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关键词： 胚胎发育   病毒   环境   灵长类   胚胎干细胞  

摘要： 灵长类的早期胚胎发育可分为两个大的阶段,从受精卵到囊胚的着床前阶段和从囊胚到原肠胚的着床后阶段。着床前阶段经历两次谱系分离导致Epiblast(EPI)细胞的出现,EPI细胞未来会发育为胚胎个体。着床是胚胎发育的里程碑,胚胎发育经历了重大变化。尽管体外胚胎延迟培养提供了关于人着床后胚胎发生的自组织特性。然而,着床后的胚胎谱系,尤其是EPI细胞谱系的精确细胞图谱、发育轨迹和分子调控机制仍不清楚。环境因素会对人类的早期胚胎发育造成影响。其中,环境中的病毒就是一个重要的因素,它会通过感染机体,与人的基因组整合,在人体中不断累积形成内源性的病毒。很长一段时间里都认为几乎所有具体的生理机能都要由蛋白质来完成,却忽略了占基因组近8%的内源性逆转录病毒序列,而编码基因只占到基因组的1-2%.近年来研究发现,内源性逆转录病毒在胚胎发育的各个阶段都会特异性激活并调控胚胎的发育。由于人的取材受到伦理和资源的限制,而食蟹猴被认为是人类疾病和发育的最佳模型。因此,我们首先在食蟹猴中探索了内源性逆转录病毒及其元件与早期胚胎发育的关系。发现内源性逆转录病毒元件LTR5,LTR7和Mac ERV6-LTR在食蟹猴早期胚胎的ICM和Pre-EPI细胞中特异性激活,但在着床后EPI中迅速被抑制。LTR5,LTR7在早期胚胎中的功能研究较多,但未见Mac ERV6-LTR在灵长类早期胚胎中的作用。最后,我们在食蟹猴胚胎中成功干扰Mac ERV6-LTR1a的表达,结果发现Mac ERV6-LTR1a主要参与着床前胚胎中EPI细胞的发育以及分化,同时具有招募ESRRB的潜力,而ESSRB主要参与早期EPI发育的多能性调控。体外三维延迟培养环境中的胚胎为我们提供了人着床后胚胎发育的自组织特性景观。然而,着床后的胚胎谱系,尤其是EPI细胞谱系的精确细胞图谱、发育轨迹和以及信号调控机制仍不清楚。为了填补这一缺憾,根据三维培养10-14天的人胚胎数据,我们提供了着床后胚胎完整的细胞图谱和谱系的发育轨迹。其中EPI细胞在着床后的发育备受关注,EPI未来将进一步向三个胚层分化,最后形成胚胎个体,同时是体外多能干细胞的重要来源,是未来临床运用的重要资源。但是胚胎体内EPI发育的精确细胞图谱仍然没有被描绘。我们的研究发现,EPI在着床后呈现不同的状态并执行不同的功能。其中,EPI细胞向羊膜上皮样细胞的转分化就是一个非常重要的形态学事件。事实上,我们在着床后胚胎中找到了羊膜上皮样细胞特异性的marker基因,来解决体内AME细胞鉴定困难的问题。非常有意思的是,在人着床后胚胎的研究中我们发现了EXMC细胞,而灵长类EXMC的起源可能是EPI细胞。在此,我们找到了EXMC的关键转录因子,来解决胚胎中EXMC的鉴定问题。此外,胚胎外组织释放的化学信号会充满EPI细胞的周围环境。通过着床后胚胎,我们详细解析了胚外组织Tr B,VE/YE,以及EXMC细胞对EPI细胞作用的关键信号。胚胎体内的多能性变化会经历全能状态,多潜能状态,以及谱系特异的多能状态。而囊胚早期的EPI细胞的多能状态对应于Naive胚胎干细胞。囊胚晚期EPI极性建立,羊膜腔开始形成,这时候的EPI对应于Formative的胚胎干细胞。到了着床后原肠前胚胎阶段的EPI细胞对应Primed胚胎干细胞。但是体内是否真正存在Primed状态的胚胎干细胞,目前仍然没有经过验证。因此,我们使用着床后D13胚胎建立了EPI细胞系。通过小鼠畸胎瘤实验,核型,转录组以及甲基化水平都证明着床后D13胚胎建系的EPI具有Primed特性。最终确定着床后胚胎中确实真正存在Primed状态的EPI细胞。综上,我们系统的阐述了外环境与内环境因素对灵长类早期胚胎中EPI细胞发育的影响,为将来胚胎发育的研究提供理论指导,为EPI细胞的临床运用提供帮助。

关键词： 行动者   转译   政策共识   网络   转基因作物政策  

摘要： 转基因育种技术因其不确定性带来的生态安全、健康、文化伦理等问题引发了激烈的争议,政府、专家以及公众之间日益多元的价值与利益冲突对政策共识的形成构成了严峻挑战,共识(consensus)与共识建构(consensusbuilding)成为应对政策复杂性和冲突性的重要路径,政策共识逐渐成为公共政策领域的重要研究议题。在转基因作物政策过程中,政府“应如何采取逐步逼近共识的程序和策略,协调各方利益,促进观念的融合,并提高公众的认知水平”就显得尤为重要,这是本文的兴趣所在,也是思考的起点。本文聚焦于中国转基因育种技术与社会秩序协同演化的实践过程,试图以行为主义的过程研究方法来分析不同行动情境下的行动者及其转译过程,探索我国转基因作物政策过程的解释框架。 传统公共政策过程研究分别从权力利益视角、理性学习视角以及理念视角展现了科学争议的图景和解决方案,各有特点,但也存在各自的局限性。主要表现为分析视角的片面化、政策分析中科学知识的“黑箱化”以及技术与社会的分离导致决策中的冲突难以调和。人们如何看待公共政策中的科学争议受到其科学观的直接影响。通过梳理有关科学观的研究文献,发现科学技术社会学(STS)研究领域的行动者网络理论(ANT)以实践科学观为基础,主张通过观察科学实践来把握科学的全貌,这与马克思主义的实践哲学不谋而合。行动者网络理论重视非人行动者的能动性,它主张科学研究或技术创新是人类和非人行动者共同建构的结果。用“行动者”“转译”等概念代替了传统公共政策分析中知识与权力的概念,为转基因作物政策过程分析提供了一种更为细致的综合分析视角。 由此,本文以行动者网络理论作为理论分析基础,并结合制度分析和发展框架(IAD),构建了“行动者—转译—政策共识”的转基因作物政策过程分析框架。公共政策过程向“行动者网络”建构的转变,一定程度上能够克服因为无法对政策制定者进行访谈获取一手资料而难以打开政策黑箱的难题。这一研究视角需要关注不同时期行动者网络的构成、行为和关系的稳定性。因此,首先需要根据政策演变的不同阶段,划分不同的时期和关键决策,然后以四个关键决策为案例,分析行动者、转译过程与转译效果。这一独特的研究视角和理论框架有助于理解我国转基因作物政策过程,拓宽了公共政策过程研究的理论视域。在构建并利用“行动者—转译—政策共识”框架进行转基因作物政策过程的实证分析过程中,本研究综合运用了比较分析法、案例分析法、政策文本计量分析法、访谈法、虚拟民族志等方法来分析我国转基因作物政策过程中行动情境、行动者、转译过程以及政策共识建构模式。本文在实证研究中进行了以下安排: 首先,针对转基因作物政策文本,运用社会网络分析法对各个阶段的主题热点和政策制定者进行定量分析,挖掘其在政策内容、政策目标、价值取向和政策工具方面的阶段特征。并从冲突的视角划分出四个时期,分别为:冲突预警期(1993—2000年)、冲突升级期(2001—2009年)、冲突调试期(2010—2016年)、冲突稳定期(2016—至今)。从社会行动的视角分析政策要素,并确定政策演变过程中的四个关键决策。 其次,通过分析行动者的特质,以“理念—利益”双重视角分析转基因作物政策过程中的行动者,分别以认知联盟和利益相关者的角度确定主要行动者。公众在政策过程中的角色并不是预设的,而是在实践中通过行动者之间的转译形成的。随着公民角色的演变,其诉求也在变化,进而会以不同的方式影响政府决策。 再次,转基因作物决策过程的实质是通过转译过程构建行动者网络,从而使核心行动者获得维持政策有效性、合法性的权力。转译过程也是政策共识的建构过程。主要使用“转译”这一核心概念,采用包括问题化、权益化、召募以及动员的转译四步分析法来对四个典型案例进行分析。根据政策过程中的协商程度和政策结果的共识程度,四个案例中的转基因作物政策共识模式呈现出四种演变类型:弱协商强共识、弱协商弱共识、强协商弱共识和强协商强共识。与之相对应的分别是科技治理、科普治理、分离治理和跨界治理四种知识治理类型。 最后,作为对转基因作物政策的实践回应,分析总结影响政策共识建构的三个主要因素:行动者之间竞争与冲突、转译路径模糊和风险规制规则的缺失。在此基础上提出政策共识建构应遵循知识共塑、利益共享和边界治理的基本原则,政府政策过程中的核心行动者,主要可以运用以下策略增进政策共识:加强竞争中的合作治理、编织更强大的行动者网络和丰富转基因传播的框架与修辞。

关键词： 光催化技术   基因工程菌   半胱氨酸脱硫酶   硫化镉   染料降解  

摘要： 废水中染料等污染物的存在是当前全球环境关注的问题,在废水排入水体之前,对这些污染物进行清除或降解是非常重要的。光催化技术可在光辐照下通过光催化剂将染料等有机物完全降解,在废水处理方面取得了显著的成就。以基因工程菌生物合成光催化剂可结合生物和无机纳米材料的优势,成为非常有前景的新型光催化剂。本论文基于经过基因工程改造的大肠杆菌(***)和希瓦氏菌(Shewanella oneidensis,SO)分别开发了两类生物基复合纳米光催化剂,以多功能CdS基纳米材料为出发点,表征材料的理化性质,并借助光催化降解染料的应用对这两类催化剂进行系统性研究。具体的研究工作如下:首先,利用具有过表达半胱氨酸脱硫酶的***作为生物模板,***通过分泌半胱氨酸脱硫酶将半胱氨酸(Cys)转化成S,以此吸附Cd在细菌表面形成尺寸均一的硫化镉纳米颗粒(CdS NPs)。实验探究了***合成CdS NPs的最佳方案,***在孵育16 h后合成了均匀分散的CdS NPs,自组装形成二元***/CdS杂化系统。为进一步提高***/CdS的光催化性,再次负载铂纳米颗粒(Pt NPs)作为助催化剂形成***/CdS/Pt三元复合光催化剂,结果表明***/CdS/Pt相较于***/CdS对染料具有更高效的光降解能力,研究还对***/CdS/Pt光催化剂的光降解机理进行了研究。其次,以基因工程希瓦氏菌(Shewanella oneidensis,SO)合成的SO/CdS生物无机纳米材料为载体设计了多组分、多功能的SO/CdS/ZnO生物无机复合纳米材料,通过多种表征手段证明了CdS和ZnO在SO表面的合成,光催化实验评价了SO/CdS、SO/CdS/ZnO等光催化材料的降解染料能力,并针对SO/CdS/ZnO材料的光降解动力学进行了研究。在SO/CdS/ZnO中ZnO NPs作为共催化剂与CdS NPs产生协同效应形成纳米异质,从而使该复合材料获得优异的光催化性能。

关键词： 切达奶酪   丁二酮   乙偶姻   共表达   基因工程  

摘要： 丁二酮和乙偶姻是赋予奶酪奶香味的关键香气化合物,靶向内源提升丁二酮和乙偶姻含量是当前奶酪增香研究的重要方向,但关于乳酸菌生物合成丁二酮和乙偶姻的关键基因及其影响机制尚不明晰。基于此,本课题以切达奶酪为研究对象,首先利用基因工程手段对干酪乳杆菌TCS进行多基因共同表达构建重组菌株,研究不同重组干酪乳杆菌的发酵性能;其次,研究添加重组干酪乳杆菌的切达奶酪在不同成熟时间下风味物质的变化,以及关键基因的变化与丁二酮和乙偶姻含量的相关性。论文的主要结论如下:(1)根据乳酸菌合成丁二酮和乙偶姻的代谢途径,在敲除干酪乳杆菌TCS中alsD基因的基础上串联共表达nox和alsS基因。经过菌落验证和测序比对验证结果,成功构建TCS-△alsD-nox-alsS重组干酪乳杆菌。对所得的共表达重组菌进行蛋白诱导表达,诱导后的NOX和ALS两条蛋白条带明显。对重组菌的NADH氧化酶和α-乙酰乳酸合成酶的酶活进行测定,发现重组菌中两种酶活都比原始菌株高,共表达改造效果明显。(2)选择10株重组干酪乳杆菌和原始TCS菌,比较这11株干酪乳杆菌添加到切达奶酪对相关指标的影响,包括耐酸耐盐性、产酸能力、自溶度的影响。结果发现,11株干酪乳杆菌在低酸高盐的环境下均能生长,其产酸水平都相对较低,自溶度范围在20.31%-41.48%之间,各项指标都达到附属发酵剂的水平,均可用于后续切达奶酪的发酵制备。添加了11株不同干酪乳杆菌的切达奶酪样品在成熟第1天、2周、4周、6周、8周、12周下,可溶性氮含量均随切达奶酪成熟时间增加而增加。同时对切达奶酪成熟的6个时间点取样,利用GC-MS(gas chromatography-massspectrometry)检测其丁二酮和乙偶姻含量情况。在奶酪成熟的前8周,添加了10株重组菌的切达奶酪中丁二酮含量均大于添加原始菌株TCS的切达奶酪中丁二酮含量。在奶酪成熟的前12周中,添加了10株重组菌的切达奶酪中乙偶姻含量均大于添加TCS的乙偶姻含量。添加TCS-△alsD、TCSCnox、TCS-△alsD-nox-alsS三株重组菌的切达奶酪样品中丁二酮和乙偶姻含量相对最高。(3)对不同重组干酪乳杆菌生产的切达奶酪中挥发性化合物进行分析,共检测出60种挥发性物质,酮类物质和酸类物质含量整体上保持逐步递增趋势。当切达奶酪成熟至第十二周时,添加*** TCS-△alsD-nox-alsS的切达奶酪中风味物质种类最多且总含量也最高。从基因表达的结果分析,添加11株干酪乳杆菌的切达奶酪中,nox和alsS基因的表达呈先递增后递减趋势变化,且在成熟第6周时基因表达量最高。其中添加*** TCS-△alsD重组菌的奶酪在成熟第6周时,nox和alsS表达量均达到最高。针对两种物质含量与基因表达水平之间的相关性,切达奶酪成熟过程中不同时间点下丁二酮含量与nox和alsS表达量均呈显著正相关,其中在奶酪成熟第2、4、6、8周时,丁二酮含量与nox基因表达量呈极显著正相关(p<0.01),且丁二酮含量与nox相关性比alsS更高。除奶酪成熟第6周时乙偶姻含量与alsS基因表达量呈负相关以外,其他成熟时间下乙偶姻含量与nox和alsS基因表达量均呈正相关。

关键词： 循环肿瘤DNA分析   深度测序   基于生物信息技术的背景消除   预后评估   化疗敏感性预测  

摘要： 背景:血浆循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)是由肿瘤细胞凋亡或坏死时所释放到外周血循环系统的DNA碎片,记载着肿瘤发生、发展、转移和复发等生物学过程。ctDNA检测是一种实时、非侵入的肿瘤检测技术,能够在癌症进展和治疗过程中提供诊断和预后信息,是组织活检的有效补充。然而,血浆ctDNA检测过程中面临着很高的背景噪音,尤其是潜在的良性突变,如克隆性造血来源的突变(clonal hematopoiesis variance,CHV),会导致检测结果具有较高的假阳性,限制着ctDNA检测精度的进一步提升。虽然并行白细胞(white blood cell,WBC)基因组测序能够有效抑制ctDNA检测中的CHV噪声,但是该技术也带来了更高的系统成本和更复杂的操作流程,难以广泛应用于临床环境。目的:针对当前基于ctDNA分析的液体活检技术所面临的背景噪音高、灵敏度低、成本高等难题,本课题旨在开发一种不依赖于并行WBC测序的ctDNA分析方法,以相对低的成本提升ctDNA检测的准确性和适用性,为ctDNA检测的临床应用打下基础。方法:(1)基于现有的ctDNA检测方法原理,设计能够富集突变信号的ctDNA捕获器Enricher-v1,并将其与肿瘤突变负荷(tumor mutation burden,TMB)这一预后评估方法相结合,形成了一种不依赖于并行WBC基因组测序的ctDNA分析(a Matched WBC Genome sequencing Independent Ct DNA Profiling,Ma GICPro)方法。通过组织活检样本评估Ma GICPro方法对多种癌症患者突变的捕获潜能和预后分类能力;基于液体活检样本验证Ma GICPro的捕获能力,并以化疗敏感性预测为代表,评估Ma GICPro在ctDNA分析基础上的患者预后分类能力。(2)分析ctDNA检测过程中面临的噪音,拟合全外显子范围的噪音分布,过滤掉ctDNA捕获器中的噪音,提高Enricher对ctDNA捕获的特异性(Enricherv2)。另一方面,基于ctDNA检测中假阳性过高的现象,开发一种新的预后评估方法——关键突变外显子的数目(number of key mutated exons,KME),根据突变特征和分布特点去除潜在的假阳性突变,提高ctDNA对患者预后分析的精度。而后,基于组织活检样本或液体活检样本比较Ma GICPro-Plus(Enricher-v2捕获和KME分析)和其他方法对患者预后分类能力强弱。结果:Enricher-v1实现了对训练数据集中患者的97.7%的捕获率,并且在多种癌症中体现出较好的捕获性能。Ma GICPro方法对组织活检样本体现出了较好的患者预后分类能力,并能够根据患者第一周期化疗前后的液体活检样本预测患者第二周期化疗的疗效(曲线下面积(area under the curve,AUC)=0.773)。在根据背景噪音来源特征优化Ma GICPro方法后,Ma GICPro-Plus方法能够基于组织活检样本对多种癌症患者实施精准的分类,特别是在全球十大致死癌症中,表现出了比Ma GICPro更加优越的分类性能。同样地,Ma GICPro-Plus方法可以仅依靠第一次化疗后的液体活检样本实现对患者化疗敏感性的预测(AUC=0.833),并且如果采用第一周期化疗前后的样本,Ma GICPro-Plus体现出更加优异的化疗敏感性预测能力(AUC=0.94)。结论:我们基于数据挖掘技术,开发了一种不依赖于并行WBC基因组测序的ctDNA分析(Ma GICPro)方法。该方法基于杂交捕获深度测序技术检测ctDNA,依托生物信息技术抑制和消除检测过程中的背景噪音,能够从大量的cf DNA背景中更加灵敏地检测到ctDNA所携带的肿瘤来源的突变信息,并开发了比b TMB更加优异的预后评估方法KME,实现了对癌症患者更加精准的预后分类。作为一种概念方法的证明,当分析组织或液体活检样本时,Ma GICPro方法能够对多种癌症患者进行分类、预测预后和化疗敏感性。我们预计,这种新方法具有在多种临床癌症中检测ctDNA的潜在用途,从而促进肿瘤的精准治疗。

关键词： 高原型牦牛   硬脂酰辅酶A去饱和酶基因(SCD)   DNA测序   生长性状  

摘要： 硬脂酰辅酶A去饱和酶（stearyl-CoA desaturase,SCD）是牦牛（Bos grunniens）体内单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acid,MUFA）生物合成的关键酶，对脂质合成和氧化的动态平衡调节过程有着重要的作用。为探索青海高原型牦牛SCD基因多态性及其与生长性状的关联性，通过DNA测序法进行基因的多态性分析，应用连锁不平衡分析和一般线性模型（general linear model,GLM）进行关联性分析。结果表明，SCD基因第3内含子上存在2个SNP （g.6614C>A和g.6660C>T），其中g.6614C>A上存在2种基因型，g.6660C>T上存在3种基因型；χ2检验表明，g.6614C>A处于哈代温伯格（Hardy-Weinberg）平衡状态，g.6660C>T处于不平衡状态，且g.6614C>A为低度多态（PIC<0.25）,g.6660C>T为中度多态（0.50>PIC>0.25）。与生长性状关联性分析发现，g.6614C>A位点上CA基因型的体重、体高、体斜长和管围显著高于CC基因型（P<0.05），而胸围与CC基因型差异不显著。g.6660C>T位点上TT基因型个体的体长与CT和CC基因型差异不显著，体重、体高和胸围显著高于CC和CT基因型（P<0.05），管围极显著高于CC基因型（P<0.01）。单倍型和连锁不平衡分析发现2个位点存在4种单倍型，位点间不存在强连锁性（r2=0.027）。组合单倍型分析发现，H1H3为最优组合单倍型。综上，SCD基因多态性与青海高原型牦牛的部分生长性状相关，可作为牦牛分子标记辅助选择的候选基因，本研究为提高牦牛选种效率提供参考。

关键词： L-苯丙氨酸   大肠杆菌   菌种改造   发酵过程优化   载氧剂   表面活性剂  

摘要： L-苯丙氨酸是8种必需氨基酸之一,在医药、食品、化工等领域应用广泛,其需求量逐年上升,因此利用代谢工程手段与发酵工程手段挖掘菌株的生产潜力,得到高产、高效的苯丙氨酸生产菌及其配套的生产工艺具有重要的现实意义。本文利用代谢工程手段对一株野生型*** W3110进行改造,并对改造后的菌株进行发酵工艺优化,主要研究内容如下:在大肠杆菌中系统优化了苯丙氨酸的合成途径,包括:解除DAHP合酶、预苯酸脱水酶（PDT）、分支酸变位酶（CM）、莽草酸途径的反馈抑制;强化关键酶活;提高前体物在磷酸烯醇式丙酮酸与4-磷酸赤藓糖供应量;改造PTS系统;加强苯丙氨酸输出能力。最终得到了菌株F13,摇瓶发酵36 h后,产量为24.8 g/L,转化率达到18.7%。针对分子改造造成的生物量下降的问题,研究了维生素H对苯丙氨酸发酵的影响,结果显示适量添加0.5 mg/L的维生素H使得苯丙氨酸的产量达到了70.6 g/L,较不添加对照组提高了9.6%,最大生物量(OD600 nm)为140.5,较对照组提高了11.4%,糖酸转化率为24.7,较对照组下降了2.3%,说明适量添加维生素H具有两面性。通过单因素实验、正交实验、发酵罐验证实验,以关键酶活、产量、转化率、副产物含量等为指标,最终确定了适合L-苯丙氨酸发酵的9种微量元素为及用量。最终优化后生物量为122.8,L-苯丙氨酸产量为85.4 g/L,糖酸转化率为26.3%,分别较不添加微量元素的对照组提高了17.5%、51.4%、18.6%,同时减少了副产物的种类和生成量,提高了关键酶活力。为了提高菌体对氧的利用效率,研究了不同载氧剂对苯丙氨酸发酵生产的影响,结果显示:15%添加量的正十二烷使得比耗氧速率提高了37.0%,摄氧率提高了38.1%,苯丙氨酸产量提高了1.6%,空气氧临界浓度降低了33%,发酵周期缩短了4 h,可回收率为95.5%,循环次数为5次。载氧剂使得对设备的搅拌转速、通风量、罐压的要求减弱,降低了发酵控制难度,同时缩短了发酵周期,节约了发酵成本。优化了补料方式,提出了营养适量流加工艺,苯丙氨酸产量达到了90.7 g/L,糖酸转化率达到了26.7%,同时减少了副产物的积累,通过代谢流分析该策略使得葡萄糖更多的流向了苯丙氨酸的合成途经。使用表面活性剂解决了苯丙氨酸结晶前夕产酸停滞的问题,最终的产量为88.7g/L,较不使用表面活性剂的对照组提升了8.9%,且添加表面活性剂不会对生物量造成影响,同样不会导致副产物的积累,是一种安全、高效的方法。通过代谢工程手段与发酵工程手段相结合,在不同的方面对菌株自身及其生长环境做出合理的优化,最终实现了苯丙氨酸的高效积累。

关键词： 光合作用   PSⅡ超级复合体   D1蛋白   CtpA  

摘要： 光合作用被诺奖组委会称作是“地球上最重要的化学反应”,它是指光合生物利用太阳能将无机物CO2转化为有机物并生产O2的过程。光合作用分为在类囊体膜上进行的光反应和在叶绿体基质中进行的暗反应两部分。维持光反应顺利进行主要是依靠类囊体膜上的四大多亚基光复合体,分别是光系统Ⅱ（Photosystem Ⅱ,PSⅡ）、细胞色素b6f（Cytochrome b6f,Cytb6f）、光系统I（Photosystem I,PSI）和ATP合酶（ATP synthase,ATPase）。在PSⅡ超级复合体上主要发生的是H2O的裂解生成O2和H+。D1蛋白作为PSⅡ超级复合体的核心蛋白,由叶绿体基因psb A编码,以前体的形式p D1插入到类囊体膜上。p D1蛋白C端含有8-16个氨基酸短肽,需要由核基因编码的CtpA蛋白酶进入类囊体腔,对其碳端进行剪切进而才能形成成熟的D1蛋白进行PSⅡ的组装。Ctp（Carboxy-terminal processing protease）家族有三个同源蛋白分别是CtpA、Ctp B和Ctp C,在高等植物中只有CtpA具有切割D1蛋白C端短肽的能力。Alpha-Fold是2021年7月由Deep-Mind公司开发的人工智能解析蛋白结构的在线软件,该在线网站能够精准预测单个蛋白质三级结构。因此我们本篇论文解决的第一个问题就是利用Alpha-Fold在线预测软件对CtpA、Ctp B和Ctp C的三级结构进行预测后分析为什么在Ctp家族中只有CtpA具有切割D1蛋白C端短肽可能存在的原因。在斜生栅藻（Scenedesmus obliquus 6803）中对CtpA的晶体结构进行解析发现CtpA蛋白是一个由A、B、C三个结构域构成的丝氨酸类蛋白酶,其中在A结构域上有五个碱性氨基酸形成的簇可能与膜上或者反应中心的负电荷相互作用帮助D1蛋白的成熟。我们想探讨斜生栅藻CtpA上A结构域上的五个碱性氨基酸对应在拟南芥CtpA里究竟发挥怎样的功能,这是本篇论文要解决的第二个问题。我们利用Alpha-Fold对拟南芥CtpA、Ctp B和Ctp C的三级结构进行解析后发现拟南芥CtpA的结构与之前报道的斜生栅藻中CtpA的结构一致,为A、B、C三个结构域构成的空间结构。同样的Ctp B和Ctp C也是由类似的A、B、C三个结构域组成,但是其结构更加的松散,这可能影响他们与D1蛋白C端的结合,从而无法对D1蛋白的成熟发挥功能。另外CtpA在与D1蛋白C端短肽结合上极具专一性,酶的活性位点恰好与底物的切割位点结合进而实现D1蛋白的成熟。CtpA在切割D1蛋白C端短肽具有专一性,假定拟南芥CtpA的A结构域上的五个保守氨基酸形成的簇与底物或者酶之间由于电荷性质存在相互作用,我们利用点突变的方式将这个几个氨基酸突变成电荷性质相反的氨基酸,打破这种相互作用进而探究这五个氨基酸在D1蛋白成熟过程中的作用。所以我们利用PCR技术构建了CtpA点突变体,在体外对CtpA及CtpA点突变体蛋白进行原核表达纯化后进行体外酶活测定实验,检测其切割p D1蛋白C端短肽的效率。为了验证体外酶活性实验的结果,我们将CtpA及CtpA点突变体构建到双元表达载体p RI101-AN上,通过农杆菌介导转化拟南芥纯合突变体atctpa中。通过转基因植物的表型观察以及转基因植物体内D1蛋白的存在形式进而判断CtpA上五个碱性氨基酸在拟南芥中对于D1蛋白成熟过程中的作用。D1蛋白在类囊体腔侧有两个Loop区,AB Loop和CD Loop,以及一个C末端短肽,我们想探究CtpA在对C端剪切时是否与AB Loop、CD Loop发生相互作用,如果有相互作用,那么这五个碱性氨基酸突变后对这个相互作用是否有影响。酵母双杂交技术是探究两个蛋白之间是否存在相互作用的分子生物学手段,所以我们利用该技术对CtpA及CtpA EEEEE与D1蛋白AB Loop、CD Loop和C端的相互作用进行分析。对以上实验的结果分析可知拟南芥CtpA上五个碱性氨基酸对CtpA构象维持、酶活最适p H环境有很重要的作用。这五个碱性氨基酸形成的簇可能与类囊体膜上或者PSⅡ反应中心的负电荷相互作用帮助D1蛋白成熟,他们的突变会影响CtpA与D1蛋白AB Loop和C端相互作用。我们的工作为PSⅡ超级复合体中核心亚基D1蛋白的成熟提供了一定的理论基础。

关键词： 甘蔗   遗传转化   生物逆境   遗传转化效率   基因表达水平   基因编辑   安全性  

摘要： 甘蔗(Saccharum spp. complex)是禾本科的主要物种和重要经济作物，对世界农业经济发展和保障供应食糖发挥重要作用。一方面，甘蔗具有较好的抗、耐逆性，但其生产和生产力依然被多种生物和非生物逆境所制约。另一方面，商业栽培种在生产上一般不开花，即便开花种子基本也是败育的，加上甘蔗产品蔗糖为碳水化合物，不含蛋白成分，因此，甘蔗属于转基因安全风险等级最低(I级)的作物之一。再则，甘蔗为无性繁殖作物，优异的转基因单株可通过组织培养快速扩大群体。鉴于此，基因工程成为甘蔗弥补传统杂交育种性状缺陷和加快遗传改良进程的重要手段。本文在阐述为什么甘蔗是适合进行转基因改良物种的基础上，重点回顾抗虫性和抗病性改良成就，简要回顾其他性状及甘蔗作为生物反应器的工作，评述了影响甘蔗遗传转化效率与外源目的基因表达水平的因素，探讨基因编辑技术在甘蔗上的应用以及转基因甘蔗安全性评价与商业应用情况，最后展望该技术领域的未来，以期推动和促进基因工程在甘蔗遗传改良中的应用。

关键词： 红斑丹毒丝菌   流行病学   MLST   毒力   耐药性   耐药基因   比较基因组学   亚单位疫苗  

摘要： 红斑丹毒丝菌可感染动物导致动物的丹毒病,也可感染人导致类丹毒。猪丹毒是一种严重影响中国养猪业的细菌性传染病,上世纪猪丹毒曾在我国养猪业中肆虐,后来我国在猪场中广泛使用猪丹毒相关疫苗,有效防止了该病的传播和蔓延,但是进行本世纪,猪丹毒在我国规模化猪场屡有发生,给我国的猪生产业带来了严重的损失。抗生素的广泛使用对养猪业疾病的防控起到了重要作用,但近年来抗生素的滥用问题愈加突出,直接导致了临床上大量耐药细菌的产生,而且抗生素药物残留也使我国食品安全问题面临重大挑战,因此采用疫苗免疫是预防猪丹毒的最佳方式。目前我国预防猪丹毒所用疫苗包括传统的灭活苗和活疫苗,这些传统疫苗虽在预防和控制传染病过程中起到了重要的作用,然而全菌疫苗中存在的大量无效成份既可引起严重的副反应,又会引起过多无意义的非特异性免疫应答,浪费机体的免疫潜力,不利于疫病的防控,同时活疫苗也存在着毒力返强的风险。因此,对近年来中国分离红斑丹毒丝菌进行分离和鉴定,可以进一步了解当前流行菌株的流行特征,创制新型的猪丹毒基因工程亚单位疫苗,可以为防控猪丹毒的流行提供更加丰富的手段。本研究所获的研究成果主要有:1.红斑丹毒丝菌分离鉴定本研究以2012年至2018年从中国15省分离的120株红斑丹毒丝菌作为研究对象,对7个管家基因进行扩增测序,从而鉴定分离株的MLST序列型,结果表明:120株临床分离株共分为3个序列型,分别是ST48、ST73和ST74,ST48是主要的序列型。从每个序列型分别随机选取5株细菌进行小鼠毒力检测,结果表明,ST48型菌株的毒力显著强于其它序列型菌株。利用微量稀释法检测7种抗生素对120株分离株的最低抑菌浓度,耐药率分析结果显示:红斑丹毒丝菌对四环素类抗生素(四环素)、大环内酯类抗生素(红霉素)、林可酰胺类抗生素(克林霉素)和喹诺酮类抗生素(环丙沙星和恩诺沙星)高度耐受,对β-内酰胺类抗生素(美罗培南和头孢噻肟)高度敏感。耐药谱分析结果显示:同时耐受环丙沙星、恩诺沙星、克林霉素、四环素和红霉素等5种抗生素的菌株分离率最高,达到44.2%。6株红斑丹毒丝菌的基因组测序结果表明:6个基因组序列大小为1766Kb-1932Kb,预测的编码序列数量为1661-1840个,将6个基因组序列的单拷贝同源基因聚类分析,构建系统发育树,结果表明:敏感菌株SE-RD株处在一个独立的进化分支上。对测序基因组进行比较基因组分析,从红霉素耐药菌株的基因组发现疑似的红霉素耐药基因Erm A-like,该基因首次发现于红霉素耐药菌株中,该基因转化大肠杆菌C600株,使红霉素对大肠杆菌的最低抑菌浓度提高了至少4倍。此外,在喹诺酮类抗生素(环丙沙星和恩诺沙星)耐药菌株的gyr A和par C基因的喹诺酮耐药决定区中发现3个疑似的喹诺酮耐药突变gyr A86T-I,gyr A90D-N和par C81S-I,携带86T-I突变的gyr A基因和携带81S-I突变的par C基因分别转化大肠杆菌C600株,使恩诺沙星对大肠杆菌的最低抑菌浓度分别提高了至少2倍。扩增新发现的红霉素耐药基因Erm(A)-like和已报道的耐药基因Erm(T),结果显示:在64株红霉素耐药株中都检测到了Erm(A)-like耐药基因,在56株红霉素敏感株中都未检测到Erm(A)-like耐药基因;在所有120株细菌中都未检测到耐药基因Erm(T),结果表明:耐药基因Erm(A)-like广泛存在于红霉素耐药株中,是红斑丹毒丝菌耐受红霉素的主要耐药基因。对已被报道的四环素耐药基因tet(M)和克林霉素耐药基因lsa(E)进行PCR扩增鉴定,结果表明:四环素耐药基因tet(M)的检出率为37.5%(45/120),克林霉素耐药基因lsa(E)的检出率为59.2%(71/120),结果表明:耐药基因tet(M)和lsa(E)广泛存在于红斑丹毒丝菌临床分离株中。2.猪丹毒基因工程亚单位疫苗的研制本实验室前期发掘并验证了Spa A蛋白是红斑丹毒丝菌重要的免疫原性蛋白,本研究用表达红斑丹毒丝菌Spa A基因的重组大肠杆菌BL21-Spa A株作菌种,在GMP车间试制了10批猪丹毒基因工程亚单位疫苗,对仔猪进行单剂量、单剂量重复和超剂量免疫以验证疫苗的安全性,对仔猪进行攻毒保护试验以验证疫苗的效力,同时开展最小免疫剂量的研究,制备了红斑丹毒丝菌ELISA抗体检测试剂盒用于疫苗免疫抗体的检测,并优化了抗原纯化工艺。试验表明:猪丹毒基因工程亚单位疫苗安全有效、质量可控。