干细胞治疗在再生医学中的应用提供了新的见解。

关键词： 小鼠胚胎干细胞   发育潜能   BMP4   染色体整倍型   无血清培养  

摘要： 胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)是从囊胚内细胞团分离出来的一类在体外培养中具备自我更新和三胚层分化能力的多潜能干细胞。体外培养条件对于胚胎干细胞特性的维持至关重要,可显著影响细胞的基因组稳定性,转录组学,表观组学,增殖能力以及体内外分化能力。传统的胚胎干细胞培养体系以血清为基础,但该体系存在一些不可避免的问题,比如血清批次不稳定,成分不明确,更为严峻的是血清体系中存在多种相互冲突的信号。因此,血清培养条件下的胚胎干细胞呈现出显著的异质性。基于上述问题,成分明确的无血清培养体系被建立并广泛应用于人或小鼠胚胎干细胞的培养。对于小鼠胚胎干细胞而言,目前应用最为广泛的是2008年Austin Smith实验室建立的基于N2、B27和2个小分子抑制剂GSK3i和MEKi的培养体系(本论文定义为N/2i体系)。学界普遍认为该培养条件下胚胎干细胞呈现出更类似于囊胚内细胞团细胞的基态(ground state)特征,因此具备更优的发育潜能。然而,近年来该无血清培养体系被揭露会损害细胞端粒以及造成不可逆的甲基化擦除和基因组不稳定,从而使得在该体系下长期培养的胚胎干细胞丧失体内发育潜能,未能获得正常存活的完全由细胞发育而来的四倍体嵌合小鼠。通过改变无血清2i体系中的MEKi为弱抑制剂SRCi或降低其浓度可有效改善胚胎干细胞DNA低甲基化水平以及体内发育能力,证明无血清体系中添加的MEKi小分子是造成这一缺陷的主要原因。而本研究发现在不改变2i小分子的基础上,将N2和B27更换为血清则同样可以有效改善无血清培养下胚胎干细胞中的这些缺陷,提示了MEKi或许不是无血清体系培养异常的主要诱因,而血清中可能存在某种有助于改善无血清培养缺陷的物质。因此通过系统比较血清和无血清体系下胚胎干细胞的差异,寻找潜在靶点以帮助修复无血清胚胎干细胞培养体系的缺陷,这将有利于进一步优化干细胞的体外培养系统,提高干细胞的质量从而助力于干细胞治疗等临床应用领域。 在本研究中,通过对比血清体系和无血清培养体系,我们发现小鼠胚胎干细胞在无血清体系下表现出增殖速度慢,细胞周期紊乱、染色体非整倍型等自我更新能力的缺陷。更为严峻的是,干细胞的分化潜能特别是体内分化能力受到严重影响,具体表现为无血清体系下的胚胎干细胞在嵌合实验中呈现低皮肤嵌合率和低生殖系嵌合率,且未能通过四倍体互补实验获得完全由胚胎干细胞发育而来的小鼠。我们进一步比较了无血清体系和添加了2i的血清体系下胚胎干细胞转录组,发现无血清体系下的胚胎干细胞呈现出整体转录不活跃,且与多能性维持相关的重要基因和重要信号通路比如BMP,TGFβ,AKT信号通路均表达受限。当利用生长因子激活下调的BMP,TGFβ,AKT信号通路时,发现仅BMP信号通路的激活可以显著维持胚胎干细胞在无血清体系下的自我更新和多能性。其中使用的生长因子骨形态发生蛋白家族BMP2、BMP4、BMP7中以BMP4的改善效果最佳。 为了探究BMP4改善无血清条件下细胞缺陷的内在机制,本研究首先聚焦于核型异常表型和增殖异常表型来进行转录组上的差异分析,结果显示差异基因中Ube2s(ubiquitin-conjugating enzyme E2S)和Chmp4b(charged multivesicular body protein 4B)在无血清体系中显著低表达,而血清体系以及添加BMP4后的无血清体系中上述基因均可以被有效激活。随后,本研究利用基因干扰技术,证明在无血清添加BMP4体系下敲降(或短期诱导敲降)Ube2s或Chmp4b均可引起与无血清培养体系中胚胎干细胞相似的异常表型,且该异常表型不再被BMP信号通路激活所修复。反之,利用基因过表达技术,在无血清体系中过表达Ube2s或Chmp4b可修复胚胎干细胞的自我更新及体内外分化潜能异常。以上结果证明调控染色体分离和细胞周期的Ube2s和Chmp4b为介导BMP4维持胚胎干细胞自我更新的靶基因。那么BMP4如何激活这两个基因?染色质免疫沉淀(Ch IP)测序数据显示BMP-SMAD信号通路的下游靶点Zbtb7a(zinc finger and BTB domain containing 7a)蛋白在Ube2s和Chmp4b启动子区有显著富集,过表达Zbtb7a可上调二者的表达。而且,BMP4还可以通过招募组蛋白H3K4me3修饰,去除H3K9me3和H3K27me3修饰,以激活Ube2s和Chmp4b的表达。此外,与操纵ERK通路(降低MEKi浓度或采用SRCi)的改进方法不同,BMP4不改变无血清体系下胚胎干细胞的低甲基化状态,反而显著激活了无血清体系中的细胞转录组活性,促进了多能性维持相关的重要基因和BMP,TGFβ,AKT信号通路的表达。相比于SRCi,BMP4处理后的胚胎

关键词： 生物源药物制剂   基因工程技术   仿生病毒药物制剂   分子诊断   精准治疗  

摘要： 近年来,为了提高糖类、核酸类、蛋白质类以及化学小分子等功能性药物的治疗疗效,改善其水溶性、稳定性、病灶部位靶向性并延长血液循环半衰期,功能化药物制剂应运而生。而启发于自然界有机生命体尤其是病毒自身功能特性,制备仿生病毒的新兴智能药物制剂系统表现出突出的优势,并已经成功地应用于诸如生物传感、生物医用支架、疫苗制备以及多种疾病诊断和个性化的治疗当中。从药物功效角度来分析,相较于化学合成药物制剂体系或其他生物源仿生药物体系,仿生病毒药物制剂具有多种药物成分功能化整合特性,不仅保留仿生病毒自身结构功能特性,而且可以协同增强药物分子治疗作用。在本论文中,我们通过系统总结当前仿生病毒制剂的种类,功能化修饰方法,以及在生物医药领域中的应用范围、应用优势和目前应用中存在的问题和挑战之后,进一步对不同仿生病毒样制剂的特性、功效、制备工艺及当前应用范围进行分析,并确定进一步发展新型功能性类病毒样仿生药物制剂的重要意义。为进一步拓展仿生病毒药物制剂功能应用,我们有效利用细胞膜囊泡载体系统和类病毒颗粒铁蛋白药物载体体系,通过基因工程方法进行功能化修饰,不仅成功制备具有仿生病毒入胞行为学的生物制剂用于疾病的有效诊断,而且还制备了仿生病毒形貌的蛋白药物制剂并初步探究其在疾病诊疗中的潜在药用价值。具体实验内容如下:(1)利用基因工程技术,将来源于水泡性口炎病毒的包膜蛋白(Vesicular stomatitis virus G-protein:VSVG)成功表达于HEK293T细胞膜表面并制备成稳定表达VSVG蛋白细胞株,通过超声破碎密度梯度离心的方法制备成仿生病毒细胞膜囊泡(约150nm),体内外实验验证VSVG蛋白可以在细胞膜囊泡表面形成类似于冠状病毒的独特三维刺突结构,并验证其在肿瘤微酸性条件下促进与靶细胞膜融合的特性,进一步在此性能基础上发展成仿生病毒细胞膜介导生物正交反应策略,并成功应用于克服肿瘤异质性以实现多种类型肿瘤的高效诊断。(2)除了制备仿生病毒细胞膜囊泡药物制剂外,我们进一步发展了铁蛋白类病毒药物制剂体系,相比于仿生病毒细胞膜囊泡体系,铁蛋白类病毒颗粒成分简单且粒径较小可控(外径为12 nm,内径为8nm),能够满足特定疾病的治疗需求,例如有研究表明关节软骨中致密细胞外基质成分是软骨蛋白多糖,该蛋白多糖能够形成孔径大小60 nm,侧链间距约20 nm的网络结构,而能够制备粒径较小可以顺利渗透该网络结构的药物制剂是提高药物小分子发挥作用的关键。基于此,我们同样利用基因工程方法将与二型胶原蛋白具有特异性结合能力的多肽(WYRGRL)和能够结合细胞整合素αvβ3受体的多肽(RGD4C)修饰于类病毒颗粒铁蛋白外表面,分别制备具有软骨二型胶原蛋白靶向性的功能化铁蛋白C-Fn和能够结合整合素αvβ3受体的铁蛋白R-Fn;进一步通过调节溶液酸碱性制备成兼具二型胶原蛋白和整合素αvβ3结合能力的双功能类病毒铁蛋白颗粒(RC-Fn);将促进干细胞分化为软骨细胞的小分子药物(Kartogenin:KGN)装载之后不仅能够改善KGN药物的溶解性,而且得益于其较小的颗粒尺寸可以增强病变软骨部位的深层穿透能力来促进病变部位BMSCs向软骨细胞分化,协同促进关节软骨损伤修复。综上所述,在本论文中,我们利用基因工程方法成功制备具有仿生病毒入胞行为学的细胞膜囊泡和具有关节软骨深层穿透能力的类病毒铁蛋白两种仿生病毒药物制剂,在两种药物载体兼具病毒形貌结构特性的基础上,根据其不同的粒径大小(约150nm和12nm)和弱酸性环境响应性特征分别验证了其在克服肿瘤异质性实现多种肿瘤诊断以及增加关节软骨渗透并促进关节软骨损伤修复中的功能应用。