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关键词： 17β-雌二醇   基因工程抗体   多肽嵌合抗体   多肽模拟表位   免疫层析试纸条   抗基质干扰传感器  

摘要： 雌激素作为典型激素类内分泌干扰物,可干扰机体激素代谢平衡,并影响机体生长和发育等重要生理功能。环境介质如土壤水源等是目前雌激素污染富集的重要场所,而因此间接污染食品基质是其导致危害机体健康的重要因素。动物源食品因其来源广泛,生活被需求迫切并易暴露于雌激素污染的环境介质,成为环境雌激素富集的重点对象。因此,建立食品基质尤其是动物源食品中雌激素的准确、灵敏、高效的分析检测方法尤为重要。免疫分析因具有高灵敏和高特异性等优势在食品安全检测中广泛应用,然而食品基质干扰效应是限制免疫分析在食品安全快速检测中精准和个性化应用的关键。基于此,针对特定靶标获得高亲和力、抗基质干扰的特异性识别元件是解决免疫快速检测方法稳定性和可靠性的主要工作之一。相比传统抗体,通过基因工程重组抗体技术是获得高质量抗体的重要手段。本论文以17β-雌二醇为模型,在哺乳动物细胞Expi293F中瞬时表达雌二醇抗体及抗体片段免疫识别元件;基于抗体制备雌二醇荧光定量检测试纸条,实现对牛奶中雌激素的高灵敏快速检测;通过噬菌体展示肽库结合二代测序技术,筛选特异性识别雌二醇的多肽免疫元件及雌二醇的模拟表位肽,构建基于模拟表位肽的雌二醇抗基质干扰传感器,实现对牛奶中雌二醇的高灵敏快速检测。主要研究内容和结论如下:1.雌二醇IgG、Fab、scFv抗体的表达与评价研究。从Protein Data Bank（PDB）数据库中检索获得雌二醇单克隆抗体序列信息（PDB ID:1JN6）,分别构建雌二醇IgG抗体重链、轻链表达载体pTT5-IgGH、pTT5-IgGL,雌二醇抗原结合片段Fab抗体重链表达载体pTT5-Fab H和雌二醇单链抗体scFv表达载体pTT5-scFv。将表达质粒分别按1:1.5重/轻链比例共转染哺乳动物细胞Expi293F,分别进行IgG、Fab及scFv抗体的瞬时表达。结果表明,通过30 mL的Expi293F细胞瞬时表达体系,获得雌二醇IgG抗体和Fab抗体各约800μg,表达产量约27 mg/L;基于表达的IgG和Fab抗体构建雌二醇竞争ELISA检测标准曲线IC50分别是0.129 ng/mL和0.188 ng/mL。此外,scFv抗体的上清培养基纯化电泳结果未显示目的条带,但细胞沉淀中显示scFv抗体条带,故初步分析scFv抗体聚集在胞内未分泌表达。2.荧光标记的雌二醇Fab-EGFP抗体、scFv-EGFP抗体的表达与评价研究。为进一步探究scFv抗体在表达过程中的亚细胞定位,将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因作为指示剂,与scFv基因连接,构建重组表达载体pTT5-scFv-EGFP。此外,为进一步探究不同表达载体对表达产量的影响,保持信号肽等其余设计不表,构建pc DNA3.4-IgGH/L和p CEP4-IgGH/L表达载体。最终,为获得荧光标记抗体,构建pTT5-Fab H-EGFP和pc DNA3.4-Fab H-EGFP表达载体。在相同条件下进行哺乳动物细胞瞬时表达scFv-EGFP、IgG、Fab-EGFP。结果表明,Fab-EGFP和scFv-EGFP荧光标记抗体更多在细胞内未分泌到培养基中;基于pc DNA3.4和p CEP4载体的IgG抗体表达产量约0.667 mg/L和7 mg/L。因此pTT5比pc DNA3.4和p CEP4更适合作为IgG全长抗体的哺乳动物瞬时表达载体。3.特异性识别雌二醇的多肽元件及其模拟表位肽的筛选方法的构建及机制研究。从数据库或文献中获得公开的抗体序列是极少数,大部分靶标分子的抗体信息是非公开的,而环境和食品中潜在高风险化学污染物数以千万,在这种情况下,如何快速获得靶标分子的特异性免疫识别元件,是当前免疫快速检测的重要工作之一。本章分别以雌二醇全抗原（E2-BSA）和雌二醇单抗（anti-E2 mAb）为靶标分子,将二代测序技术与噬菌体展示肽库传统筛选方法相结合,分别筛选获得特异性识别雌二醇的抗体肽和雌二醇分子的模拟表位肽。整个筛选过程仅需进行一轮,且不需噬菌体的扩增纯化,筛选结果的准确性和成功率大幅度提高。最终获得了能够特异性识别雌二醇的抗体肽（ASNYFEHRIHLF、SAEDHQSYTAAR、HTEIGIARLLSW）和雌二醇的模拟表位肽（KWQIWHGYFFGW、KWQIWHGYFFYW、KWQIWHGEFFGW）。4.检测牛奶中17β-雌二醇的荧光定量免疫层析试纸条的构建。免疫层析试纸条小巧便携、成本低、响应速度快,是开发现场即时检测设备的最佳载体。以抗体作为检测识别元件,基于量子点荧光微球（QBs）、重组蛋白A（SPA）和兔抗鼠IgG抗体（anti-IgG）构建的荧光探针QBs@SPA和QBs@SPA@anti-IgG作为信号供体,构建雌二醇免疫层析试纸条。探针表面固定的SPA和anti

关键词： 乳腺癌   BRCA1   BRCA2   基因突变   DNA测序  

摘要： 目的:分析深圳地区乳腺癌患者BRCA1/2基因突变状态,研究其临床和病理特征。方法:选取深圳市人民医院2016-07至2021-12期间符合入组条件的240例乳腺癌患者作为研究对象,运用二代测序技术对BRCA1/2基因进行检测。回顾性分析其临床和病理特征并进行随访。结果:1、240例乳腺癌患者中,BRCA突变携带患者有31例,突变率为11.4%。最常见突变位点为C.3109C>T,检出频次共3次。2、BRCA携带患者发病年龄为25～55岁,中位年龄为40岁。63.1%有相关肿瘤家族史。17例行患侧乳腺全切除术,14例行保乳手术(其中1例保乳术后行患侧乳房预防性切除术,有6例患者行预防性双侧卵巢输卵管切除术)。BRCA相关肿瘤大小0.6～4.5cm,平均直径1.55cm。术后病理提示28例为浸润性癌,3例为原位癌;Luminal A型有6例,Luminal B型11例,Her-2阳性型1例,三阴型13例。77%的BRCA1相关肿瘤表现为三阴型。3、随访2个月～64个月,有5例BRCA携带者发生第二原发性乳腺癌;1例患者发生肺转移后死亡;余23例未发现复发及转移。结论:1、深圳乳腺癌患者BRCA突变率为11.4%,BRCA2比BRCA1突变率更高。2、与散发性乳腺癌相比,BRCA相关肿瘤组织学分级更高、肿瘤更小、TNM为Ⅰ期的比例更高。3、BRCA1相关乳腺肿瘤更容易表现为ER阴性、PR阴性、高组织学分级,三阴型比例更高。BRCA2相关肿瘤与非携带者临床病理特征相似。

关键词： 人胚胎干细胞   干性维持   谱系命运决定   Wnt/β-catenin信号通路   H3K27me3  

摘要： 原肠期的细胞谱系命运决定,即由多能性的上胚层分化为外、中、内三胚层是人早期胚胎发育过程中的核心事件,但是受限于研究手段和伦理学,我们对于控制人原肠期三胚层分化的信号、转录和表观遗传学调控机制仍较为欠缺。人胚胎干细胞是一种在体外具有无限增殖能力和分化成三胚层谱系潜能的细胞,是研究人早期胚胎发育过程的重要工具。既往基于小鼠等模式动物胚胎发育研究发现,经典Wnt/β-catenin信号的缺失导致早期胚胎致死,而异位激活经典Wnt/β-catenin信号则导致第二体轴的形成,提示经典Wnt/β-catenin信号通路在原肠期三胚层命运决定中发挥着重要作用。人胚胎干细胞分化研究发现,经典Wnt/β-catenin信号的激活是原条和内胚层谱系发育的必要条件。然而,人早期胚胎发育过程中,Wnt/β-catenin这一核心信号在多能性维持与分化及三胚层命运决定中的具体功能和分子调控机制仍有待于深入解析。本研究中,我们聚焦于人胚胎干细胞自我更新与三胚层决定分子调控机制这一关键科学问题,通过CRISPR/Cas9介导的配对敲除技术(Paired-KO)在人胚胎干细胞中敲除β-catenin(CTNNB1),诱导过表达持续活性(Constitutively active,CA)β-catenin,结合体内畸胎瘤形成和体外拟胚体(Embryoid body,EB)自发分化实验研究Wnt/β-catenin信号通路在人胚胎干细胞自我更新与三胚层分化中的功能;通过RNA-seq、染色质免疫沉淀技术(Ch IP)等实验系统解析Wnt/β-catenin信号通路在人胚胎干细胞自我更新与三胚层分化过程中的下游调控基因和表观遗传学调控机制。首先,研究发现人胚胎干细胞的稳定维持不依赖于Wnt/β-catenin信号通路。敲除(KO)β-catenin后,人胚胎干细胞的增殖和凋亡无显著改变,细胞可以稳定传代,维持正常克隆形态,并表达OCT4、NANOG等多能性基因。RNA-seq系统比较野生型和β-catenin KO人胚胎干细胞进一步证实Wnt/β-catenin信号通路不是正常人胚胎干细胞干性维持的必要条件。其次,发现Wnt/β-catenin信号通路的短暂激活是人胚胎干细胞退出多能性状态并启动三胚层分化的必要条件,而其持续激活促进中内胚层细胞命运。相较野生型对照,β-catenin KO人胚胎干细胞能在无外源碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)添加的培养条件下长期维持,提示β-catenin KO人胚胎干细胞具有更强的干性维持能力。β-catenin KO人胚胎干细胞注射入免疫缺陷小鼠皮下,不能形成畸胎瘤,提示β-catenin在三胚层分化中发挥关键作用。EB随机分化实验同样证实,β-catenin KO后,人胚胎干细胞向三胚层谱系分化的过程被基本阻断,即使在分化条件下,仍然停留在多能性状态。短暂诱导过表达CAβ-catenin,挽救了β-catenin KO人胚胎干细胞向三胚层谱系分化的能力,而长期诱导过表达CAβ-catenin,人胚胎干细胞主要激活中内胚层细胞命运,而抑制外胚层细胞命运。这些结果说明,经典Wnt/β-catenin信号在人早期胚胎发育过程中,发挥着保守的中内胚层命运决定作用,但是,这一关键的发育相关信号通路在调控中内胚层细胞命运之前,还发挥着一个全新的打破干性维持,进入三胚层谱系分化的“开关”作用。最后,发现Wnt/β-catenin信号通过去甲基化三胚层谱系发育关键基因启动子区的H3K27me3表观修饰,使人胚胎干细胞转变为可谱系命运决定的中间状态而实现三胚层谱系分化“开关”作用。Ch IP-seq实验获取了β-catenin全基因组结合位点,以及结合基因的功能特性,发现其除了结合在与细胞基本的生命活动相关基因之外,特异性地与三胚层谱系发育基因结合。β-catenin KO后,三胚层谱系发育基因启动子区的H3K27me3的水平显著上升,而多能性基因启动子区的H3K27me3的水平维持不变。这些结果证明在多能性维持阶段,β-catenin选择性结合在三胚层谱系发育基因启动子区,抑制H3K27me3修饰的水平,促进人胚胎干细胞转变为可谱系命运决定的中间状态,进而使其保留三胚层命运分化潜能。本研究率先报道了人胚胎干细胞分化过程中存在一种由Wnt/β-catenin信号控制的三胚层谱系命运决定“开关”,研究还同时发现了Wnt/β-catenin信号通过抑制关键基因启动区H3K27me3修饰的方式,促进人胚胎干细胞转变为可谱系命运决定的中间状态,维持谱系基因可转录状态的信号-转录-表观遗传学结合的基因转录调控模式。相关研究为我们系统理解人胚胎原肠期谱系命运决定提供了新理论,为人胚胎干细胞的维持与谱系分化提供了调控手段。

关键词： 学科核心素养   原创试题命制   基因工程  

摘要： 以一道基因工程原创试题为例，说明构建以生物学学科核心素养为导向的试题命制，并根据试题使用情况进行分析和思考，指导高三的有效复习。

关键词： 基因调控网络   节点重要性评价   伪敲除指标   常微分方程模型   组合优化模型   胚胎干细胞  

摘要： 细胞的生命活动中,基因调控起着至关重要的作用。基因调控是一个动态的过程,在生物的生长发育中,基因间相互作用关系是不断变化的,进而控制基因的表达水平。基因调控网络(Gene Regulatory Network,GRN)是刻画基因之间调控关系的数学模型,通常对应于通过其产物的互作调节关系,调控网络中基因间的相互作用抽象表示这种调节规则。基因调控网络为衡量网络中的节点重要性提供了可行性框架。其中节点重要性的评价可有效揭示网络中的关键基因,发现其在生物过程中的关键调控作用,如主调控因子和驱动基因等。现有的方法绝大多数是对复杂网络中的单个节点进行评估,且主要针对静态网络结构。同时需要特别指出的是,调控网络中基因组合的影响并不是单个基因效应的简单相加,组合中的基因通过相互作用,发挥着协作、对抗和相互替代等多重功能。发现重要的基因组合,特别是转录因子的组合,对发现功能基因集,揭示基因调控网络协同调节机制具有重要意义。近年来,随着测序技术,尤其是单细胞转录组测序(Single-Cell RNA Sequencing,scRNA-seq)技术的快速发展,单个细胞中全基因组层次的基因表达量化得以实现,这为识别生长发育与疾病发生发展过程的关键基因及基因集提供了基础。本文提出了一种新型的从基因调控网络中识别关键基因及集合的方法,称其为PKI(Pseudo Knockout Importance)方法。该方法能够利用时间序列单细胞转录组数据,结合先验基因调控知识,构建特异性的GRN;建立常微分方程模型,描述动态基因调控过程;节点及节点集的重要性基于伪敲除指标定量评价;建立数学规划的模型,快速准确发现重要的基因组合。本文将PKI方法应用于人类胚胎干细胞的核心GRN,以发现其中的关键转录因子与组合。论文主要研究内容如下:(1)利用先验基因调控知识与单细胞时序基因表达数据,通过逆向工程构建特异性的胚胎干细胞核心GRN,建立常微分方程(Ordinary Differential Equation,ODE)模型,描述网络的动态调控过程。(2)设计基因伪敲除实验方法,基于决定系数(Coefficient of Determination,R2),定义基因表达数据与调控网络结构吻合一致性的伪敲除指标,即PKI分数。为挖掘关键的基因组合,将其转化为量化基因敲除效应的组合优化问题,并设计启发式算法进行快速求解。从统计与优化的角度,识别出了 GRN中关键的节点与节点集合。(3)为了验证PKI方法的有效性和优越性,论文将基于PKI分数的单个节点重要性排序结果,与其他12种典型的单节点评价方法的排序结果进行了比较;对于重要节点组合,与网络最小支配集方法进行了比较研究。此外,论文利用功能富集分析,以及文献中通过湿实验发现的胚胎干细胞发育过程中的关键转录因子,验证了 PKI方法识别出的节点组合的重要性,从而证明了结果的可靠性。

关键词： 染色质三维结构   单倍型   等位特异性   体细胞核移植   重编程   胚胎干细胞  

摘要： 近年来研究发现,母本染色质和父本染色质在某些基因组位置上表现出差异,然而这种结构上的等位效应与等位基因表达之间的关系尚不明确。将体细胞核移入去核卵母细胞,体细胞经过重编程(Reprogramming)恢复到全能性状态,并且最终发育为新个体的技术称为体细胞核移植技术(Somatic Cell Nuclear Transfer,SCNT)。然而在体细胞核移植重编程中染色质高阶结构及其等位效应所发挥的作用尚不明确。针对以上问题,本人首先参与开发了三维基因组数据分析软件Hi CHap。该软件既能使用传统方式(不区分母本和父本染色体)处理高通量染色质构象捕获(Highthroughput Chromosome Conformation Capture,Hi-C)数据,也能使用定相遗传变异(Phased genetic variants)分析染色质高阶结构的等位特异性,即进行单倍型Hi-C(Haplotype-resolved Hi-C)数据处理。单倍型Hi-C是指基于定相遗传变异和Hi-C技术获得母本和父本染色质相互作用。对于二倍体细胞而言,目前支持处理单倍型Hi-C数据的软件较少,并且已有软件在单倍型Hi-C数据处理中都忽略了由单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)密度导致的系统偏差。Hi CHap软件在一定程度上减少了这种系统偏差,在兼容传统Hi-C数据处理流程的同时,Hi CHap能够使用SNP信息构建等位特异性染色质相互作用矩阵。本论文全面评估了SNP密度对单倍型Hi-C染色质相互作用偏好性的影响,为提出偏差校正算法以及相应的染色质三维结构等位特异性分析奠定了基础,并对计算结果的鲁棒性进行评价。除此之外,本论文也识别并检验了等位特异性染色质三维结构,展示了等位特异性染色质三维结构与等位特异性组蛋白修饰之间的相关性,初步阐释了等位特异性染色质三维结构在调控生物学过程中的潜在作用。其次,通过整合Hi-C等组学数据,本论文使用Hi CHap软件研究了小鼠体细胞在核移植重编程中相关细胞染色质高阶结构之间的差异,揭示了染色质高阶结构与染色质活跃状态以及基因表达之间的关联。本论文通过in situ Hi-C实验分别得到了小鼠卵丘体细胞、正常受精胚胎干细胞与核移植胚胎干细胞的高通量染色质相互作用数据,使用Hi CHap软件分析三种不同细胞的Hi-C数据,并从染色质区室(Chromatin compartment)、拓扑关联结构域(Topologically Associating Domains,TADs)、染色质环(Chromatin loop)三个不同层次比较了三种细胞染色质高阶结构之间的异同。首先,核移植胚胎干细胞与正常受精胚胎干细胞在全局上具有十分相似的染色质高阶结构。在一些重要转录因子基因(如Klf4、Sox2等)周围,核移植胚胎干细胞与正常受精胚胎干细胞在重编程中发生了相似的染色质三维结构重塑,这种染色质结构重塑促进了基因与调控元件之间的相互作用。其次,核移植胚胎干细胞与正常受精胚胎干细胞在部分染色质区域显示出一些结构差异。进一步分析发现,在这些具有结构差异的区间,很多与细胞分化和器官发育相关的基因在核移植胚胎干细胞中发生了显著异常表达,暗示着核移植胚胎干细胞的局部异常高阶结构阻碍了其细胞分化潜能。在该研究中,合作者通过相关实验验证了上述发现。再次,本论文还发现在核移植胚胎干细胞中,具有高H3K9me3信号的染色质抑制区域与不完全染色质三维结构重建之间具有一定关联。最后,在体细胞核移植重编程中,等位特异性染色质高阶结构逐渐趋于平衡,并且与等位特异性基因表达密切相关。综上所述,首先,本论文对自主开发的Hi-C数据处理软件Hi CHap进行了相应的数据特征分析及全面评价,进一步优化了软件性能。其次,本论文利用Hi CHap软件进一步分析了体细胞核移植重编程中的染色质三维结构动态变化和基因组功能之间的关系,以及等位特异性染色质三维结构与等位基因表达之间的关系,阐释了染色质三维结构在调控核移植细胞命运中的潜在作用,为解决相应的生物学问题提供思路。