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关键词： Suds3   胚胎干细胞   Hoxc8   诱导多能干细胞  

摘要： 干细胞多能性维持与重建是当今细胞命运调控研究领域的前沿与热点。研究揭示干细胞多能性分子机制对于理解细胞命运转变与指导再生治疗应用具有重要的意义。本论文围绕小鼠干细胞多能性维持与重建展开两大部分研究。在第一部分,胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)具有自我更新能力及分化为各种细胞的多能性。自我更新实际是ESCs在分裂过程维持干细胞未分化的状态,这需要细胞周期控制并维持干细胞的多能性。缺陷沉默抑制子3同源物(Suppressor of defective silencing 3 homolog,Suds3)是Sin3/HDAC复合物核心成分之一,对维持Sin3/HDAC复合物的完整性及催化活性具有重要作用。但是Suds3在小鼠胚胎干细胞(Mouse embryonic stem cells,mESCs)的功能如维持自我更新能力的作用少有报道。因此本研究使用流式细胞术、Western blot、Ch IPseq、GeCKO全基因组筛选、化合物库筛选等方法寻找Suds3调控的通路,剖析其维持自我更新的作用机制。本研究获得以下结果:敲除Suds3的小鼠胚胎干细胞在无血清培养下细胞无法存活;敲除Suds3后部分细胞往细胞坏死方向迁移;敲除Suds3后细胞S期占比升高。上述结果为深入研究Suds3在胚胎发育和mESCs维持自我更新能力的调控机制提供了理论基础。在第二部分,诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,i PSCs)为再生医学的发展提供了巨大的前景,但i PSCs形成的分子机制仍具有很大的未知。为探究同源异型盒C8(homeobox C8,Hoxc8)基因在7因子(Sall4-Esrrb-Glis1-Jdp2-Mkk6-Kdm2b-Nanog)诱导的体细胞重编程中的作用。本研究通过正反遗传学方法、分析重编程关键事件及联合敲降Hoxc8和SMAD家族成员6(SMAD family member 6,Smad6)等方式解析Hoxc8在多能性网络重建过程中的相关机制。本研究获得以下结果:敲降Hoxc8可显著降低7因子诱导的体细胞重编程效率(**P<0.01);而过表达Hoxc8对7因子诱导的体细胞重编程无显著影响。实时荧光定量PCR结果表明:敲降Hoxc8对多能性基因表达和体细胞基因沉默均无影响,同时对重编程过程关键事件间质上皮转换(mesenchymal-epithelial transition,MET)也无影响。但有趣的是,本研究发现在7因子诱导的体细胞重编程中同时敲降Hoxc8和Smad6,可恢复敲降Hoxc8引起的重编程效率降低。上述结果表明Hoxc8在7因子诱导的体细胞重编程中具有重要作用,为进一步揭示Hoxc8调控细胞命运转变的机制提供参考。

关键词： BAF45D   PAX6   脊髓   神经干细胞   神经分化  

摘要： 背景脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)缺少治愈手段,给患者和社会造成巨大负担。人脊髓神经干细胞(Neural stem cell,NSC)为解决这一问题提供了新途径,但是人脊髓神经干细胞天然资源缺乏,限制了相关基础研究和临床应用。哺乳动物染色质重塑BAF(brahma-related gene(BRG)1 associated factor)复合体是一种具有特定功能的遗传物质,其在神经系统发育及与人体有关的疾病中扮演重要角色,它含有许多基因家族编码的亚基。BAF45D(也称为DPF2)是BAF染色质重塑复合物的一个成员。BAF45D的突变与Coffin-Siris综合症(CSS)密切相关。然而BAF45D在神经分化中的功能不明。脊髓神经干细胞(NSCs)可以表达PAX6、NESTIN和SOX1/HOXC9等标志物。PAX6是脊椎动物和无脊椎动物中枢神经系统和内分泌腺等组织发育所必需的转录因子,参与了包括神经发育在内的许多关键的生物过程。PAX6能够调控NSC自我更新、基底祖细胞生成和神经发生的基因网络。在神经组织的发育过程中,BAF复合物与主要调节神经发生的转录因子PAX6相互作用。已知转化生长因子(TGF-β)家族的SMAD信号通路对神经的正常发育和功能至关重要。SMAD和维甲酸(Retinoic acid,RA)信号通路均可以控制PAX6的表达。但是,目前仍不知道BAF45D是否通过与SMAD合作在控制PAX6表达中发挥作用。目的本研究为了阐明BAF45D是否通过诱导PAX6表达在脊髓神经干细胞形成和CSS中发挥作用。方法H9细胞以单细胞种板后使用神经诱导培养基(N2B27培养基,辅以100n M LDN-193189、10μM SB431542、4μM CHIR-99021、100ng/ml FGF2、100ng/ml FGF8和10μM DAPT)连续处理十天,之后更换为神经维持培养基(N2B27培养基,辅以2μM SB-431542、3μM CHIR-99021和200n M Hh-Ag 1.5),传代五次后更换为神经干细胞培养基(N2B27添加补充剂,含20ng/ml FGF2,20ng/ml表皮生长因子/EGF)生成脊髓神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)。神经诱导过程中通过WB、IF检测脊髓神经分化相关标记蛋白OCT4、PAX6、NESTIN、SOX1、HOXC9、GFAP、MBP、TUJ1的表达情况。H9细胞通过慢病毒感染过表达野生型BAF45D,WB检测BAF45D及PAX6、p-SMAD3的表达水平。H9衍生的NSCs通过慢病毒过表达野生型BAF45D及CSS相关突变形式的BAF45D-C330W和R350H,再经WB检测BAF45D及PAX6、p-SMAD3的表达水平。进一步实验通过CUT&Tag测定H9细胞来源的脊髓NSCs中BAF45D的DNA结合全基因组分析,探讨BAF45D在定向NSC分化过程中的作用。最后采用GST-pulldown检测H9细胞与H9衍生细胞中BAF45D的相互作用蛋白。结果(1)通过脊髓神经干细胞诱导策略,H9细胞成功形成PAX6、NESTIN阳性的神经干细胞,并且表达脊髓特征蛋白SOX1和HOXC9。长期培养的脊髓神经干细胞较好地保持自我更新和脊髓特性。(2)我们发现野生型而非CSS相关的突变型的BAF45D增加了H9细胞和人脊髓神经干细胞中PAX6和磷酸化SMAD3的表达。(3)与胚胎干细胞相比,BAF45D在脊髓神经干细胞更多靶向神经干细胞命运决定相关的基因。(4)BAF45D与BRG1、PAX6、p-SMAD3可能形成蛋白复合体,可能参与诱导PAX6表达。结论我们的数据支持了BAF45D通过诱导PAX6表达促成人脊髓神经干细胞的新作用,突出了BAF45D在神经分化中的重要意义。

关键词： 猪孤雌胚胎干细胞   XCI   XIST   H3K27me3  

摘要： X染色体失活(X chromosome inactivation,XCI)是雌性哺乳动物通过一条X染色体的转录沉默来实现两性间X连锁基因表达的剂量补偿。大量研究表明X染色体活性状态与哺乳动物胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)的多能性及分化能力等密切相关。猪胚胎干细胞是生物医学研究中一个极好的材料,但是到目前为止,尚未获得能够参与生殖系嵌合、具有na?ve(初始态)多能性的猪ESC。阐明已建系的猪胚胎干细胞中的X染色体活性状态及其调控机制将有助于na?ve多能性干细胞的建系及其应用,也有望为早期胚胎发育过程中XCI机制研究建立体外模型。本研究利用邓宏魁课题组开发的扩展多能干细胞培养体系(LCDM体系)建立了猪孤雌胚胎干细胞系,并将其命名为pp LCDM。对pp LCDM的多能性状态和分化能力进行了系统评价,在传代过程中检测了pp LCDM的X染色体活性状态及多能性变化。结果显示,pp LCDM碱性磷酸酶染色呈阳性,表达核心转录因子OCT4、SOX2、NANOG,在体外能够自发分化形成拟胚体(embryoid body,EB)并表达三胚层标志物,具有典型的胚胎干细胞的特征。对pp LCDM分化后的XCI情况进行检测,结果表明pp LCDM分化后一条X染色体失活。利用免疫荧光标记跟踪H3K27me3状态,采用FISH跟踪XIST表达情况,对传代过程中pp LCDM细胞的X染色体失活情况进行评价。结果发现,在传代过程中H3K27me3凝集信号迅速增加,第25代时绝大部分细胞具有一个XCI凝集信号。但是,当培养到第35代时,观察到H3K27me3凝集信号呈现两种状态:一种是克隆中大多数细胞具有凝集信号,另一种是克隆中部分细胞的H3K27me3凝集信号丢失。XIST RNA FISH结果也显示XIST信号与H3K27me3高度吻合,尤其是在第35代时XIST也呈现两种状态:一种是在大部分细胞中维持点状信号,一种是在部分细胞中XIST表达丢失。以上H3K27me3和XIST检测结果提示猪胚胎干细胞中也存在类似于primed(始发态)h ESC的侵蚀(erosion)现象。为进一步验证以上结果,对不同代次的pp LCDM细胞进行了单细胞RNA测序,采用雄性LCDM细胞作为对照,从XIST表达、雌雄细胞中X连锁基因表达的比值(Female X/Male X)、X染色体与常染色体基因表达的比值(X/A)等方面进行了分析。结果表明随着代次的增加,在第15代时X/A与雄性相当,Female X/Male X比值接近于1,表明基本完成了X染色体失活。第35代左右出现两种状态:部分细胞类似于有一条X染色体失活的Class II primed h ESC,Female X/Male X和X/A比值与第15代相近,处于失活状态;另一部分细胞中XIST表达降低,Female X/Male X和X/A比值升高,处于类侵蚀状态。这些结果与H3K27me3免疫荧光和XIST RNA FISH检测结果相吻合。最后,本研究分析了发生类侵蚀后细胞中的多能性变化。分析结果表明,第35代中发生类侵蚀的细胞(P35-II型)在多能性基因表达上与未完成失活的第0代细胞相似;两种类型的第35代细胞中primed标志基因的表达高于未完成失活的第0代细胞,部分na?ve标志基因表达低于第0代细胞,表明pp LCDM细胞在传代过程中多能性逐渐降低;值得关注的是,发生类侵蚀的细胞中na?ve标志基因表达高于未发生类侵蚀的细胞(P35-I型),primed标志基因表达无明显差异。综上所述,我们的研究结果表明猪孤雌胚胎干细胞传代过程中多能性和X染色体活性状态不稳定,存在类似于primed h ESCs中的侵蚀现象。

关键词： 解淀粉芽孢杆菌   发酵优化   表面活性素   转座诱变   转录组分析   累积突变  

摘要： 表面活性素（surfactin）主要由枯草芽孢杆菌及近源物种合成的一种脂肽类生物表面活性素，最初的生物合成只发生在对数生长后期，且受到严格的调控。表面活性素具有良好的抗菌活性、低毒性、良好的生物降解性和环境相容性等优点，因此在农业生产、药物开发和环境治理等领域具有广泛的应用前景。然而，微生物发酵合成表面活性素能力处于较低水平，限制了其工业化生产和应用。与大多数野生芽孢杆菌菌株一样，野生型BacillusamyloliquefaciensCPLK1314（本实验室保藏）中的surfactin产量不高，在LB培养基中约为200mg/L。鉴于CPLK1314的基因组含有4个用于合成环脂肽的大型基因簇，且都处于激活状态，在发酵液中均能检测到相应的代谢产物，我们推测CPLK1314具有较强的合成、分泌和免疫耐受环脂肽的能力，是理想的用于基因工程改造合成环脂肽的菌株。为进一步提高surfactin的产量，本研究以解淀粉芽胞杆菌CPLK1314为研究对象，从CPLK1314突变体库的构建及高产surfactin突变株的筛选入手，进而采用转录组研究工具解析高产surfactin突变株高效合成的分子机制，并利用基因工程等手段构建重组敲除载体和重组表达载体，依次转入突变株H5（△GltB）中，实现累积突变，构建高产工程菌，最后，将构建的高产工程菌进行发酵工序优化。主要研究结果如下：　　（1）以解淀粉芽胞杆菌CPLK1314为出发菌株，利用化学转化法成功将带有TnYLB-1转座子的质粒pMarA转入解淀粉芽胞杆菌CPLK1314中。通过50℃高温诱导培养产生了CPLK1314的插入突变体，挑取单菌落21340个，构建了CPLK1314的插入突变体库。以金黄色葡萄球菌为指示菌，从21340株突变体库中筛选出1770株抑菌活性明显提高的突变株、7600株抑菌活性明显下降的突变株和11970株抑菌活性没有发生变化的突变株，再从1770株抑菌活性明显提高的突变株中筛选出150株抑菌活性明显提高两倍的突变株、29株抑菌活性明显提高两倍以上的突变株和10株抑菌活性明显提高三倍以上的突变株。从抑菌活性明显提高三倍以上的突变株中随机挑选3株，通过反向PCR扩增突变体的插入位点基因序列，PCR产物于生物公司进行测序，并将测序结果在NCBI网站进行同源分析，成功鉴定出3株突变体插入位点所在基因分别为RapF、GltB、SerA。　　（2）针对解淀粉芽胞杆菌突变株△GltB高效合成surfactin的关键代谢模块及调控因素不清晰的问题，以野生型解淀粉芽胞杆菌CPLK1314为对照，采用比较转录组学研究方法，从转录水平解析了高产菌株解淀粉芽胞杆菌△GltB高效合成surfactin的分子机制。通过KEGG分析，发现GltB基因的突变潜在通过促进转录因子等的表达来促进srfA基因簇的转录，能够抑制脂肪酸降解代谢促进脂肪酸前体物质的积累等不同途径提高突变株△GltB合成surfactin的能力，为后期菌株的理性基因工程设计提供了新的理论基础。　　（3）通过转录组差异基因比较分析，推测到突变株△GltB、△SerA和△RapF可能通过不同的调控途径来提高surfactin的含量。在解淀粉芽胞杆菌突变株△GltB的基础上，本实验成功构建了GltB、SerA和RapF基因的双突变株和三突变株，对构建的多位点突变株合成surfactin能力测定证实了上述3个位点的同时突变对surfactin的合成具有累加作用。此外，在重构surfactin合成代谢网络过程中，我们推测基因YbdT编码细胞色素P450酶可特异性催化3-羟基脂肪酸的生物合成和基因srfAD编码硫代酯酶，刺激脂肪转化反应可能是surfactin合成的关键限速酶。为了证实上述推测，本实验成功实现了YbdT和srfAD在CPLK1314中组成型强表达，且两个基因的重组表达均可显著提高surfactin在CPLK1314中的生物合成。除了上述两个基因外，比如sfp，LcfAandLcfB等参与surfactin生物合成过程中关键中间产物的形成，它们均可能是surfactin合成的限速酶。对这些酶基因进行改造，比如提高其催化活性，增加稳定性，解除其反馈抑制和实现其过表达等策略均有可能显著提高surfactin在芽孢杆菌中的生物合成。　　（4）以surfactin产量为主要评价指标，对突变菌株进行了发酵工艺的优化。通过单因素实验和响应面Box-Behnken模型优化发酵培养参数，经三因素三水平的响应面分析表明最佳发酵培养条件为：sucrose40g/L，NH4NO38g/L，yeastextract1g/L，NaNO325g/L，KH2PO40.333g/L，Na2HPO4?12H2O1g/L，MgSO4?7H2O0.15g/L，C

关键词： 造血干/祖细胞   胚胎干细胞   内皮细胞向造血细胞转化   GFI1  

摘要： 在人的一生中,人造血干/祖细胞(human hematopoietic stem and progenitor cells,hHSPCs)具有多谱系分化与长期再生的潜能,对各种成熟血细胞的持续产生与维持至关重要。对小鼠和斑马鱼的研究证实,造血干/祖细胞最初出现于主动脉背腹侧的主动脉-性腺-中肾(aorta-gonad-mesonephros,AGM)区域中的造血内皮细胞(hemogenic endothelium cells,HECs),通过内皮细胞向造血细胞转化(endothelial to hematopoietic transition,EHT)产生。但是目前我们对人EHT过程的研究与认识还稍显匮乏,对人EHT与造血内皮细胞谱系决定之间的具体机制尚不明确,在一定程度上限制了 hHSPCs在再生医学领域的应用。造血发育是一个由复杂的转录因子网络调控的渐进过程,独立生长因子(Growth factorindependent-1,GFI1)是其中一个重要的转录调控因子,在多系血细胞发育中发挥重要作用,也是小鼠EHT的关键调控因子。但是有关GFI1在人的造血发育与hHSPCs的形成中的作用报道较少,GFI1是否在人EHT中发挥着与在小鼠中同样重要的作用还不得而知。人胚胎干细胞(Human embryonic stem cells,hESCs)具有强大的自我更新能力和全谱系分化潜能,被广泛的应用于人体各系统组织细胞发育研究和再生医学研究。因此,本文利用hESCs作为模型,在体外研究人类早期造血发育过程中的调控机制。首先,本研究利用CRISPR/Cas9技术构建三株GFI1敲除人胚胎干细胞细胞系H1-GFI1-/--1/2/3#,并将其进行体外单层造血分化,使其分化为造血干/祖细胞。我们通过该模型探索GFI1在人造血分化中对HSPCs的生成的影响,并通过降低人外周血中hHSPCs的GFI1基因表达,来探究其对hHSPCs功能的影响;接下来,我们在人造血内皮报告细胞系H1-GATA2WT/GFP(在造血内皮标志基因GATA2后插入表达绿色荧光蛋白GFP的人胚胎干细胞系)中敲除GFI1,构建细胞系H1-GATA2WT/GFP-GFI1-/-,进一步研究GFI1对造血发育关键细胞—HECs的作用;最后,为了进一步探究GFI1在EHT中的调控机制,我们将GFI1敲除的HECs与野生型HECs进行了转录组测序、染色质开放性测序ATAC-seq 以及蛋白质-DNA 互作检测(Cleavage Under Targets and Tagmentation,CUT&Tag)分析。通过上述研究,结果显示:1.与野生型对照组相比,H1-GFI1-/-在造血分化过程中无法产生造血祖细胞及各谱系血细胞,但可产生正常的内皮细胞,表明GFI1缺失会造成人血液发育过程中内皮向造血转化功能的障碍;人外周血hHSPCs实验表明GFI1具有维持人外周血hHSPC的正常功能的作用。2.H1-GATA2WT/GFP-GFI1-/-经过造血分化后,可以产生HECs,但是分选出的HECs不再具有产生造血祖细胞的能力。在GFI1敲除细胞系造血分化过程中回补GFI1表达,则可重新产生造血祖细胞。结果提示GFI1不影响造血内皮的谱系发育,但是对EHT过程是必不可少的。3.转录组测序结果提示GFI1敲除的HECs的内皮相关基因表达上调,造血相关基因表达下调。ATAC-seq结果显示GFI1敲除显著降低HECs中血细胞发育相关基因的染色质开放程度。此结果提示在EHT发生之前,内皮细胞已在染色质基因开放性上产生了分化倾向性,开始形成独特的基因表达模式。通过CUT&Tag分析,我们进一步发现EHT过程中,GFI1的直接调控靶点—PI3K-Akt信号通路。上述生物信息学分析结果提示GFI1可通过直接结合PI3K-Akt信号通路和维持特定染色质开放这两种方式来调节人内皮细胞向造血细胞的转化,继而控制hHSPCs产生。我们在体外造血分化模型中利用广谱PI3K通路抑制剂—LY294002抑制该信号通路,导致造血干/祖细胞产生受阻,提示PI3K-Akt信号通路对EHT过程具有调控作用。综上所述,上述工作表明GFI1在人EHT过程中具有重要作用,并揭示了其在该过程中的分子机制,明确了维持正常EHT所需的表观遗传调控机制的重要性。我们的工作有助于全面了解EHT背后的分子机制,从而有助于在体外获得更多的造血干/祖细胞,为其在再生医学领域的应用奠定基础。

关键词： 单碱基编辑   胚胎干细胞诱导心肌细胞   长QT综合征   KCNH2  

摘要： 目的和意义:长QT综合征(LQTS)在世界范围内的发病率大约是1/2000～1/2500。其中LQT1、LQT2和LQT3占比超过75%,LQT2的发病率在中国人群中最高,是青少年猝死的主要原因之一,当QT间期大于500ms时,LQT2病人更易发生恶性心律失常事件。LQT2的发病机制又分为钾离子通道异常转录/翻译(1型)、蛋白转运障碍(2型)、异常通道门控/动力学(3型)和通道通透性改变(4型),蛋白转运障碍为主要发病机制。KCNH2基因又分为氨基端、膜电位感受区、孔区和羧基端,孔区参与离子通道的构成,发生在孔区的致病突变常易导致恶性心律失常事件,我们试图建立发生在孔区的致病型LQT2疾病模型,对于指导LQT2患者的治疗有重要的意义。美国食品及药品管理局要求新药上市前需使用人源心肌细胞检测药物毒物,而LQT2一线用药β受体阻滞剂仅对70%的患者有效,因此我们建立的人源心肌细胞LQT疾病模型更加精准且实用。方法:1,构建单碱基编辑工具ABEs(Adenine base editors):从HGMD库中找到LQT2突变位点Y616C,NCBI库下载KCNH2基因序列找到Y616C并合成sg RNA,从Addgene网站中获得质粒epi-ABEmax,将sg RNA与载体质粒组装成目的质粒。2,编辑干细胞并筛选目的H9单克隆细胞群:确定Lipofectamine stem为转染试剂并优化转染方案,药物浓度摸索试验确定4ug/ml的Blasticidin作为初筛浓度,2ug/ml的Blasticidin作为维持尝试。转染并药筛H9细胞4天后测序知编辑效率为27%,8天后测序知编辑效率为65%,从65%编辑率的H9单克隆细胞群中分离目的单克隆细胞群并扩增细胞数量。3,诱导分化为心肌细胞:将目的单克隆细胞群接种在12孔板中,4天后观察细胞汇合度以及细胞生长状态并开始诱导分化。Day1-2使用CO1诱导,Day3-4更换为CO2诱导,Day5-6更换为CO3诱导,此后每2天换一次液,Day9可看到跳动的心肌细胞,Day15完成心肌诱导。结果:1通过干细胞基因编辑得到突变型Y616C胚胎干细胞。2三胚层分化实验可见软骨组织、神经组织和胃肠组织,证明基因编辑并未影响Y616C胚胎干细胞干性,而且细胞免疫荧光可见干性标志物OCT4、NANOG、SSEA4、Tra-1-81正常存在,RTPCR可见干性标志物NANOG、POU5F1、SOX2、LIN28和DPPA4转录正常。说明Y616C胚胎干细胞全能性并未受到基因编辑的影响。3干细胞分化成心肌实验,可见跳动的心肌细胞以及细胞免疫荧光可见心肌细胞标志物a-Actinin和TNNT2正常表达。Y616C胚胎干细胞能正常分化成心肌细胞。结论:通过基因编辑作用本实验产生了Y616C基因突变型胚胎干细胞,其干性与分化为心肌细胞的潜能都正常。

关键词： HLA抗原   等位基因   外显子   碱基序列   碱基替换突变   DNA测序  

摘要： 目的探讨中国造血干细胞(HSC)捐献人群人类白细胞抗原(HLA)新等位基因形成的分子机制。方法选择2008-2014年, 山东省血液中心HLA实验室自20 656例HSC捐献者中发现的37个HLA新等位基因为研究对象。采用HLA等位基因特异性扩增测序方法确认HLA新等位基因的碱基序列。HLA新等位基因在基因数据库(Genbank)进行注册, 并且将基因的碱基序列提交世界卫生组织(WHO)HLA系统因子命名委员会, 获得正式HLA等位基因命名。将HLA新等位基因碱基序列与其碱基序列最相近的已知等位基因进行比较, 分析碱基突变情况及其对编码氨基酸的影响。采用血清学HLA分型方法对存在错义突变的HLA新等位基因所编码HLA的抗原特异性进行鉴定。本研究遵循的程序符合2013年修订版《世界医学协会赫尔辛基宣言》要求。结果①本组37个HLA新等位基因与其序列最相近的已知等位基因比较结果显示, 29个HLA新等位基因为单个碱基替换, 5个为2个碱基替换, 3个为碱基片段交换或重组。②对9个存在错义突变的HLA新等位基因所编码HLA的抗原特异性鉴定结果显示, HLA-B*40:96基因编码的抗原为HLA-B40亚型, 与HLA-B*40:96基因碱基序列最相近的已知HLA等位基因为HLA-B*40:06:01:01, 其编码的抗原为HLA-B61亚型, 其余8个HLA新等位基因编码抗原的特异性与其相应的碱基序列最相近的已知HLA等位基因所编码的抗原特异性一致。结论本实验室发现的中国HSC捐献人群的37个HLA新等位基因中, 碱基替换是形成新等位基因的主要分子机制。

关键词： 红细胞   发育进程   造血干细胞   胚胎干细胞   脐带血  

摘要： 输血是现代医学的重要组成部分和治疗措施。然而血源匮乏严重制约着输血的应用与实施。利用干细胞体外诱导扩增并定向分化产生功能性的红细胞用于临床输血是一种新的研究思路。脐带血、外周血或骨髓等来源的造血干细胞(Hematopoietic stem cells，HSCs，CD34+)通过体外诱导分化产生功能性红细胞，但是由于面临着供者差异和成体造血干细胞体外增殖能力的限制，使其无法成为理想的材料。胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ES）具有自我更新和体外无限扩增的特性，理论上可作为体外产生红细胞的无限潜在细胞来源;但是体外诱导ES细胞产生的红细胞存在扩增能力有限和脱核率低等问题。探索ES体外造血瓶颈问题产生的机制具有重要的科学和现实意义。　　为探索ES来源的CD34+造血干细胞（以下简称ES-CD34+）细胞产生红细胞的有限增殖能力的机制，本论文采用脐带血(Cord blood，CB)来源的造血干细胞CD34+（以下简称CB-CD34+）作为对照，利用本实验室建立的三阶段红系培养方法检测细胞增殖情况。研究发现ES-CD34+产生的红细胞比CB-CD34+产生的红细胞减少3500倍;并且ES-CD34+来源的早期红系祖细胞集落形成单位(Burst forming unit-erythroid，BFU-E)和晚期红系祖细胞集落形成单位（Colony forming unit-erythroid，CFU-E）集落大小明显小于CB-CD34+来源的。进一步研究发现，ES-CD34+有限的增殖能力是红系祖细胞细胞周期阻滞造成的。针对这一现象，本论文检测细胞周期相关基因发现促进G1期进入S期的关键基因如CCNE1、CDK2和CDK4转录水平和蛋白水平都明显降低;反之，抑制G1期进入S期的基因P57的转录水平和蛋白水平显著升高。　　为进一步了解ES-CD34+产生的红细胞的分化发育进程，本论文通过流式细胞仪检测红细胞表面分子GPA、Band3和α4-integrin的表达情况从而鉴定出红系终末阶段各期细胞，分析CB-CD34+和ES-CD34+红系各阶段细胞的分化情况。研究发现，在相同的培养条件下，ES-CD34+产生的红细胞较CB-CD34+产生的红细胞分化进程快。流式检测脱核率显示ES-CD34+来源的晚幼红细胞（orthochromatic erythroblasts，ortho;简称ES-ortho）几乎不脱核。进一步探索其原因发现ES-CD34+来源的中幼红细胞(polychromatic erythroblasts，poly;以下简称ES-poly）和ortho染色质明显比CB-CD34+来源的疏松，并且细胞核面积明显大于CB-CD34+来源的;分析ES-poly和ES-ortho表面特征发现ES-poly和ES-ortho的细胞面积和细胞质面积大于CB-CD34+来源的，核质比小于CB-CD34+来源的，反映其具有胚胎期红系发育的属性。研究发现ES-poly和ES-ortho细胞核极化程度明显弱于CB-poly和CB-ortho，且ES-ortho部分细胞并未退出细胞周期。　　鉴于上述情况，利用转录组测序（RNA-Seq）和染色质可及性分析(ATAC-Seq)探索ES-ortho脱核障碍的分子机制。通过RNA-Seq联合ATAC-Seq分析启动子区域开放程度改变的差异基因发现自噬通路和染色质修饰通路显著下降。与红细胞脱核以及染色质凝集相关的基因因其启动子区域开放程度减少引起其基因表达的下调，并且经验证这些基因的蛋白也发生下调;与胞质分裂相关的基因在ES-ortho中因其启动子区域开放程度减少引起基因表达下调;成体型血红蛋白在ES-ortho中表达降低，但是胚胎型血红蛋白表达上升，启动子区域的染色质开放程度与转录水平表达变化一致。　　自噬通路在ES-ortho中显著下调，本论文选取自噬关键基因ULK1、ATG13和ATG14，在CB-CD34+中分别将其敲低，结果显示敲低ULK1、ATG13和ATG14并不影响红细胞的脱核。此外，分析RNA-Seq和ATAC-Seq的转录因子结果发现NFE2在ES-ortho中转录水平显著下降并且受其调控的序列的启动子区域开放程度异常。有趣的是，根据研究资料表明NFE2是红细胞发育过程中唯一一个随着发育进程蛋白表达逐渐上调的转录因子。进一步结合Cistrome data browser数据库发现ES-ortho表达下调的基因中近1/10的基因受NFE2调控。基于以上发现，推测转录因子NFE2在人晚幼红细胞脱核过程中发挥重要作用。为证实上述推测，本论文在CB-CD34+中敲低NFE2，研究发现红细胞脱核明显受到影响，此结果显示出NFE2在红细胞发育过程中的新功能。　　综上，本论文发现ES

关键词： 深度学习   深度学习路线   线上教学   高中生物学   基因工程  

摘要： 2017版新课标提出,我国生物学的课程须以促进学生核心素养发展为要义。深度学习理论的目标与其是一致的,因此深度学习对生物学课程中提升学生的核心素养有重要作用。2020年初,一场疫情导致线上教学成为更普遍的教学手段,但线上教学因其空间局限性,与传统的教学方式有很大的不同,一线教师缺乏线上教学的经验。因此,在线上教学时将深度学习理论融合进教学过程,能为新一轮课改提供新的思路。本文通过研究国内外文献,梳理了深度学习和线上教学的国内外发展现状,接着对深度学习路线进行研究,结合了最新版课程标准提出的核心素养,进行了包含深度学习理念的高中生物学线上教学设计。该线上教学设计包括教学内容与目标分析、活动设计、教学评价设计,并在新冠疫情期线上教学期间,选取“基因工程”这个单元进行教学实践。本文通过对实验组进行以上教学实践,对照组进行常规线上教学,利用教学前后概念图法和测试对两组学生进行评价。结果说明,实验有显著性差异,即本文的研究,验证了高中生物学线上教学中深度学习有一定的可行性。笔者进行的线上教学实践,能让学生对相关生物学知识加深印象,增加学生对生物学的探索欲望,并利用已学知识解决真实情境下的问题,最终提升生物学核心素养。除此之外,本文还明确了实践中对线上教学中深度学习的困难,并提出相应的建议。

关键词： 过继性T细胞免疫疗法   TCR-T   VPS34   SAR405   趋化因子   NY-ESO-1  

摘要： 背景和目的: T 细胞受体基因工程改造 T 细胞(T-cell receptor(TCR)-engineered T cell,TCR-T)疗法,是过继性T细胞免疫治疗的一种。与嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)疗法相比,TCR-T 细胞可针对胞内靶点,在治疗实体瘤领域具有较大的优势,是当前的研究热点。目前已在许多临床前研究和临床试验中取得了一定的实体瘤治疗效果,但TCR-T疗法仍有许多可以关注和改进的要点。 对TCR-T细胞治疗而言,选择合适的肿瘤抗原靶点非常重要。肿瘤抗原纽约食管鳞状细胞癌-1(New York esophageal squamous cell carcinoma-1,NY-ESO-1)是癌-睾丸抗原(Cancer testis antigens,CTAs)家族中的重要成员,在多种类型的肿瘤中都有表达,且只在免疫豁免的生殖细胞中表达,在成人其它正常组织中不表达,是一个较好的TCR-T细胞治疗靶点。 TCR-T疗法产生抗肿瘤反应的前提是有效的肿瘤浸润,浸润细胞的数量越多,往往会介导更强的抗肿瘤效果。但实体瘤可以通过多种因素来限制T细胞归巢和浸润,如实体瘤组织致密的基质结构、异常的脉管结构以及各种影响T细胞归位的化学因素常常使得T细胞难以浸润。趋化因子在T细胞迁移浸润中,起着不可或缺的作用。改变相关趋化因子及其受体的表达,可以招募更多的免疫细胞到肿瘤微环境中,增强免疫细胞治疗的效果。 C-C 基序趋化因子 5(C-C motif chemokine 5,CCL5)和 C-X-C 基序趋化因子10(C-X-C motif chemokine 10,CXCL10)已被多次证实可以促进免疫细胞向肿瘤部位的迁移。在VPS34抑制剂SAR405的相关研究中发现其可以诱导CCL5和CXCL10的表达增加,所以SAR405和TCR-T免疫疗法的联合,将有希望增加TCR-T细胞向肿瘤组织的募集浸润,增强TCR-T免疫疗法治疗效果,为改善TCR-T免疫疗法治疗效果提供新的思路。 方法: 本课题主要从以下四个方面进行了研究: 1.靶向NY-ESO-1的TCR-T细胞的构建及验证:通过分子克隆技术将靶向NY-ESO-1的TCR α和p序列连接到慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EFl-CopGFP-T2A-Puro(pCDH)上构建 pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-TCRαβ-T2A-PuroPCDH-TCR(pCDH-TCR),并通过菌落PCR和测序验证结果。无内毒素法提取慢病毒表达质粒pCDH-TCR、包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G,选用人肾上皮细胞系293T细胞作为包装细胞,在脂质体作用下通过三质粒包装系统(pCDH-TCR、psPAX2、pMD2.G)进行包装,包装后收集慢病毒液,通过稀释荧光计数法测定慢病毒滴度,并浓缩。同时,通过密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC),并通过流式细胞术筛选人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen,HLA)分型为A2阳性的PBMC细胞作为TCR-T构建的储备细胞。采用人CD3/CD28免疫磁珠活化T细胞,同时添加白细胞介素-2(Interleukin-2,IL-2),促进并维持T细胞持续扩增,用浓缩后pCDH-TCR慢病毒液,感染扩增的T细胞,并通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,RT-qPCR)和流式细胞术验证外源TCR的表达。 ***-T细胞体外效应功能评价:通过流式细胞术评估在NY-ESO-1高表达肿瘤细胞及NY-ESO-1157-165特异性多肽刺激下,TCR-T细胞CD25,CD137和IFN-γ的表达情况。通过活细胞标记荧光染料羟基荧光素二醋酸琥珀酰亚胺酯(5(6)-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester,CFSE)标记 TCR-T细胞对其特异性增殖能力进行评价。最后对TCR-T细胞在不同效靶比下对靶细胞的杀伤能力进行评价。 ***405对T细胞作用的研究:首先通过CCK-8法检测不同浓度SAR405作用下T细胞活性,从而确定SAR405的IC50值,并结合相关参考文献,评价SAR405 对信号转导和转录激活因 1(Signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)和干扰素调节因子-7(Interferon regulatory factor 7,IRF7)的诱导效应。具体地,通过RT-qPCR检