关键词：
细菌纳米纤维素
大口黑鲈弹状病毒
疫苗载体
浸浴免疫
摘要：
大口黑鲈弹状病毒(Micropterus salmoides rhabdovirus,MSRV)是一种严重危害大口黑鲈健康生长的病毒。该病毒的爆发每年都给我国大口黑鲈养殖业带来严重的经济损失。众所周知,免疫防控是病毒性疾病有效防控手段之一,也是保障大口黑鲈养殖成果的重要措施。水产养殖业中,注射、口服、浸浴是常规的三种免疫方式。虽然注射免疫效果最好,但劳动强度大、鱼类应激反应严重等成为生产中推广应用的难题。浸浴和口服免疫尽管能够实现规模化,但鱼体的屏障和肠道的降解等因素致使其效果大打折扣。本实验室前期通过无机碳纳米管载基因工程疫苗研究获得一系列进展,为本研究的开展提供了借鉴。因此,采用细菌纤维素(Bacterial cellulose,BC)可降解的有机材料制备纳米纤维素,并通过制备工艺优化、构建纳米纤维素载弹状病毒G2蛋白疫苗及效果评价,为产业化应用提供基础资料,取得以下结果:1.功能化细菌纳米纤维素的制备和研究首先对细菌纤维素进行破碎,2,2,6,6-四甲基哌啶氮-氧-化物(TEMPO)对破碎后的细菌纤维素进行羧基化修饰,制备得到羧基化的细菌纤维素。采用控制变量法,按1:12.5(g:m L)比例将羧基化细菌纤维素加入到不同浓度的硫酸溶液(50%、65%和70%)中,50℃,分别酸化50 min、120 min。经原子力显微镜表征,制备得到不同平均尺寸的羧基化细菌纳米纤维素(1000 nm、600 nm、350 nm)。使用异硫氰酸罗丹明对不同尺寸的细菌纳米纤维素进行标记,分别以15、30、60 mg/L的浓度对斑马鱼胚胎细胞(ZF-4)进行孵育,经流式细胞术分析,相同处理浓度条件下,350 nm长度的细菌纳米纤维素更易穿透细胞。用30 mg/L异硫氰酸罗丹明标记的细菌纳米纤维素对斑马鱼的成鱼和仔鱼分别进行浸浴,5 h后取成鱼和仔鱼,将成鱼各组织器官制作成组织切片,使用激光共聚焦显微镜观察细菌纳米纤维素在斑马鱼体内各组织器官中的富集。试验结果表明细菌纳米纤维素具有良好的穿透性能。细菌纳米纤维素(350 nm)分别以15、30、60 mg/L对ZF-4细胞进行共孵育;100、500 mg/L的浓度对斑马鱼进行浸浴。试验结果表明,与对照组相比,细菌纳米纤维素不会对细胞活力带来显著影响(P<0.05);浸浴72 h后斑马鱼体内CAT、GSH-PX和SOD酶活水平与对照组相比差异极显著(P<0.01),但浸浴处理30天内,没有观察到斑马鱼死亡。2.细菌纳米纤维素载疫苗系统的构建在实验室前期研究中对大口黑鲈弹状病毒的糖蛋白(glycoprotein,G)进行优势抗原表位筛选,试验结果表明G蛋白G2片段抗原表位具有良好的免疫原性。本研究使用原核表达系统发酵生产G2蛋白,对发酵生产的蛋白进行亲和纯化,并通过SDS-PAGE电泳和Western Blot对纯化后的蛋白进行鉴定,结果表明G2蛋白表达成功。使用EDC和NHS对上一章节中制备得到的羧基化细菌纳米纤维素进行活化,与纯化后的G2蛋白通过酯化反应进行连接制备细菌纳米纤维素载G2蛋白疫苗系统。使用原子力显微镜对连接蛋白前后的细菌纳米纤维素进行表征,试验结果表明细菌纳米纤维素在与蛋白连接后,纳米纤维的直径大于未与蛋白连接的纳米纤维。使用BCA方法对纳米载疫苗系统中的G2蛋白的浓度进行测量,结果表明其载抗原蛋白效率为24.3%。使用100 mg/L细菌纳米纤维素载G2蛋白疫苗系统(BNCs-G2)对大口黑鲈进行浸浴,30天后与对照组相比,疫苗浸浴组的大口黑鲈没有出现死亡。3.细菌纳米纤维素载疫苗系统的免疫效果评价使用BNCs-G2与G2蛋白疫苗组在不同浓度(10、20和40 mg/L)下对大口黑鲈(1±0.2 g)进行浸浴免疫。收集免疫后第一周到第四周的大口黑鲈血清,用酶联免疫吸附法(ELISA)对血清中的抗体滴度进行检测。试验结果显示,在相同浓度条件下,纳米纤维载疫苗组的抗体滴度要显著高于G2蛋白疫苗浸浴组(P<0.05)。并且随着纳米纤维载疫苗系统浸浴浓度的升高,大口黑鲈血清中抗体滴度水平也呈现上升趋势。在第三周,浸浴免疫组的免疫相关基因(Ig M,TNF-α,IL-12,TCR,CD4)表达水平都显著高于PBS组(P<0.05);四周后,用MSRV对免疫后的大口黑鲈进行攻毒,试验结果显示,G2蛋白组(40 mg/L)的免疫保护率最高为33%,纳米纤维素载疫苗组(20、40 mg/L)的免疫保护率分别为44.7%和66.7%。综上所述,细菌纳米纤维素可作为一种优良的疫苗蛋白载体,能提高疫苗的浸浴免疫效果,实现对MSRV的有效防治。该项研究成果不但可以为水产动物疫苗的纳米载体系统构建提供理论依据和研究模板,而且也对保障水产品安全和水产养殖健康发展有重要意义。
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