关键词：
绵羊
胚胎干细胞
单细胞测序
睾丸
雄性生殖细胞
原始生殖细胞
摘要：
胚胎干细胞(ESCs)是具有无限增殖和多向分化能力的多能干细胞,包括Na(?)ve、Primed和Formative三种形态,目前在小鼠、人中已经成功衍生出三种形态的ESCs。近年来,在家畜ESCs研究中取得了突破性进展,先后有稳定的马、牛、猪、绵羊类ESCs建立。生殖细胞(GCs)作为种系遗传的关键,是传递遗传和表观遗传信息的重要介质,在体外重建GCs发育进程一直是研究的难点。ESCs已被证明可以在一定条件下诱导分化为生殖细胞,或通过导入生殖细胞分化相关基因,诱导ESCs向生殖细胞转分化。据报道,CRISPR/dCas9系统可以直接引导转录过程,且可以在转录水平募集多种效应蛋白用于基因调控。通过与转录激活因子融合的dCas9蛋白和sg RNA组成的CRISPR/dCas9介导的基因激活系统可作为诱导ESCs向生殖细胞转分化的有效手段。因此,本研究以绵羊ESCs为研究对象,鉴定绵羊ESCs的多能性和多向分化能力,结合绵羊睾丸单细胞转录组测序,筛选出调控雄性生殖的关键基因,利用CRISPR/dCas9系统构建过表达载体,为绵羊ESCs向雄性生殖细胞诱导分化体系的建立提供新的思路,为家畜体外育种新策略的实施提供基础。
本研究主要包括以下五个部分:
试验一、绵羊ESCs分离培养及鉴定
本试验旨在利用绵羊囊胚内细胞团进行ESCs衍生及鉴定。分别利用绵羊同期发情、超数排卵和卵母细胞体外成熟、体外受精、胚胎体外培养等技术,获得绵羊体内胚胎和体外胚胎。利用机械法和酶消化透明带法分离囊胚内细胞团,并接种在小鼠胚胎成纤维细胞制备的饲养层上。经过细胞传代培养后,进行ESCs鉴定。AP染色结果表明所分离的绵羊ESCs呈现碱性磷酸酶阳性着色,多能基因的免疫荧光结果显示OCT4、SOX2和NANOG均表现阳性表达,细胞增殖和细胞周期结果表明低代次和高代次细胞生长速度和细胞周期差异不显著。此外,绵羊ESCs可以在体外成功形成拟胚体,在裸鼠体内注射ESCs后可形成畸胎瘤,且HE染色表明畸胎瘤中包含三个胚层的组织形态,内中外三胚层标记基因GATA6、ASM、β-Tubulin均呈现阳性着色。通过不同培养方案进行绵羊ESCs培养,发现去除IWR-1因子后,绵羊ESCs克隆消失,且不表达多能性基因。综上所述,本试验分离了绵羊ESCs,并通过多能性检测和体内外分化能力检测鉴定其为多能干细胞,为下一步转分化研究奠定基础。
试验二、绵羊ESCs转录组学表达谱构建
本试验旨在利用smart-seq和10×genomics单细胞测序(scRNA-seq)技术分析绵羊早期胚胎和ESCs的转录表达谱。收集卵母细胞、胚胎二细胞、四细胞、八细胞、十六细胞、桑葚胚、早期囊胚、扩张囊胚、绵羊胎儿成纤维细胞和ESCs进行smart-seq测序,分析组间差异及多能基因的表达变化。结果表明,通过smart-seq测序分析,不同发育阶段胚胎聚类在一起,且从卵母细胞到八细胞聚类较紧密,十六细胞开始,每个阶段分别单独聚类,证明十六细胞期是胚胎发育中的转折时期,即合子基因组激活期(ZGA)。各组间差异基因共9,605个,且分为三大类群。其中多能性基因在囊胚组和ESCs组中均表现高表达,滋养外胚层和原始内胚层标记只在囊胚中高表达,这一结果与人和牛当中的结果一致。利用10×genomics scRNA-seq分析绵羊ESCs中潜在的细胞类群,预估所分离细胞的多能性状态。结果表明,绵羊ESCs可分为16个细胞类群,其中类群13特异性表达Primed态ESCs标记基因CXCR4、CER1和KRT8,类群11、12和14特异性表达Formative态标记基因FOXP1和CRABP2,证明ESCs中细胞之间存在异质性。综上所述,结合单细胞测序的方法,进一步证明所分离ESCs与囊胚共同表达多能性标记基因,且揭示了ESCs中细胞之间存在异质性,并值得进一步深入探索。
试验三、绵羊ESCs向PGCs转分化的研究
本试验旨在利用BMP4因子体外诱导绵羊ESCs向原始生殖细胞样细胞(PGCLCs)进行转分化。首先利用N2B27培养体系,补充b FGF和Activin A因子将ESCs向上胚层样细胞(Epi LCs)诱导,3天后,将Epi LCs进行传代,并利用补充有BMP4、SCF、EGF因子的GMEM培养基进行PGCLCs诱导,分别收集分化第3、5、7天的PGCLCs细胞进行基因表达分析。结果表明,ESCs经过诱导后,克隆消失,细胞向Epi LCs分化,呈现扁平状、鳞片状聚集,向PGCLCs分化过程中,细胞呈现短的纤维状贴壁生长,且细胞最外圈有明显的小颗粒出现。多能性基因表达结果表明,随着分化,OCT4、NANOG、SOX2表达水平逐步降低(P<0.05);分化为Epi LCs时,上胚层标记OTX2、C
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