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关键词： CRISPR/d Cas9   小鼠胚胎干细胞   基因激活   高通量筛选   协同激活调控子(SAM)  

摘要： 体外特定培养条件下,胚胎干细胞能够自我更新及维持多能性。通过人为干预调控某些关键基因或特定信号通路,胚胎干细胞能够特异地分化为内,中,外三胚层不同类型的细胞。因此,小鼠胚胎干细胞是研究早期胚胎发育及干细胞命运决定机制的良好模型。利用小鼠胚胎干细胞研究细胞命运决定的关键调控因子一直以来是干细胞研究领域的研究热点和难点。建立可用于筛选小鼠胚胎干细胞分化过程命运调控网络和关键因子的小鼠胚胎干细胞系是极其有必要的。基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术,降低了基因编辑的成本,提高了基因编辑的效率。近年,这一技术迅速替代了传统基于锌指核酸酶(ZFN)和转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)编辑技术,推动干细胞生物学的研究进展。随着分子生物学、测序技术的进步(包括:二代测序技术、单细胞转录组测序等高通量测序技术的发展更迭;生物信息学算法分析的不断完善),及延伸出来的基于CRISPR高通量筛选系统的建立,对细胞进行大规模的基因筛选成为可能。借助高通量筛选技术,在单细胞水平上检测基因表达水平差异,再通过生物信息学系统性地解析参与分化过程细胞命运调控的关键基因,并绘制命运转变过程核心调控网络。 本文利用小鼠胚胎干细胞OG-mES(OCT4-GFP mES),其中的GFP报告基因受多能性标志基因Oct4的远端增强子调控,当细胞分化时Oct4远端增强子失活,GFP不表达,绿色荧光消失,作为研究干细胞分化的报告系统。通过分子生物学实验成功构建打靶载体Rosa26-rt TA-m Cherry-Blast和Hipp11-p TRE-SAM-p PGK-Puro,设计sg RNA改造Cas9载体p X330靶向Rosa26和Hipp11。采用电穿孔方式将构建的打靶载体通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术,分别在小鼠胚胎干细胞基因组开放位点Rosa26和Hipp11定点插入p CAG-rt TA-m Cherry-Blast和p TRE-SAM-p PGK-Puro,通过荧光-抗性双筛选,进一步实验检测细胞中插入SAM系统的表达,筛选得到SAM高表达细胞株,并设计多个sg RNA进一步验证激活系统的激活效果,最终筛选得到了内源性稳定可诱导表达的CRISPR-ON激活系统的小鼠胚胎干细胞系OG-rt TASAM。SAM-sg RNA文库质粒扩增实验,对二代测序PE150结果分析验证,扩增文库涵盖全部sg RNA且分布均一,后续进行慢病毒包装文库病毒高离富集实验后,确定文库病毒感染时的病毒感染复数(MOI)。在此基础上使用全基因组的慢病毒sg RNA文库感染细胞,能够实现全基因组范围的基因激活筛选。CRISPR-ON激活系统结合OCT4-GFP报告系统构建的OG-rt TA-SAM,可用于高通量筛选胚胎干细胞多能性维持和分化的关键基因,利用单细胞测序结合生物信息学分析可以绘制与胚胎干细胞多能性维持和细胞命运决定相关基因的分子特征谱及调控网络。该细胞株的建立,对解析多能干细胞的命运调控网络和阐明命运决定的机制有深远意义。

关键词： 肝豆状核变性   ATP7B   胚系变异   mRNA测序   异常剪接  

摘要： 背景:肝豆状核变性(Wilson's disease,WD)是一种罕见的由ATP7B基因缺陷引起的常染色体隐性遗传性疾病,以铜代谢异常引起的肝脏和神经系统损害为特征。两条同源染色体上致病性变异的鉴定已成为WD患者诊断的金标准。目的:1.对临床拟诊WD的患者实施ATP7B基因诊断,在DNA水平确定患者发病的遗传学原因。2.对未能通过外显子测序建立遗传学诊断的WD患者,尝试在RNA水平进行探索,查找mRNA结构异常的线索。方法:1.联合Sanger测序和多重连接探针扩增技术(Multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)对30个中国WD家系的先证者及家庭成员行ATP7B基因胚系变异检测。2.对3例外显子测序仅检测到单个杂合变异的WD患者,联合第二代、第三代测序技术查找外周血中mRNA异常剪接的线索。通过RT-PCR和Sanger测序对可疑的剪接异常进行验证,并分析其产生的原因。结果:1.30名先证者的ATP7B基因直接测序结果显示,其中26人在两条同源染色体上均检测到ATP7B基因变异,其余4人仅检出单杂合变异。从30名先证者中共检测出参照ACMG指南可归类为“致病性”或“可能致病性”的ATP7B基因变异30个,包括19种错义变异、2种剪接位点变异、1种无义变异、1种框内缺失、6种移码变异和1种同义变异。其中4个变异此前尚未被文献报道,为3个错义变异(c.3215G>T,c.3265G>A,c.3542T>A)和1个移码变异(c.2887del C)。对通过Sanger测序仅检测到单杂合变异的先证者(No.27、28、29和30)补充了MLPA检测,但结果依然呈阴性。此外,在对来自其中的5个非独生子女家系的6名先证者兄弟姐妹的对应变异位点的筛查中,确定了2名症状前患者。***7B基因靶向RNA测序分析提示了家系29的先证者存在14号外显子的异常跳跃。RT-PCR实验证实了该现象同时发生于该先证者及其母亲的样本中。通过Sanger测序在患者及其母亲的样本中发现了13号内含子深部的一个杂合缺失变异(c.3060+434del G,g.65645del G),可能是导致异常剪接发生的原因。此外,测序结果提示人体内可能普遍存在一个外显子2-5跳跃的转录异构体,需要在后续实验中进行进一步验证。结论:1.本研究在DNA水平为26名临床诊断成立的WD先证者明确了遗传学诊断,发现了4个既往未被报道的新变异,拓宽了中国人群中ATP7B基因的变异谱。2.通过ATP7B基因mRNA靶向测序和RT-PCR,在RNA水平发现了一个剪接变异,为3个此前仅发现单变异的受检患者中的其中一人明确了基因诊断,并在DNA层面找到了疑似的对应胚系变异。3.经ATP7B基因mRNA靶向测序,发现了ATP7B基因中一个疑似存在的新的转录本,需要后续实验进行进一步研究。图26幅,表15个,参考文献65篇

关键词： 猪圆环病毒2型   猪支原体肺炎   基因工程疫苗   安全性   免疫效力  

摘要： 猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2,PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)和猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus associated diseases,PCVAD)的主要病原体。Cap蛋白是PCV2的主要免疫原性蛋白,也是基因工程类疫苗研发的主要靶点。猪支原体肺炎(Mycoplasmal Pneumonia of Swine,MPS)是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)引起的一种慢性接触性呼吸道传染病,临床中常与其他病原体混合感染,尤以Mhp和PCV2协同感染居多。猪肺炎支原体膜蛋白P46蛋白是Mhp表面的主要免疫优势蛋白,具有高度种属特异性,研究中常作为检测猪肺炎支原体的靶蛋白。目前,防控PCV2和Mhp感染的主要手段是疫苗免疫,现有商品化疫苗质量参差不齐,免疫程序繁琐,不利于做好基础免疫工作。随着基因工程技术发展,基因工程联苗能组合多种疾病的抗原蛋白,既达到联合疫苗的使用效果,又解决了常规联苗抗原组分相容性问题,实现一针多防。因此研发能够同时预防PCV2和Mhp的基因工程二联苗具有重要的应用价值。本研究目的旨在通过大肠杆菌表达系统,获得免疫原性良好的PCV2 Cap蛋白、Mhp P46蛋白,制备基因工程二联疫苗免疫实验动物,评估其对仔猪的免疫效果。一、PCV2 Cap蛋白表达与免疫保护为了提高PCV2 Cap蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量,对PCV2 ORF2基因进行优化,使目的蛋白可溶性表达率达90%以上。通过SDS-PAGE、Western-Blot等方法分析鉴定表达产物,并将重组蛋白制备疫苗免疫健康易感仔猪,免疫组猪血清PCV2抗体效价均不低于1:1600;动物攻毒实验结果表明免疫组5/5保护。二、Mhp P46蛋白表达与免疫保护。通过点突变试剂盒将Mhp P46基因3个TGA密码子突变成TGG,构建重组表达质粒pET-32a-P46,导入大肠杆菌感受态细胞经IPTG诱导,成功表达Mhp P46蛋白。P46蛋白免疫易感仔猪后进行攻毒,免疫组精神、饮食、体温均正常,未出现猪支原体肺炎典型临床症状,剖检未见肺部组织病变;而对照组出现典型的猪支原体肺炎症状和病变。P46蛋白可使免疫猪在Mhp感染时得到有效保护。三、猪圆环病毒病(2型)、猪支原体肺炎基因工程二联灭活疫苗在此基础上优化制苗工艺,确定猪圆环病毒病(2型)、猪支原体肺炎基因工程二联灭活疫苗抗原灭活方法、抗原蛋白浓度,选择15AVG佐剂,将水相与油相按照85:15的比例混合,经4500r/min,25℃乳化40分钟制得水包油型(O/W)疫苗。试制疫苗各项检验均符合《猪圆环病毒病(2型)、猪支原体肺炎基因工程二联灭活疫苗质量标准》,表明所构建菌株稳定性、免疫原性良好,生产工艺科学合理,产品质量稳定,可进行规模化生产。对试制的基因工程二联疫苗进行安全性试验,结果表明疫苗安全性良好,无毒副作用,对试验猪应激小,无其它副反应。疫苗免疫健康易感仔猪进行效力试验:免疫组血清PCV2抗体效价基本不低于1:1600,PCV2攻毒试验免疫组4/5保护,非免疫攻毒组0/5保护;以猪肺炎支原体强毒株攻毒后免疫组肺炎病变平均减少率为81.6%。说明疫苗对试验猪具有良好的免疫保护力。免疫持续期试验结果表明,免后120日、150日试验猪血清PCV2抗体效价仍维持在1:1600以上;免疫后120日、150日攻毒免疫组猪肺炎病变减少率分别为77.9%、72.6%。由此,将猪圆环病毒病(2型)、猪支原体肺炎基因工程二联灭活疫苗的免疫持续期定为4个月。目前市场上尚无猪圆环病毒2型与猪肺炎支原体的基因工程二联苗,本研究通过大肠杆菌表达系统,获得免疫原性良好的猪圆环病毒2型Cap蛋白、猪肺炎支原体P46蛋白,制备同时预防PCV2和Mhp的基因工程二联苗免疫实验动物,安全性、免疫保护力良好,免疫持续期为4个月,将为养猪业疾病防控提供优质疫苗。

关键词： 转基因   孟山都   商业化   粮食安全  

摘要： 自转基因技术应用到农业以来,转基因作物先后在美国、加拿大和阿根廷等国实现了商业化种植,由于其优良的性状表现,越来越多的国家开始接受转基因这种新型的育种方式。中国政府在2021年中央一号文件中也明确指出:要尊重科学、严格监管,有序推进生物育种产业化应用。伴随着国内转基因政策逐渐明朗,本文选取了全球最大的生物育种公司——孟山都作为研究对象,通过分析其商业化运营的业务模式,并对其具体做法进行客观评价,为中国的种子企业建立健全商业化育种体系提供借鉴和参考。孟山都公司转基因作物商业化运营模式主要由内部运营模式和外部市场策略两部分组成。内部运营模式包括一套完整的商业化育种内部体系、高效灵活的行政管理体系、风控严格的财务管理模式、聚焦项目的研发组织框架和创新多样的专利盈利模式,依托这套内部管理模式,孟山都得以转型成为当今世界种业的重塑者和转基因时代的引领者。外部市场策略主要指孟山都在全球种业呈现快速增长的态势下,所采取的一系列市场营销和商业化推广策略,其中包括:第一,孟山都通过政治献金的方式支持国内游说,完成了国内种业市场的布局;第二,孟山都借助目标市场的龙头企业,利用资金和技术上的优势占领传统农业大国的市场;第三,孟山都组织专业技术人员深入农田一线,进行转基因产品的精准推广和技术指导;第四,孟山都采用农化产品“全家桶”的策略,通过种子、农药和农资配套服务捆绑销售的模式,进一步增强转基因产品的用户粘性。在被拜耳公司全资收购后,孟山都不断对原有转基因品种进行安全评估与迭代升级,来提高转基因种子的安全性和适应性;孟山都还积极探索育种技术应用和数字化商业新模式,将数字化与生物育种相结合,提供更高质量的农资服务;最后,孟山都建立起了全球合规管理体系,以应对未来潜在的诉讼风险,降低产品进入到目标市场后所面临的不确定性。通过分析孟山都公司转基因作物的商业化运营模式,本文从企业和政府两个层面为中国种业发展及粮食安全问题提出了针对性建议。从企业层面,中国种企应当在国家政策范围内创新商业化育种模式,顺应时代科技潮流,同时,要加快企业间的兼并联合,实现科研投入的规模效应;从政府层面,中国政府应提前做好转基因育种模式的顶层设计和自主创新两方面工作:一方面,要加强农业转基因生物安全监管,严格把控转基因育种产业链的市场准入;另一方面,要坚持育种模式创新,推动种业高质量发展:政府要加快育种主体培育,建立以企业为主体,高校和科研机构广泛参与的种业创新中心,同时,要发挥市场导向作用,推动育种模式市场化的革新,从根本上解决农业“卡脖子”问题。

关键词： 自身免疫调节因子   NOD   1型糖尿病   胚胎干细胞   胸腺上皮细胞  

摘要： 目的:正常生理状态下,自身免疫调节因子(AIRE)能促进机体免疫耐受的形成和维持。AIRE主要在髓质胸腺上皮细胞(m TECs)中表达,可通过调控组织特异性抗原(TSAs)转录调节免疫耐受。胸腺上皮细胞(TECs)来源于内胚层(DE),DE分化为胸腺上皮祖细胞(TEPs)后,进一步分化为皮质(c)TECs和m TECs,在T细胞正常发育和分化过程中发挥重要作用。本课题通过体外诱导小鼠胚胎干细胞(m ESCs)向TEPs分化,同时探讨敲低m ESCs AIRE基因对体外诱导分化的TEPs转录组的影响;并用NOD/Ltj(NOD)小鼠为自身免疫病模型,探讨敲低小鼠胸腺AIRE基因,对T细胞发育与分化,以及对小鼠1型糖尿病发生发展的影响。研究结果为AIRE调节免疫耐受的机制提供实验依据和理论基础。方法:1.以C57BL/6来源的m ESCs为研究对象,sh RNA慢病毒感染m ESCs,分为未处理组、Control sh RNA组和AIRE sh RNA组,嘌呤霉素筛选单克隆稳定株后,3组细胞定向诱导分化为TEPs,对3组细胞进行转录组测序,分析基因表达差异。2.以NOD小鼠为研究对象,5周龄NOD小鼠于胸腺内注射sh RNA慢病毒,分为未处理组(30只)、Control sh RNA组(30只)和AIRE sh RNA组(30只),每周检测小鼠血糖2次,4W后取小鼠胰腺、胸腺和脾脏组织。(1)检测各组小鼠血糖变化。(2)HE及免疫荧光染色观察胰岛炎性细胞浸润情况,胸腺AIRE表达情况。(3)Real-time PCR检测胸腺内AIRE与T1D相关TSAs,以及m TECs的CD80和MHC-II表达情况。(4)流式细胞术(FCM)检测3组小鼠胸腺内T细胞比例变化。(5)FCM检测3组小鼠脾脏Tregs比例变化。(6)FCM检测3组小鼠脾脏T细胞增殖、活化情况。结果:1.敲低AIRE的m ESCs-TEPs,(1)有2383个基因上调,4487个基因下调。(2)KEGG富集结果显示,AIRE主要富集于ECM-受体间相互作用、PI3K-Akt信号传导途径、局部粘附、Ras信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路等途径。(3)通过TRING蛋白质互作数据库中的互作关系进行差异基因蛋白互作网分析,结果显示,AIRE通过与CD44的相互作用来影响ECM-受体间相互作用。***小鼠胸腺内注射sh RNA慢病毒研究发现:(1)与未处理组、Control sh RNA组相比,敲低胸腺内AIRE基因,可加速NOD小鼠T1D发病进程。(2)HE及免疫荧光染色结果显示,AIRE sh RNA组小鼠胰岛炎性浸润加重,胸腺AIRE表达降低。(3)与未处理组、Control sh RNA组相比,AIRE sh RNA组胸腺内AIRE及INS2、GAD67等T1D等相关TSAs的m RNA表达水平降低,m TECs发育成熟相关分子CD80、MHC-II的m RNA表达水平也降低。(4)AIRE sh RNA组胸腺内CD4单阳性T细胞比例增多,CD4CD8双阳性T细胞比例减少。(5)AIRE sh RNA组小鼠脾脏CD4CD25Foxp3Tregs百分比降低。(6)AIRE sh RNA组小鼠脾细胞抗-CD3及Insulin刺激培养5d后,抗原特异性T细胞增殖增加;CD4CD69与CD8CD69细胞比例升高。结论:1.敲低AIRE的m ESCs来源的TEPs,ECM-受体间相互作用等途径发生改变。2.敲低NOD小鼠胸腺AIRE基因,加速小鼠T1D发生,加重胰岛组织病理学改变。这些改变可能与胸腺内T1D相关INS2、GAD67等TSAs表达降低,单阳性T细胞比例增多(中枢耐受受损),致外周Insulin特异性T细胞增殖活化增加,而Tregs产生减少(外周耐受受损)有关。

关键词： 纳米壳蛋白   Zn2+   厌氧氨氧化   抗性机制   蛋白组学  

摘要： Zn作为一种应用广泛的金属元素,在许多工业活动中被排放到环境中。过量的Zn能对环境造成严重威胁。与传统修复技术相比,生物修复因其高效、低成本和环境友好的优势,尤其是基因工程菌,成为一种更具前景的重金属去除技术。因此,筛选一种能够增强细菌对Zn胁迫反应的靶基因至关重要。但目前对于相关基因以及工程菌抗性系统与重金属离子之间的关系仍不清楚。此外,研究表明纳米封装蛋白通过隔离有毒物质,封装功能酶可以保护细胞,应对环境压力。然而,对来自厌氧氨氧化细菌(*** fulgida)的含血红素的纳米壳蛋白(c Enc)的研究还处于初级阶段,对其结构和功能都未有深入探究,以及c Enc是否也能隔离Zn,帮助细菌应对Zn的细胞毒性并增强对Zn的抵抗力的研究也相对较少。本文则通过利用分子生物学手段将厌氧氨氧化菌体内的纳米壳蛋白在大肠杆菌(DE3)中进行大量表达并将含c Enc的大肠杆菌在不同Zn浓度下培养。然后探究c Enc的性能特点以及其是否可以协助工程菌(p ET28a-c Enc)应对Zn的毒性胁迫。最后利用宏蛋白组学明确Zn环境下工程菌的调控机制,为进一步了解厌氧氨氧化细菌中纳米壳蛋白的功能提供依据,同时为强化微生物修复Zn,应对环境压力提供新的具有潜力的策略。文中得出的主要结论如下:(1)为获得高浓度和高纯度的c Enc蛋白,我们发现在培养温度为30℃,诱导剂浓度0.2 m M,诱导时间16 h时,目的蛋白的表达量最佳;裂解缓冲液p H为7.5,添加0.5%Trion X-100,50 m M Na Cl,以及蛋白酶抑制剂(100X)时,提取的可溶性蛋白含量最大。纯化过程采用10m M咪唑浓度的洗涤缓冲液洗涤镍柱,80m M咪唑浓度的洗脱液洗脱目的蛋白时,杂蛋白与目的蛋白共同洗脱的现象得到明显改善,获得的蛋白纯度更高。另外,当用不同温度和p H处理纯化的c Enc时,SDS-PAGE实验及BCA实验结果均表明c Enc蛋白是一种较为稳定的蛋白。动态激光光散射和透射电镜负染实验结果证实c Enc可以在p ET-28a-c Enc重组大肠杆菌中形成均一的,直径为36 nm左右的球状蛋白。(2)在一定Zn浓度范围内,基因工程菌(含p ET-28a-c Enc)的细胞存活率会明显高于野生菌(不含p ET-28a-c Enc)。如添加0.5 m M和1 m M的Zn刺激时,工程菌的存活率分别达到97.7%和93.6%;而野生菌在相同浓度Zn作用下的存活率为78.8%和68.5%;此外,基因工程菌的生长速度较野生菌的会更快,受Zn引起的细胞凋亡率也更低。即便在2 m M Zn浓度的刺激下,野生菌的细胞膜结构遭到严重破坏,胞内细胞质和核酸等内容物流出,含p ET-28a-c Enc的基因工程菌也能维持较为完整的细胞结构。(3)通过对c Enc功能预测进行相关的实验研究,发现工程菌中有明显的c Enc蛋白表达。另外工程菌培养基中残留Zn浓度较野生菌中的更低,以及添加Zn胁迫的工程菌中c Enc的颜色较无Zn添加时更深,即含有额外的电子致密物质,表明有明显的Zn被c Enc固定。综上所述,c Enc蛋白可以通过固定Zn,降低细胞中的Zn浓度,从而减少Zn对细胞的破坏作用,保证细胞的正常生命活动。(4)蛋白组学的结果表明,在表达大量c Enc蛋白固定Zn以提供缓冲作用的基础上,工程菌拥有复杂的调节机制应对Zn刺激。Ⅰ)上调核糖体相关蛋白,促进蛋白合成和Zn同化以加强对Zn的耐受力;Ⅱ)上调硫代谢通路,增加与Zn结合的相关蛋白的合成以保证细胞内的还原环境;Ⅲ)鞭毛组装相关蛋白合成的明显增加以趋使细菌运动应对外部有毒环境的变化;Ⅳ)上调DNA修复相关蛋白合成,抑制细菌的非正常凋亡;膜相关蛋白的合成增加以修复受Zn破坏的细胞膜,保证细胞的正常形态;Ⅴ)Zn外排相关的外排泵蛋白合成增加,降低胞内Zn浓度;Ⅵ)下调细胞代谢进程相关通路,主动性降低细胞能量消耗,应激性处理Zn诱导的细胞毒性。

关键词： 胚胎干细胞   胚胎发育   人造子宫   滋养层干细胞   人胚胎干细胞诱导分化   小鼠胚胎   潘多拉魔盒  

摘要： 早在20世纪30年代，研究人员就设想在子宫外以人工的方式培养胚胎，这样既能了解生命发育的整个过程，也能提取胚胎干细胞，以治疗疾病。经过多年的探索，现在研究人员可以通过技术手段在子宫外的人工器皿中观察胚胎的发育，而且方法不止一种，这为生命科学研究和防治疾病开启了广阔天地，但也有可能会打开潘多拉的魔盒。

关键词： 水体净化   基因工程菌   自絮凝过程   硝酸盐   吸附机理  

摘要： 天然水体中过量的硝酸盐会对水体和动植物产生危害，进一步影响人类身体健康。这些硝氮可通过厌氧的反硝化菌还原成氮气而去除。然而，反硝化速率在很大程度上受到水体上部含氧水层中硝酸盐与下层缺氧沉积物中电子供体的空间分离的限制。天然水体中的絮凝过程较慢，所形成的絮体不吸附NO3-，就导致上层硝氮很难迁移到水底。自然界中有一些微生物（如酿酒酵母）可以通过细胞表面的特定蛋白进行快速絮凝，而某些植物种子（如辣木种子）的蛋白则可吸附阴离子。为此，构建可同时分泌这两种功能蛋白的基因工程菌则可能是实现水中吸附NO3-和自絮凝迁移的有效途径。本研究构建可共表达辣木种子中MO2.1蛋白和酿酒酵母FLO5蛋白的基因工程菌，研究了该工程菌在实际水体中自絮凝和硝氮吸附的性能，并且阐明了工程菌自絮凝和硝氮吸附的机理。这一研究对新型功能菌的开发以及水净化技术的研究具有重要意义。本文主要研究内容如下：　　(1)成功构建具有吸附硝酸根和自絮凝功能的基因工程菌。将辣木种子中的mo2.1基因和酿酒酵母中的flo5基因构建出重组质粒，通过琼脂糖凝胶电泳检测到5603bp、3228bp的DNA条带（pETduet-1-mo2.1和flo5基因），结果表明重组质粒构建成功。将重组质粒转入大肠杆菌BL21中构建基因工程菌BL21/pET-MO/FLO，通过蛋白SDS-PAGE检测到5.7kDa的MO2.1目的蛋白条带111.9kDa的FLO5目的蛋白条带，表明共表达蛋白已在基因工程菌中的成功表达。　　(2)所构建的基因工程菌实现了NO3-从水体上层到下层的迁移。首先，对基因工程菌吸附硝氮和自絮凝性能进行研究。通过单因素优化实验、不同菌株性能对比实验完成了工程菌性能优化，结果表明在浓度为0.5mM时IPTG诱导工程菌的条件下，pH为7的硝酸盐水溶液中，30min内可以实现73.9%的自絮凝效率和71.8%的NO3-去除率。其次，通过竞争离子吸附实验测试了工程菌抗干扰能力，结果表明在竞争离子的存在下工程菌更倾向于吸附硝酸盐。最后，基因工程菌可有效净化实际水体。对工程菌生长曲线的测定，表明工程菌在LB培养基和实际水体中均可正常生长。通过对内蒙古岱海湖水和肖家河污水处理厂的二级出水中的硝氮测试，结果表明基因工程菌可以将45.5%的硝酸盐迁移到底层，使得实际水体硝酸盐含量从2.4mg-N/L降至1.2mg-N/L达到一级出水标准。　　(3)阐明了工程菌FLO5蛋白与多糖自絮凝机理和MO2.1蛋白精氨酸硝氮优先吸附机理。首先，探明工程菌分泌蛋白的位置以及蛋白对絮凝的作用。通过测定了菌株的电势和不同EPS中蛋白的含量，得出工程菌分泌的蛋白主要在细胞外膜。对絮体进行表征和激光共聚焦显微镜的观察，表明引起自絮凝的是蛋白质。其次，探明了胞外多糖对自絮凝的作用。测定基因工程菌与对照菌株的不同EPS中多糖的含量，发现胞外多糖对自絮凝起介导作用。最后，对MO2.1蛋白吸附NO3-机理进行了分析。通过生物信息学分析和分子动力学模拟实验研究了蛋白的结构和电性，结果表明MO2.1中的某些阳离子精氨酸位点可以与NO3-形成强静电吸附。

关键词： 仿生纳米药物   细胞膜囊泡   药物递送   肿瘤治疗  

摘要： 缺乏有效的药物递送体系是临床上肿瘤化疗难以取得令人满意效果的重要原因之一。常规的化疗方案需要系统性给药,在杀伤肿瘤细胞的同时也会导致全身的毒性,对正常的组织或器官造成损伤。且由于肿瘤组织特殊的结构,单独的化疗药物很难进入到肿瘤组织深部,也很难完全抑制肿瘤的快速生长。因此开发出新型高效的药物递送体系,将药物靶向递送到肿瘤组织,减少对正常组织的损伤,且可以实现多种模式的联合治疗是解决上述问题的关键。 近年来,随着纳米技术和生物医学工程技术的发展,仿生纳米药物递送体系,基于其良好的生物相容性和特殊的生物靶向性,已经成为肿瘤治疗领域研究的重点方向之一。特别是基于生物膜系统的仿生纳米药物递送体系,其可以通过将天然的生物膜与合成的药物颗粒或响应性的生物材料的整合,极大程度上提高了纳米药物的生物相容性。同时由于生物膜上存在特殊蛋白分子,避免了被巨噬细胞或网状内皮系统的快速清除,因此可以实现机体内的长效循环和疾病区域靶向递送。此外,由于生物膜系统和纳米颗粒形成的特殊核-壳结构,其可以实现多模态治疗,例如光动力治疗,光热治疗,声动力治疗和免疫治疗等。基于上述思考,本论文中我们利用基因工程技术在细胞膜上定向地表达了可以靶向肿瘤细胞的TRAIL(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)蛋白和肿瘤浸润性DC(树突状细胞)的单克隆抗体,然后提取其细胞膜包覆在合成的纳米颗粒表面,实现了亲水性和疏水性药物共递送和化疗增敏,以及整合了声动力治疗、化学动力学治疗和免疫治疗的多模态联合治疗,极大地提高了肿瘤治疗效果,也推动了纳米药物临床转化的研究。本论文的主要内容和创新性概括如下: 第一部分:靶向设计及载药。我们构建了 TRAIL过表达的HUVEC细胞(人脐静脉血内皮细胞),并提取其细胞膜囊泡(TH-V),将其包覆在共载有HCQ(羟氯喹)/OXA(奥沙利铂)的PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物)纳米颗粒上,形成仿生的TH-NP双药纳米共递送体系。该体系中外壳层表达TRAIL的细胞膜囊泡不仅可以特异性靶向肿瘤组织,而且可以减少对正常组织和器官的损伤。此外,HUVEC囊泡自身存在的膜蛋白分子包括CD47等可以避免TH-NP被巨噬细胞吞噬,延长体内的药物循环时间,可以维持肿瘤部位有效的药物浓度。由于TRAIL和肿瘤细胞表面的DR4/5(死亡受体)结合,导致纳米药物被肿瘤细胞特异性摄取,并在酸性的溶酶体里面释放出HCQ和OXA。这些释放出来的HCQ具有碱化和损伤溶酶体的功能,限制了化疗药物OXA所引起的保护性自噬流,进而促进了肿瘤细胞对OXA的敏感性。另外一方面,当保护性自噬被抑制后,其介导的肿瘤细胞表面局部粘附蛋白包括钙黏连蛋白E(E-cadherin)和桩蛋白(Paxillin)的降解就会被抑制住,从而减弱了肿瘤向远处转移的能力,实现化疗增敏和转移抑制的双重目标。总之,我们设计的TH-NPs共递送系统在体外的多种肝癌细胞中都显示出高效的增殖抑制和自噬流抑制效果,抑制了肿瘤细胞的侵袭性和转移性;在体内实验中,TH-NP在肝癌皮下瘤,原位肝癌模型甚至是肝癌转移瘤模型中都显示出良好的抗肿瘤效应和肺部转移的抑制效果。 第二部分:深部穿透设计的多模态治疗协同效应机制。我们构建了基于anti-DEC205单克隆抗体的囊泡靶向递送体系,成功的实现了免疫治疗,声动力治疗(SDT)和化学动力学治疗(CDT)的三模态联合治疗。首先我们合成了具有声响应的金属有机框架化合物(metal organic framework,MOF),利用其多孔结构装载免疫佐剂R848,并在MOF外壳结构上修饰了具有CDT效应的铂金纳米颗粒(AuPt),形成了 R-MOF@AuPt纳米颗粒。我们利用基因工程技术构建了过表达anti-DEC205的Hep1-6细胞株并提取其细胞膜囊泡,并将囊泡包覆在R-MOF@AuPt纳米颗粒表面,形成AMR-MOF@AuPt仿生纳米颗粒。这种仿生纳米颗粒具有以下特点:(1)靶向肿瘤并激活肿瘤组织浸润性的DC细胞,促进肿瘤抗原的MHC-I途径的交叉递呈;(2)磁共振/荧光双模态成像功能,实时监测药物在体内的生物分布情况;(3)Hep1-6细胞膜囊泡同源靶向Hep1-6肿瘤,超声控制下,实现药物在肿瘤区域的精准释放,SDT产生的ROS和AuPt催化肿瘤区域过氧化氢产生的ROS协同杀伤肿瘤细胞,实现SDT和CDT的联合。

关键词： 胚胎干细胞   胰腺β细胞分化   CTLA4-Ig   PDL1  

摘要： 背景 糖尿病是一组因胰岛素分泌异常或胰岛素耐受而发病的慢性代谢综合征,2021年全球糖尿病患者人数达到5.37亿,目前仍然没有根治糖尿病的方法。基于人多能干细胞的胰腺β细胞定向分化技术的不断成熟为根治糖尿病提供了可能性。人多能干细胞衍生的胰腺β细胞(Human pluripotent stem cell-derived pancreatic beta cells,SC-β cell)疗法可解决传统胰岛移植疗法中胰岛来源不足的问题,但免疫排斥仍然是SC-β cell疗法中一个重要且仍未被解决的问题。免疫耐受型人胚胎干细胞(H1CPTK)的应用有望解决SC-β cell的免疫排斥问题。 目的 1.评估通过一种三阶段分化法得到的CP-β cell(Pancreatic β cell derived from H1CPTK)与 WT-β cell(Pancreatic β cell derived from wild type H1)的分化效率及其胰岛素分泌功能; 2.评估CP-β cell与WT-β cell在免疫缺陷鼠体内的胰岛素分泌功能及其对STZ造模小鼠血糖的影响; 3.评估CP-β cell与WT-β cell在免疫系统人源化小鼠(Immune system humanized mice,hu-mice)的免疫排斥情况; 方法 1.通过流式细胞术、实时荧光定量PCR、免疫荧光检测SC-β cell的分化效率; 2.通过胰岛素分泌实验评估CP-β cell与WT-β cell的胰岛素分泌功能; 3.通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测移植了 CP-β cell与WT-β cell的NCG小鼠与hu-mice的外周血人C肽浓度;并通过腹腔注射葡萄糖耐量实验(IPGTT)评估CP-β cell与WT-β cell的胰岛素分泌功能成熟度; 4.评估CP-β cell与WT-β cell对STZ糖尿病小鼠血糖的影响; 5.通过流式细胞分析检测hu-mice外周血中的人T细胞与B细胞含量; 6.评估CP-β cell与WT-β cell在hu-mice体内2周后的存活与T细胞浸润情况; 结果 ***-βcell与WT-β cell的分化效率相近,约为20%; ***-β cell与WT-β cell在22.5 mM葡萄糖刺激下的胰岛素分泌量低于在2.5 mM葡萄糖刺激下的胰岛素分泌量; 3.移植后约3个月的IPGTT实验结果显示,CP-β cell与WT-β cell能根据血糖浓度的升高而增加胰岛素分泌; 4.移植有CP-β cell与WT-β cell的小鼠在注射STZ后,其血糖上升的幅度较低; 5.流式结果显示,hu-mice外周血存在大量人CD45阳性细胞,这一部分细胞主要以CD3阳性的T细胞和CD19阳性的B细胞为主; 6.移植到hu-mice体内2周后,WT-β cell移植物未观察到insulin阳性的胰腺β细胞而伴有大量CD3阳性的T细胞。CP-β cell移植物则存在大量insulin阳性的胰腺β细胞而仅有少量CD3阳性的T细胞;8周后仍能在hu-mice外周血中检测到人C肽。 结论 ***4-Ig、PDL1、TK的过表达不影响胚胎干细胞分化为胰腺β细胞的效率; 2.通过该三阶段分化得到的CP-β cell与WT-β cell最初为胰岛素分泌功能不成的胰腺β细胞; ***-βcell与WT-β cell在NCG小鼠体内成熟后,表现出葡萄糖刺激的胰岛素分泌模式; 4.初步验证CP-β cell是种免疫耐受型的胰腺β细胞。