教学课程资源库 更多>>

关键词： 人类胚胎干细胞研究   伦理风险   法律监管  

摘要： 干细胞研究是生物医药产业的热门方向,也是再生医疗技术的研究重点,作为干细胞研究的重要方向之一,人类胚胎干细胞因自身较成体干细胞更强的分化能力,在疑难病症治疗方面广阔的应用价值在全世界范围被研究者所青睐。但伴随着人类胚胎干细胞研究的技术过程也产生了一系列挑战人的尊严和价值的伦理争议,一是作为人类生命早期存在形式的胚胎作为医学研究对象带来的伦理及法律正当性问题;二是基于研究过程产生的超时限研究、人兽嵌合体胚胎、人兽杂交、生殖性克隆、基因编辑婴儿等伦理风险。因此有必要将人类胚胎干细胞研究纳入法律监管范围,有效防范研究中的伦理风险,在推动医学研究进步的同时维护人的价值与尊严。然而从制度依据、监管主体和监管模式三方面考察我国人类胚胎干细胞研究的法律监管现状可发现,现有的制度供给与研究的快速发展之间存在矛盾,具体规定分散、笼统不利于适用,责任追究机制缺漏较多,监管主体多头交叉存在监管漏洞,临床研究备案审核监管模式的一般程序设计对人类胚胎干细胞临床研究伦理风险防范缺乏针对性,国家和省的事中、事后监管不到位,2018年“贺建奎基因编辑婴儿”事件发生就是上述一系列漏洞与问题的集中反映。因此需要从完善法律依据,补足监管内容和追责机制,建立监管主体之间有效的分工协作机制,设置临床研究备案审核模式下人类胚胎干细胞临床研究特别审核程序,配套更加完善的国家、省级监管措施等方面入手,完善我国人类胚胎干细胞研究法律监管,规范人类胚胎干细胞研究行为,有效防范研究风险,推动医学技术进步,造福人民健康。

关键词： 尼帕病毒   DNA疫苗   非复制型痘苗病毒载体疫苗   亚单位疫苗   体液免疫   细胞免疫  

摘要： 背景尼帕病毒(Ni V)是一种人畜共患病毒,通过对尼帕病毒基因组的分析,尼帕病毒属于单股负链RNA病毒目、副粘病毒科。与副粘病毒科中的其他成员相比,Ni V基因组与亨德拉病毒(He V)基因组同源性很高,因此二者被划为亨尼帕病毒属(Genus Henipavirus)。近年来又新发现了三种亨尼帕病毒,分别是雪松病毒(Ced V),加纳病毒(GHV)和墨江病毒(Moj V)。1998-1999年,全球首次暴发尼帕病毒疫情,当次疫情造成马来西亚当地百万头猪被扑杀,百余人感染死亡,病死率达48%。自被发现以来,尼帕病毒和亨德拉病毒多次在亚太地区局部暴发。该病毒于2018年被“世界卫生组织(WHO)研发蓝图”列为“可致严重国际暴发”的重点疾病之一,在生物安全等级上属于最危险的第四级。疫苗是预防病毒导致的传染性疾病的有力手段,目前已经有多种尼帕病毒的疫苗处于研究阶段,包括重组蛋白疫苗、水疱性口炎病毒载体疫苗、麻疹病毒载体疫苗、痘病毒载体疫苗等,但没有人用疫苗被批准上市。研究目的本研究构建表达尼帕病毒融合蛋白(F)和附着蛋白(G)的非复制型痘苗载体疫苗、亚单位疫苗,在BALB/c小鼠模型上采用不同免疫策略评价其诱导的特异性体液免疫和细胞免疫应答,为发展我国尼帕病毒基因工程疫苗的研发和应用提供科学参考和技术支持。研究方法与结果一、尼帕病毒非复制型痘苗病毒载体疫苗与亚单位疫苗的构建与表达鉴定含有靶抗原的质粒pc DNA3.1-F、pc DNA3.1-G,其表达尼帕病毒马来西亚株的融合蛋白(F)和附着蛋白(G),且序列经哺乳动物密码子偏好进行优化。通过设计引物将靶抗原通过PCR扩增以获得目的基因片段,将目的基因片段插入重组专用质粒p JSC1175-Lacz上,在鸡胚成纤维细胞中与NTV进行同源重组,通过蓝白斑筛选纯化重组的非复制型痘苗病毒疫苗(NTV-F、NTVG),通过免疫印迹法验证其成功表达F蛋白和G蛋白。为了获得可溶性的Ni V F蛋和G蛋白,我们首先删除F蛋白和G蛋白的膜锚定区域,以使其有效的分泌到细胞外。保留Ni V F蛋白1-488氨基酸序列,并且为了让其稳定在融合前构象,我们进行了氨基酸位点的突变,为了增加其免疫原性,在第488aa残基后加三聚域(TD)以形成三聚体,Ni V G蛋白为II型跨膜蛋白,其N端位于膜内,所以保留其172-602位氨基酸,均在C端添加6×His标签后插入真核表达质粒,以使用镍柱亲和层析对其进行纯化。通过SDS-PAGE及Western blot鉴定,得到了纯度≥90%的可溶性的F蛋白和G蛋白,即s F、s G,拟作为亚单位疫苗备用。二、DNA疫苗、NTV疫苗免疫诱导特异性免疫应答选取6-8周龄BABL/c小鼠进行免疫,评价疫苗诱导的特异性体液免疫应答。运用ELISA检测小鼠血清中特异性Ig G抗体,构建基于HIV的尼帕假病毒建立可在生物安全二级实验室(BSL-2)开展的Ni V中和抗体检测。结果显示,pc DNA3.1-F、pc DNA3.1-G、NTV-F、NTV-G在进行同源和异源疫苗免疫以及两种抗原联合免疫方案时均诱导了较高滴度的特异性Ig G抗体,其中DNA-NTV免疫方案诱导的Ig G抗体最高,并且各免疫组诱导的抗体能够中和HIV-Ni V假病毒,其中pc DNA3.1-G+NTV-G免疫组诱导产生了最高的中和抗体滴度,F+G抗原的联合免疫诱导的中和抗体滴度比单抗原免疫组要高。于此同时,我们对疫苗诱导产生的特异性细胞免疫反应进行了评估。在加强免疫后两周,处死小鼠分离脾细胞,运用ELISPOT实验检测其IFN-γ分泌情况。结果表明:疫苗在小鼠体内诱导了较强的CD8+T细胞免疫应答,其中DNA-NTV免疫组诱导的T细胞免疫应答较其他组强,具有显著性差异。三、筛选Ni V-F、Ni V-G特异性H-2d限制的T细胞表位设计并合成覆盖Ni V-G全长的119条多肽,Ni V-F全长的108条多肽(前后肽重叠10个氨基酸,以5个氨基酸向前步进,每条肽段包含15个氨基酸序列),取各免疫组加强免疫的小鼠的脾细胞,以矩阵设计的Ni V-G、Ni V-F肽池为刺激物,运用ELISpot检测G蛋白和F蛋白特异的优势肽,通过矩阵分析确定刺激活性强的CTL表位肽,F蛋白筛选到了12条优势肽,其中刺激活性最强的是F56(IIVRVYFPILTEIQQ),G筛选到了12条优势肽,其中刺激活性最强的是G72(IKQGDTLYFPAVGFL)、G73(TLYFPAVGFLVRTEF)。四、重组亚单位疫苗的免疫原性研究选取6-8周龄BABL/c小鼠进行免疫,评价重组蛋白s F、s G配合不同佐剂诱导的免疫应答。运用ELISA检测小鼠血清中的特异性Ig G抗体,进行微量中和实验检测免疫后诱导的中和抗体水平,利用ELISPOT实

关键词： 七氟醚   胚胎干细胞   嵌合小鼠   神经毒性   神经诱导   细胞迁移  

摘要： 美国每年约有150万新生儿和婴幼儿接受全身麻醉[1],我国庞大的人口数量也使得婴幼儿对麻醉手术的需求量迅速增加。大量报道指出,全身麻醉会影响啮齿类动物和非人灵长类动物的神经系统发育并诱导远期认知功能障碍[2-4]。美国FDA在2016年发出警告:3岁以下儿童或孕晚期妇女反复或长期使用全麻药物可能会影响婴幼儿的大脑发育[5]。但随后若干大型临床研究表明,人类婴幼儿暴露于全身麻醉药物后似乎并没有引起远期学习记忆能力的明显变化[6-8]。迥然不同的研究结果导致迄今为止全麻药物是否会引起发育期神经发育异常还处在争议之中[9,10]。而争议的存在会延误本可在儿童中开展的保护措施,从而导致一系列严重后果。七氟醚（Sevoflurane,Sev）是临床上应用最广泛的小儿吸入麻醉药之一。包括我们前期报道在内[11]的很多动物研究结果都表明,新生儿期反复[12]或长期[13]暴露于七氟醚可导致多种神经毒性,如凋亡、氧化应激、神经发生障碍、突触损伤和炎症反应[14-19]。在人类相关研究中,一些报道指出发育期儿童经历七氟醚暴露对长期学习能力和智力发育没有显著影响[7,20],而另一些报告则指出发育早期接受七氟醚暴露后,学习和记忆能力受损[21,22]。由于麻醉药物使用的特殊性,大多数人类麻醉神经毒性研究都是回顾性的,导致发育期七氟醚对人类患者的神经毒性作用一直无法盖棺定论。鉴于临床研究的限制性,越来越多的专家学者意识到基础研究向临床转化的重要性[23,24]。在麻醉神经毒性研究中,因为直接将非人类动物的实验数据结果转化为临床依据存在太多不确定因素[25],所以直接采用人类细胞或组织,而非其他动物的模型,进行麻醉药物神经毒性研究具有非常重要的意义。为了进一步研究和明确七氟醚对于人神经细胞的毒性作用,本课题利用人胚胎干细胞技术,从体外和体内两个角度,研究了七氟醚暴露对人神经前体细胞的毒性效应。本研究由以下四部分实验组成。第一部分:人神经前体细胞的诱导分化及人神经前体细胞嵌合小鼠的构建目的:从体内、体外两个方向,建立可用于研究麻醉暴露对人神经细胞神经毒性效应的技术方法;方法:用m Te SR培养基在无饲养层条件下维持培养人胚胎干细胞,在体外通过14天双SMAD抑制剂的使用,诱导胚胎干细胞分化为神经前体细胞,并用免疫荧光和Western Blot等方法评估神经前体细胞的诱导效率;体内研究方面,将神经前体细胞注射到免疫缺陷的Nod Scid小鼠中,得到人神经细胞嵌合小鼠,结合荧光示踪和免疫荧光染色的方法观察人神经前体细胞在小鼠脑内的分布和分化情况。结果:（1）维持培养条件下,人胚胎干细胞系H9和稳定表达GFP的人胚胎干细胞系H8生长状态良好,类胚体形成效率较高。神经诱导14天后,80%以上的人胚胎干细胞表达Pax6,Nestin和Sox2,而胚胎干细胞标记蛋白OCT4的阳性率降至13%。诱导28天后,80%以上为Tuj-1阳性,VGLUT2阳性,Ca MKII阳性的兴奋性神经元。电生理结果显示,随着诱导的时间的延长,人神经元的动作电位越趋于成熟,时间-功能轴符合人神经细胞的发育规律。（2）成功将神经前体细胞移植到新生免疫缺陷Nod Scid小鼠中,人神经前体细胞在小鼠脑内整合、迁移并分化为神经元,嵌合小鼠成年后人神经元广泛分布于小鼠皮层和海马等各个脑区。结论:成功建立人神经前体细胞诱导技术和人神经前体细胞嵌合小鼠模型,可用于体外、体内麻醉药的效应研究。第二部分:研究七氟醚在体外对人神经细胞的毒性效应目的:在体外研究七氟醚对人神经前体细胞的毒性效应,确定人神经前体细胞对七氟醚敏感的分化阶段。方法:在体外对不同分化阶段的神经前体细胞进行七氟醚暴露（4.1%七氟醚,6小时）,采用TUNEL和PI染色分别检测凋亡和坏死的细胞;采用免疫荧光化学染色和Western Blot等方法,观察七氟醚对不同发育阶段神经前体细胞分化的影响。找到七氟醚暴露产生神经毒性的关键时间窗口后,采用免疫组化和Western Blot的方法研究七氟醚暴露对人神经元突触发育的影响,用形态学方法观察七氟醚暴露对人神经前体细胞迁移能力的影响,结合高通量测序、Western Blot、RT-PCT等方法推测七氟醚暴露损伤神经前体细胞迁移的分子机制。结果:（1）在神经前体细胞初期阶段,4.1%的七氟醚暴露未显著引起人神经干细胞的凋亡和坏死,也未显著影响神经前体细胞向神经元方向的分化。（2）与对照组相比,七氟醚暴露对神经前体细胞凋亡坏死和增殖没有显著影响,但实验组人神经前体细胞分化为神经元的数量明显减少,神经元标记蛋白Tuj-1、Ca MKII的表达水平显著减少,突触相关蛋白PSD-95表达减少,人神经前体细胞的迁移数量和距离显著降低。转录组测序结果提示细胞分化和迁移相关基因改变明显,与迁移密切相关的非

关键词： 植物修复   转基因油菜   环境安全性评价   田间漂移  

摘要： 土壤重金属污染是全球性问题,严重影响人类健康、作物产量和生态安全。植物修复是一种环境友好的土壤修复技术,可以改善土壤中重金属污染。植物修复中的植物提取-植物吸收重金属并将其运输到植物的组织中的地上部分-是减少土壤中重金属总量的最环保的方法,具有广泛的应用前景。超富集植物或具有生物质的高吸附转基因植物是植物提取的重要生物材料。近年来进行的植物修复的科学努力和实践表明,通过针对HMA及Nramp转运蛋白家族的转基因技术创建高吸附植物是植物修复重金属污染土壤的有力途径。在以往研究中,来自超富集植物伴矿景天Sedum pumbizincicola的三种不同的金属转运蛋白SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6被证实具有Cd转运能力。SpHMA2和SpNramp6位于质膜上,SpHMA3位于液泡膜上。重金属Cd、Pb、Cu、Zn和Mn的处理都可以强烈刺激它们的表达。为了创造潜在的植物提取生物材料,我们实验室在具有高生物量和环境适应性的K407油菜中过表达了三个单基因SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6,以及两个组合基因SpHMA2&SpHMA3和SpHMA2&SpNramp6,发现幼苗期的这些转基因工程油菜转运Cd和在地上部分积累Cd的能力都优于野生型油菜。并且,在混合Cd、Pb、Cu、Zn和Mn重金属污染的土壤中转基因油菜各株系的地上部分每种重金属的积累都得到了加强。这些结果为转SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6基因工程油菜成功的成为Cd和多种重金属污染土壤的植物提取材料提供了重要依据。基于以上研究成果,本研究通过分子和生理试验相结合的方法初步分析了转SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6基因工程油菜的遗传稳定性及环境安全性。取得具体研究成果如下:1.转SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6基因工程油菜目的基因具整合稳定性。通过特异性PCR技术,对转基因工程油菜各株系T1-T3代的遗传物质进行了针对主要功能元件SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6基因的检测。琼脂糖凝胶电泳结果显示在SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6基因对应bp长度区间有明显条带。并且,通过TAILPCR技术,对转基因工程油菜基因组的T-DNA插入位置的左侧和右侧的侧翼序列进行了扩增,并用高通量测序技术和BLAST技术对扩增片段进行了测序和油菜基因组碱基序列比对,成功找到了插入位置,因此可知外源基因SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6已经成功整合进入油菜基因组并能在不同时代中稳定遗传。2.转SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6基因工程油菜目的基因具有表达稳定性。通过实时定量PCR技术,对T1-T3代转基因油菜的外源基因SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6进行了相对表达水平的测定,结果显示SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6基因在三个世代转基因油菜各株系中都有十数倍至千倍的表达,说明SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6基因在转基因油菜各株系中稳定表达。3.转SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6基因工程油菜具有Cd等重金属吸附性状稳定性。测定高浓度Cd处理后野生型和T2代转基因油菜各株系单位重量的Cd含量,发现SpHMA2-OE1/OE3、SpHMA3-OE33/OE34、SpNramp6-OE1、SpHMA2&SpHMA3-OE2和SpHMA2&SpNramp6-OE4/OE5株系有较好的地上部分吸附Cd或转运Cd的能力。测定低浓度Cd处理盛花期土培野生型和T2代转基因油菜各株系中地上部分单位重量的Cd含量,发现除了SpNramp6-OE4外转基因油菜各株系均具有Cd高吸附能力。用激光共聚焦观察Cd处理后野生型和T3代转基因工程油菜的根、茎和叶的荧光探针强度得知转基因工程油菜地上部分的荧光强度更高,直观表明转基因工程油菜会向上转运Cd。用FE-SEM和EDAX仪分析多种重金属混合处理的野生型和T3代转基因油菜的根、茎和叶的横截面中的重金属含量,发现转基因油菜茎和叶中含量更高,初步判断转基因油菜可协同吸附Cd等多种重金属,表明这些转基因油菜具有Cd等重金属吸附性状稳定性。4.转SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6基因工程油菜生存竞争力与野生型相同。通过测定和评价野生型和T3代转基因油菜的种子萌发率和出苗率、花粉活力以及其他综合农艺性状,发现转SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6基因工程油菜在污染土壤中的传播方式和传播能力以及综合农艺性状与野生型没有区别,表明转基因过程没有影响工程油菜的生存竞争力。5.转SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6基因工程油菜靶标基因不发生基因漂移,具有环境安全性。通过特异性PCR检测技术,对盛花期转基因油菜田周围3km的杂草的

关键词： 黄原胶   基因工程   热稳定性   生物聚合物   侧链修饰  

摘要： 黄原胶是一种用途极为广泛的微生物多糖，广泛应用于食品、石油开采、医药等行业。研究表明黄原胶诸多优异性能与其结构的侧链修饰程度密切相关。关于黄原胶生物合成的相关基因已被大量研究，通过基因工程技术改变黄原胶侧链修饰结构成为研究热点，甚至可以根据需求定向生产黄原胶产品。本研究以黄原胶生产菌XanthomonascampestrisNRRLB-1459（XcB-1459）为出发菌株，构建黄原胶侧链修饰相关基因缺失的突变体菌株、对突变体的黄原胶产物进行结构分析与稳定性测试，在此基础上在还原剂Na2SO3保护下利用无丙酮酸黄原胶与乙二醛的交联反应，得到一种热稳定性提升的特殊黄原胶产品，使其能够用于高温油藏驱油剂。本研究中利用基因工程技术对黄原胶合成基因进行修饰，改变了黄原胶特定性能，扩大了黄原胶应用范围，也为其它微生物多糖的开发提供新思路。本研究开展的工作如下：　　1.构建黄原胶侧链修饰相关基因缺失突变体菌株　　确定XcB-1459菌株中两种侧链修饰基因（gumF与gumL）序列，设计敲除片段连接至自杀质粒pK18mobsacB获得侧链修饰基因敲除载体。敲除载体导入XcB-1459中，通过两次同源重组获得侧链修饰基因缺失突变体菌株，分别是丙酮酸转移酶缺失突变体Xc-?gumL、乙酰转移酶Ⅰ缺失突变体Xc-?gumF和丙酮酸转移酶与乙酰转移酶Ⅰ均缺失突变体Xc-?F?L。　　2.侧链结构改变的黄原胶发酵对比验证及结构分析　　分别利用野生型与突变体菌株发酵获得天然黄原胶（XG）与侧链结构改变的黄原胶（无丙酮酸黄原胶XG-L、无内侧乙酰基黄原胶XG-F与无丙酮酸和无内侧乙酰基黄原胶XG-FL）。对XG-L、XG-F和XG-FL侧链修饰基团含量及分子量进行测定，XG-L与XG-FL中丙酮酸含量为0，XG-F与XG-FL中乙酰基含量大幅减少，四种黄原胶分子量并无差异，分布于1.8?107~3.5?107Da之间，证明菌株构建有效。　　3.侧链结构改变的黄原胶稳定性测试　　侧链结构改变后黄原胶的性质发生明显变化：低浓度下（≤0.2%w/v）XG-F粘度最高，浓度≥0.4%时XG-L粘度最高;XG-L耐酸性能优异，XG-F与XG-FL耐碱性能优异;在黄原胶溶液中分别添加NaCl（0～20%）和CaCl2（0～20%），随着盐浓度的提高，XG-F与XG-FL粘度下降，XG-L与XG粘度维持稳定，但在CaCl2存在时XG-L粘度升高，XG-FL表现为粘度先增加后降低。　　4.侧链结构改变的黄原胶热稳定性测试　　以90℃下粘度的维持时间为评价指标，对四种黄原胶溶液（0.3%）的热稳定性进行测定。结果显示XG热稳定性最为优异（9d），XG-L次之（7d），XG-F与XG-FL表现最差（3d）;向黄原胶溶液中添加乙二醛（0.1%）与Na2SO3（0.3%）后再进行热稳定性测试，XG-L与XG-FL粘度维持时间最长为72d，XG为34d;单独在黄原胶溶液中加入乙二醛或Na2SO3进行热稳定性测试，加入乙二醛后所有样品粘度均只维持3d，而加入Na2SO3后XG-L维持64d，且其粘度明显低于同时添加乙二醛与Na2SO3的样品，通过此实验认为乙二醛与Na2SO3共同作用下，XG-L热稳定性提升最大。　　5.乙二醛与Na2SO3提升无丙酮酸黄原胶热稳定性的机理解析　　XG-L去除丙酮酸后阴离子基团减少，与乙二醛发生交联反应，使得其在添加乙二醛与Na2SO3后热稳定性提升。XG-L与乙二醛和Na2SO3混合后的样品（XG-LC）的红外光谱（FTIR）和扫描电镜（SEM）分析结果显示;XG-LC中的C-O和C-O-C拉伸振动（1050cm?1和1022cm?1）相较其他样品明显增强，SEM图像中XG-LC出现了致密的层状结构，证实XG-L与乙二醛分子发生交联反应。　　***-LC的流变性能　　从流动曲线扫描及频率扫描两个方面对XG-LC的流变性能进行测试，流动曲线数据显示XG-LC具有较高的零剪切粘度和抗剪切能力，频率扫描结果显示XG-LC拥有最高的储能模量与损耗模量,且储能模量始终大于损耗模量，这些结果表明XG-LC内部结构得到增强，具有较高的粘弹性。

关键词： 转基因作物   筛查策略   数据库   检测方法   阳性质粒分子  

摘要： 转基因生物安全是全球关注的热点问题,我国依法对转基因生物进行安全管理,而转基因生物成分检测是安全监管的前提与保障。自转基因作物商业化以来,其种类多样性和转基因序列的遗传组成不断增加,转基因检测面临产品种类、检测参数多,全项检测成本高、用时长,检测阳性物质缺乏、制备繁琐的困难。因此,检测过程中选择最适的筛查方案以及配套的、覆盖全面的阳性质粒分子显得尤为重要。本研究以此为出发点,对转基因检测工作进行改进、优化和简化,研究成果如下:1.本研究收集了在全球商业化推广或我国自主研发的118种独立转化体的基本信息、遗传信息以及检测方法信息,涵盖大豆、水稻、油菜和玉米四大转基因作物。将这些信息整合,构建了一种新型转基因成分筛查工具GMO Identification Tool(GMOIT,http://***/build/***#/)。在GMOIT中,用户可通过参数设置灵活选取靶标转化体,获取相应推荐筛查方案,也可对相关检测方法信息进行检索。该数据库还收录了各元件的检测引物/探针序列在相应转化体插入序列中的适用情况分析,为用户提供更加可靠的参考。2.本研究以GMOIT目前所含的全部118种转化体为待测范围,使用数据库获取推荐筛查方案,为该数据库的操作和功能提供了示范说明。同时,根据算法推选的分析结果,配合各候选元件的检测方法信息,以国家标准优先的原则,创建了对上述4种作物覆盖广泛的筛查方案以及配套的多靶标阳性质粒分子p GMOIT-1,包含P-35S、T-nos、T-E9和T-pinⅡ4个检测靶标,可覆盖102种转化体。验证结果表明,该质粒适合用作转基因作物普通PCR和实时荧光PCR筛查检测的质控样品,极大便利了相关的检测和研究工作。***目前包含全球商业化和中国自主研发的29种大豆独立转化体,本研究以这些转化体作为待测范围,使用GMOIT,获得推荐的转基因大豆筛查方案。通过对各候选元件和相关检测方法信息的进一步分析与筛选,以国家标准优先为原则,创建了转基因大豆“8+1”筛查方案以及配套多靶标阳性质粒分子pDDSC-1910,包含P-35S、T-E9、pat、cry1Ac、T-nos、P-AHAS、T-pinⅡ、DP305423-3′8个检测靶标和大豆内标基因Lectin,覆盖度达到100%。通过普通PCR检测,验证了该方案和阳性分子的可用性,为转基因大豆的高效筛查和检测工作提供便利。4.此外,本研究通过GMOIT的检索,收集了18种大豆转化体的特异性检测方法信息,涵盖我国目前已获批的16种转化体。并以此构建了一种可满足我国转基因大豆转化体鉴定需求的多靶标阳性质粒分子pDDID-1905。该质粒包含大豆内标基因Lectin和18种大豆转化体特异性的检测序列,是目前包含大豆转化体特异性序列最多的阳性质粒分子。对质粒中各靶标序列进行普通PCR检测,同时将该质粒作为阳性物质,对一种含多种大豆转化体gDNA的混合样品进行检测。扩增结果与预期一致,验证了该质粒的实用性,表明pDDID-1905质粒适合用作18种转基因大豆转化体的身份鉴定,极大地简化了繁琐的阳性物质准备工作。综上所述,GMOIT作为一种新型转基因筛查工具,可用于按需遴选转基因作物筛查方案和检索检测方法信息,为转基因作物的筛查检测提供了科学的依据和重要的参考。通过GMOIT建立的新筛查方案及配套阳性质粒分子,可极大地简化转基因检测工作。通过以上研究,可有效缩短转基因检测周期,降低检测成本,为转基因成分筛查和转化体鉴定提供便利,以期提升我国转基因生物检测和安全监管水平,促进农业转基因生物技术研究和产业化应用。

关键词： 肺炎链球菌   肺炎链球菌溶血素   全人源基因工程抗体   中和作用  

摘要： 肺炎链球菌能引起中耳炎、肺炎、脑膜炎、心内膜炎和败血症。据WHO统计全球每年约100万婴幼儿死于肺炎链球菌感染,其中我国约占3万。近年肺炎链球菌耐药性日益严重,且引起肺炎的病原体复杂多样难以快速鉴别诊断,从而导致用药不当或用药延迟,诸多因素导致肺炎链球菌感染成为婴幼儿死亡的重要原因。肺炎链球菌溶血素（Pneumolysin O,PLY）在肺炎链球菌的致病过程中发挥了重要作用:它能破坏气管上皮和血脑屏障的完整性,细菌得以进入血液、入侵大脑;激活NLRP3炎症小体,刺激多种细胞分泌炎性细胞因子,引发细胞因子风暴。在7价、10价、13价PCVs的基础上研制的新型蛋白结合疫苗含有PLY类毒素,动物实验、1期和2期临床试验结果表明新型疫苗具有良好的免疫原性和安全性。由于含PLY类毒素的蛋白质结合疫苗应用于临床还将有很长一段时间,研发全人源抗PLY中和性抗体辅助治疗肺炎链球菌重症感染者对于降低病死率、保护年轻家庭具有重大现实意义。我们前期获得的抗SLY全人源单克隆抗体可以有效阻断r PLY的溶血活性,本研究利用该抗体的可变区序列构建基因工程抗体,通过细胞试验和动物试验验证其对r PLY的中和作用。主要研究方法和结果如下:***及其不同结构域蛋白的原核表达将肺炎链球菌D39株的ply基因及编码PLY D1-3和PLY D4的基因片段克隆到p ET28a质粒的Xho I-Bam H I位点之间,成功构建了重组质粒p ET28a-ply、p ET28a-ply d1-3和p ET28a-ply d4。将重组质粒导入*** BL21（DE3）中,重组菌在16℃经1 m M IPTG诱导18 h,菌体经超声破碎后检测发现r PLY、r PLY D1-3、r PLY D4三种重组蛋白均可溶性表达。表达产物经Ni2+-NTA亲和柱纯化,SDS-PAGE及溶血试验,结果显示各重组蛋白的分子量与理论值相符,纯度在90%以上;r PLY具有溶血活性。2.抗PLY全人源基因工程抗体的研制通过蛋白免疫印迹实验、酶联免疫吸附法和溶血阻断实验发现本实验室前期获得的三株抗SLY全人源单克隆抗体1-10F、2-2G、4-2G对r PLY有较高亲和力,也能阻断其溶血作用。克隆这三株杂交瘤细胞的抗体轻链和重链可变区基因到改造后的p CDNA3.4载体中,得到重组质粒p CDNA3.4-1-10F-VL、p CDNA3.4-1-10F-VH、p CDNA3.4-2-2G-VL、p CDNA3.4-2-2G-VH、p CDNA3.4-4-2G-VL和p CDNA3.4-4-2G-VH。分别将3株抗体轻链和重链的表达载体共转染HEK293F细胞,7天后收集细胞培养液,利用Protein A亲和层析柱纯化得到基因工程抗体1-10F、2-2G和4-2G,经SDS-PAGE检测抗体分子量与理论值相符,纯度在98%以上。用ELISA法检测1-10F、2-2G和4-2G对r PLY的EC50值分别为:41.61μM,15.52μM,48.40μM;Ka值分别是:1.99×10～5,3.99×10～5,9.31×10～4。2-2G的亲和力最高,1-10F和4-2G次之。蛋白免疫印迹显示这三株抗体识别的抗原表位存在于r PLY第1-3结构域,它们不结合第四结构域。3.基因工程抗体的体内、体外中和作用分别用红细胞和HEK293细胞测定三株全人源基因工程抗体的体外中和作用,结果表明500μg/m L 1-10F对2.7 n M r PLY（相当于1个溶血单位）溶血作用的阻断率达到了95%以上,对10.8 n M r PLY的阻断率达到了80%以上。其它两株抗体阻断效果稍差,250μg/m L 2-2G对2.7 n M r PLY的阻断率仅为45%,对10.8n M r PLY的阻断率为20%,且抗体剂量提高后阻断率并无明显提高。抗体4-2G的阻断效果界于两者之间,在500μg/m L浓度下对2.7 n M r PLY的阻断率达到了75%以上,对10.8 n M r PLY也可达到60%。对于HEK293细胞,750μg/m L1-10F可阻断1090 n M r PLY(相当于2 IC50)70%的细胞毒性作用,其他2种抗体无明显阻断效果。体内中和作用采用预防性被动免疫试验评估抗体对r PLY导致的炎症反应和组织损伤的保护作用。给5周龄BALB/c小鼠皮下注射160μg基因工程抗体1-10F,对照组注射生理盐水,24 h后腹腔注射45μg r PLY,在攻毒后的1、3、5 h取血测定各组血清中IL-1β、TNF-α、IFN-γ和IL-8浓度,在最后一个时间点取各组小鼠的心脏、肺脏、肝脏、脾脏,经多聚甲醛固定后进行免疫组化和病理分析。结果显示:攻毒后对照组小鼠血清中IL-1β、TNF-α、

关键词： 视网膜退行性疾病   人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞   细胞移植   上皮间质转化   烟酰胺  

摘要： 目的:视网膜退行性疾病(Retinal degeneration,RD)是一类由于原发性视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞或/和感光细胞变性导致继发性感光细胞凋亡最终引起视觉功能丧失的致盲性眼病,包括年龄相关性黄斑变性(Age-related macular diseases,AMD)、视网膜色素变性(Retinitis pigmentosa,RP)、Stargardt病等。迄今为止,这些眼底疾病在临床上尚无有效的治疗措施。RPE的结构和功能对视觉形成和维持至关重要。因此,RPE细胞移植成为治疗RD的极具前景的一种治疗方法。人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,h ESCs)和人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hi PSCs)是目前重要的RPE细胞来源。目前的研究支持视网膜h ESC-RPE和hi PSC-RPE细胞移植治疗RD的可行性和短期安全性,临床试验也在进行中。然而在这一过程中又有新的问题和挑战亟需解决:如何高效稳定地提高理想移植细胞产量,如何避免RPE细胞发生上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)。本研究从(1)建立高效稳定扩增h ESC-RPE细胞的方法并探索其机制;(2)抑制h ESC-RPE细胞发生EMT及其机制两个方面具体展开深入研究。方法与结果:本研究由两部分组成。第一部分:在实验室前期研究的基础上,通过视网膜类器官培养诱导分化获得h ESC-RPE细胞,为未来良好生产规范(good manufacturing practices,GMP)标准下大规模高效稳定生产提供“种子”细胞。通过透射电镜和免疫荧光染色检测了h ESC-RPE细胞的超微结构和相关蛋白表达情况符合RPE的特性,通过吞噬功能和屏障功能进行了检测,h ESC-RPE细胞具备RPE的功能特征,为后续实验研究提供稳定细胞来源。通过补充烟酰胺促进h ESC-RPE细胞的体外高效稳定扩增,极大地提高了h ESC-RPE细胞产量,满足未来临床细胞移植需要;然后我们探究了上述作用机制,通过衰老染色、Western Blot等方法评估烟酰胺抑制h ESC-RPE细胞衰老和维持上皮表型,这依赖于烟酰胺补充改善线粒体功能障碍和促进线粒体自噬进行线粒体质量控制,并通过透射电镜、免疫荧光染色和NAD、ATP等关键代谢物定量检测进行验证。最后通过色素形成、跨上皮电阻检测和感光细胞外节吞噬试验评估了扩增h ESC-RPE细胞的生物学功能,满足细胞移植的要求。第二部分:通过控制细胞起始密度干预细胞-细胞连接形成建立了h ESC-RPE细胞密度依赖的EMT时空模型;通过2D/3D培养、RT-PCR和免疫荧光染色从小分子化合物库筛选并验证Rep Sox和Y27632联合使用可以有效逆转h ESC-RPE细胞中晚期EMT;通过流式细胞技术和划痕实验评估了Rep Sox和Y27632联合使用促进h ESC-RPE细胞增殖,抑制迁移。并在体内视网膜下纤维化模型大鼠中,通过视网膜电生理检查、组织免疫荧光染色验证了Rep Sox和Y27632联合使用抑制EMT,挽救感光细胞的凋亡,保护视觉功能。结论:本研究通过视网膜类器官培养诱导分化成功获得h ESC-RPE细胞,具有RPE的特征;发现添加烟酰胺促进h ESC-RPE细胞的体外高效稳定扩增,提高产量用于临床细胞移植;首次发现小分子组合Rep Sox和Y27632能够逆转移植h ESC-RPE细胞发生EMT。本研究为将来GMP标准下大规模生产h ESC-RPE细胞,有效改善临床细胞移植治疗RD疗效提供新的思路和策略。

关键词： 血管支架   血液相容性   内皮化   功能多肽   锌离子   基因工程  

摘要： 血管支架植入术是治疗心血管疾病（CVDs）的有效手段,而支架植入后的血栓形成和支架内再狭窄（ISR）是目前支架治疗存在的主要问题。其中,血管内皮损伤是导致支架植入后发生这些不良反应的主要原因之一。在支架表面快速内皮化是解决这些问题的有效方法。材料表面功能化修饰和基因工程是实现快速内皮化的常用策略。本文针对支架治疗存在的诸多问题,首先利用内皮细胞（ECs）靶向肽和金属离子对支架表面进行修饰以促进材料表面快速内皮化。此外,本文制备了治疗性反义寡核苷酸（ASO）递送系统,将ASO递送到内皮细胞核,以高效促进ECs迁移和血管生成,初步探索了核酸治疗法在促进内皮化方面的应用。 1.采用化学接枝的方法将聚（α-甲基丙烯酸-co-2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱）(PMAMPC)聚合物和ECs特异性粘附肽（Arg-Glu-Asp-Val,REDV）修饰在镍钛合金（NiTi）支架表面,制备了改性支架NiTi-PMAMPC/REDV。X-射线光电子能谱（XPS）结果证明了PMAMPC和REDV被成功接枝至NiTi表面。静态水接触角（WCA）结果证实了改性后的表面具有适度的润湿性。体外纤维蛋白原（Fg）粘附、血小板粘附以及溶血实验结果显示,NiTi-PMAMPC/REDV具备良好的血液相容性。体外细胞实验表明,NiTi-PMAMPC/REDV表面能够选择性的粘附人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）,并促进其增殖和迁移。此外,将改性后的支架植入至Sprague Dawley（SD）大鼠腹主动脉,进而评价其内皮化能力和抑制内膜增生的情况。动物实验结果证明,NiTi-PMAMPC/REDV能够在表面形成光滑完整的内皮层,并有效减少内膜增生,这有利于保持支架部位的长期通畅性。 2.利用多巴胺（DA）涂覆的方式将锌离子(Zn2+)和1,6-己二胺（HDA）固定在钛（Ti）基材表面,然后通过肝素上的羧基与表面上的氨基间的酰胺化反应将肝素化学接枝到材料表面,构建了Zn2+和肝素共修饰表面。通过调节溶液中Zn2+的浓度,构建出具有不同Zn2+含量的表面,探究改性后表面的血液相容性和内皮化能力。体外Fg粘附、血小板粘附以及溶血实验表明,改性后的表面能够减少对Fg和血小板的粘附,具有良好的血液相容性。更重要的是,修饰有Zn2+的表面具有很好的细胞相容性,并能够促进HUVECs在表面的增殖、迁移和血管化,这有利于支架表面的快速内皮化。 3.通过连续挤压技术,在聚乙烯亚胺（PEI）/治疗性ASO复合物表面包覆内皮细胞膜（CMECs）,由此制备出PEI/ASO@CMECs复合物,其粒径约为158nm,Zeta电位值约为-6.5 mV。CMECs的包覆对复合物的ASO负载能力并没有明显的影响。通过激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）以及蛋白质印记分析等实验,确定了CMECs被成功包覆至PEI/ASO表面。流式细胞术结果表明,PEI/ASO@CMECs表面的CMECs能够保持其生物活性。利用CLSM技术表征PEI/ASO@CMECs对HUVECs的基因递送性能,其结果显示PEI/ASO@CMECs能够将ASO高效递送到HUVECs的细胞核内。此外,利用CLSM技术和流式细胞术分析PEI/ASO@CMECs的摄取机制,其结果表明PEI/ASO@CMECs主要是通过膜融合的方式进入HUVECs。通过噻唑蓝（MTT）实验、实时定量聚合酶链式反应（RT-PCR）技术、transwell实验以及血管生成实验,分析PEI/ASO@CMECs对HUVECs行为的影响,结果表明PEI/MEG3-ASO@CMECs能够下调长链非编码RNA母系表达基因3（lncRNA MEG3）的水平,并有效促进HUVECs迁移和血管生成,这将有利于促进内皮化。 综上所述,PMAMPC和REDV共修饰策略能够促进植入支架表面内皮化,并有效抑制内膜增生,从而保持支架的长期通畅性。肝素和Zn2+共修饰表面可以提高支架的血液相容性,并促进ECs增殖、迁移和血管化。CMECs的引入能够显著提升PEI/MEG3-ASO复合物的基因递送性能,可将MEG3-ASO高效递送至细胞核,从而高效调控ECs迁移和血管化的行为。本论文的研究对治疗CVDs的研究具有重要意义。

关键词： 重组乳酸菌   基因工程   胰高血糖素样肽-1(GLP-1)   安全性   糖尿病  

摘要： 糖尿病是全世界普遍存在的复杂代谢疾病之一,它与高血糖或高血糖状态有关,主要因胰岛素抵抗或/和胰岛素分泌不足导致。2021年全世界20-79岁的成年人中有5.37亿(10.5%)糖尿病患者,相当于每10个人中就有1个糖尿病患者,预计到2030年这一数字将增加到6.43亿人。2021年中国20-79岁的成年人中有1.40亿糖尿病患者,占全世界糖尿病患者的26.1%,预计到2030年这一数字将增加到1.64亿人。目前2型糖尿病治疗方式主要以降血糖药物为主,辅以饮食调控和加强运动,而降血糖药物包括口服药及皮下注射药,其中长期皮下注射药物不仅需要患者极高的依从性,也给患者带来皮肤损伤、感染等风险。乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是一类细菌的统称,它们能分解碳水化合物并产生大量乳酸。由于在人类营养中的长期安全使用,它们已被美国食品和药物管理局认可为安全的菌株,并且通常用作食品工业中的发酵剂。LAB的特定菌株被用作人类和动物健康的益生菌,因为它们可以通过产生生物活性代谢物、调节黏膜免疫和肠道通透性,在维持胃肠道稳态和影响其他器官方面发挥着至关重要的作用。胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种短效的肠促胰岛素,主要由近端小肠肠内分泌L细胞合成和分泌。GLP-1的成熟形式由30个氨基酸组成,GLP-1对β细胞恢复和增殖具有多效治疗作用。然而,短暂的血浆半衰期(在循环系统中约2min)限制了其药物治疗研究和临床应用。因此,可以探索设计一种含有人长效GLP-1类似物(LGLP)的重组乳酸乳球菌,作为黏膜递送的潜在载体,通过重组乳酸菌合成分泌LGLP的生物活性分子。本文研究内容及结果如下:(1)重组长效GLP-1类似物乳酸球菌的构建:通过分子克隆方法构建携带LGLP基因的质粒pLN-LGLP,采用电穿孔法将目的质粒导入感受态乳酸菌。结果表明成功获得了重组LGLP乳酸菌(L-pLN-LGLP),并且能表达LGLP蛋白,在有nisin诱导剂作用下其表达量明显增加。(2)重组长效GLP-1类似物乳酸菌体内外活力研究:使用酶标仪检测OD值、平板计数法、体外模拟胃肠液培养及小动物活体成像探讨重组LGLP乳酸菌体内外的活力及重组质粒的遗传稳定性。结果表明LGLP基因能在重组乳酸菌中稳定遗传,重组LGLP乳酸菌能够通过极端的胃肠液环境,最终在小鼠肠道中定植,72h后肠道内仍有活性菌。(3)重组长效GLP-1类似物乳酸菌体内安全性分析:通过急性(14天)、亚急性(28天)口服毒性试验,以评估重组菌的安全性和可能的发病机制。结果表明重组LGLP乳酸菌短期口服不会对宿主健康造成明显不利影响。(4)LGLP在小鼠体内的药代动力学研究:采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)方法,用于测定腹腔给药后小鼠血浆中GLP-1及LGLP的水平。根据拟合结果,LGLP在小鼠体内吸收较快,给药3min后血药浓度达到最高,半衰期约为20min。(5)重组长效GLP-1类似物乳酸菌体内、体外作用研究:从体外、体内实验进一步验证LGLP是否具备GLP-1的功能,灌胃重组LGLP乳酸菌是否能达到LGLP给药的效果。结果表明重组LGLP乳酸菌可以定植在小鼠肠道中,且能短期内持续存在,重组菌分泌的LGLP能发挥GLP-1的相关作用。综上所述,本研究成功构建表达LGLP蛋白的重组乳酸乳球菌,并验证了LGLP半衰期较GLP-1延长,且稳定性较好。重组LGLP乳酸菌表达的LGLP蛋白可通过调控胰岛素分泌、促进胰岛细胞增殖、减低体重等来调控血糖。