关键词：
L-谷氨酰胺
NH4+限制发酵工艺
全营养流加
氮调控系统
谷氨酸棒杆菌
摘要：
L-谷氨酰胺是L-谷氨酸的γ羧基酰胺化的一种中性氨基酸,是构成生物体蛋白质的20种基本氨基酸之一。L-谷氨酰胺在维持人体机能和生命活动方面具有重要作用,其在人体内含量非常高,占人体游离氨基酸的61%。近年来,随着对L-谷氨酰胺的深入研究,L-谷氨酰胺被广泛应用于医药,保健食品,饲料等领域。目前,L-谷氨酰胺发酵的主要问题包括:发酵副产物谷氨酸含量偏高,谷氨酰胺产量低,关键酶谷氨酰胺合成酶的活性弱,生物素亚适量工艺培养基不稳定,发酵后期菌体活力和产酸效率下降严重,糖酸转化率低。本课题通过理性代谢工程改造和发酵工艺优化来解决上述问题。以谷氨酰胺生产菌GM34为出发菌株,优化了谷氨酸棒杆菌的GS-GOGAT途径:敲除谷氨酸合酶基因NCgl0181、NCgl0182和谷氨酰胺酶基因NCgl2395、NCgl2500,在基因组NCgl0182和NCgl2500位点上分别整合了一拷贝的来自枯草芽孢杆菌的谷氨酰胺合成酶基因gln Absu和一拷贝的来自嗜酸乳杆菌的谷氨酰胺合成酶基因gln Alcb;进一步的,使用带有tuf强启动子的p XT01质粒分别过表达了gln Absu和gln Alcb。构建得到菌株G-6的谷氨酰胺产量比原菌GM34提高了41.9%,达到68.4 g/L,谷氨酸含量降低了56.9%,达到13.1 g/L,糖酸转化率提高了6.6%,达到37.1%。以菌株G-6为出发菌株,优化谷氨酸棒杆菌的氮调控系统,敲除谷氨酸棒杆菌的氮调控全局阻遏因子amtr、谷氨酰胺合成酶腺苷转移酶基因gln E,并强化了谷氨酸棒杆菌中的两个铵转运蛋白基因amt和amtb。构建菌株G-11,谷氨酰胺产量达到80.3 g/L,谷氨酸含量达到10.6 g/L,糖酸转化率达到38.3%。菌株G-11为本课题构建的谷氨酰胺生产能力最强菌株,具有工业化潜力。传统生物素亚适量工艺使用的玉米浆生物素含量不确定,会导致各批次发酵结果不稳定,为解决这个问题,探究了生物素的添加方式对谷氨酰胺发酵的影响。通过在种子培养基中添加40 m L/L豆浓和25μg/LVH,在发酵培养基中添加50m L/L豆浓和4μg/LVH代替传统生物素亚适量工艺的玉米浆成分,得到了一种新型的谷氨酰胺发酵培养基,使谷氨酰胺产量提高至48.2 g/L,谷氨酸含量降低至30.4 g/L,糖酸转化率提高到32.5%。NH4+是谷氨酰胺发酵中的关键因素,谷氨酸经谷氨酰胺合成酶催化生成谷氨酰胺需要NH4+,但高浓度的NH4+会影响菌体生长并降低谷氨酰胺合成酶活性。在低浓度NH4+条件下,谷氨酰胺合成酶活性处在高水平,但是NH4+浓度过低,会减少谷氨酰胺生成。为解决谷氨酰胺发酵发酵过程中NH4+用量的矛盾,提高谷氨酰胺合成酶活性,设计一种NH4+限制发酵工艺,探究NH4+浓度对谷氨酰胺发酵的影响并对NH4+浓度进行调控。发酵前期添加2 g/L尿素,当尿素被耗尽,p H在3 h左右回落至中性,开始使用25%的氨水调节p H,并同时开始梯度流加（NH4）2SO4至发酵结束。有效提高了谷氨酰胺合成酶活性并使谷氨酰胺产量提高了12.8%,达到90.6 g/L,谷氨酸含量降低了32.3%,达到6.7 g/L,糖酸转化率提高了3.8%,达到40.9%。针对发酵后期产酸效率下降,菌体衰亡老化的问题,设计了全营养流加发酵工艺并探究了流加甜菜碱和氯化胆碱对谷氨酰胺发酵影响。将发酵培养基按4∶6分成发酵初始培养基和发酵流加培养基;将3 g/L甜菜碱和2 g/L氯化胆碱添加到葡萄糖糖液内随着葡萄糖的流加补充。使用最佳的全营养流加策略以及甜菜碱和氯化胆碱的流加策略,谷氨酰胺产量提高了2.9%,达到96.3 g/L,谷氨酸含量降低了22.4%,达到5.2 g/L,糖酸转化率提高了0.7%,达到41.6%。本课题以谷氨酰胺生产菌GM34为出发菌株,构建出一株谷氨酰胺生产能力最强的菌株G-11,并对谷氨酰胺发酵工艺进行优化。最终的谷氨酰胺产量达到96.3 g/L,谷氨酸含量5.2 g/L,糖酸转化率41.6%。
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