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关键词： 椎间盘退变   circRNA   基因治疗   水凝胶微球   细胞外基质代谢  

摘要： 背景:腰痛严重影响患者的生活质量和工作能力,并给社会带来了沉重的经济负担。研究表明,椎间盘退变引起的相关疾病是导致腰痛的最常见原因。目前对于椎间盘退变性疾病治疗方案包括:休息、理疗、药物治疗、椎间盘射频消融等介入治疗以及各种手术治疗。尽管这些治疗方法均取得了不错的短期疗效,但长期仍受高概率复发性疼痛的影响。近年来,基于生物分子、细胞和组织工程的生物疗法,因其在恢复椎间盘结构方面的巨大潜力而成为研究的焦点。但研究人员开发新的疗法时,普遍忽视了椎间盘营养供应不足的影响。这些促进细胞增殖和细胞外基质合成代谢活动的椎间盘修复策略,进一步加剧了退变椎间盘对营养的需求,从而降低了椎间盘细胞的生存能力。因此,有必要开发一种聚焦于椎间盘营养受限的修复策略,从而为治疗椎间盘退变提供新思路。 在生物治疗领域中,相较于蛋白质、多肽和生长因子等传统疗法,基因治疗有望通过一次注射的方法,从根源上长期修复椎间盘退变。环状RNA（circular RNA,circ RNA）是一类新兴的RNA家族成员,通过影响转录或转录后水平的基因表达在调控细胞功能（例如增殖,分化,侵袭,迁移和代谢）方面起着关键作用。circ RNA具有种类丰富、结构稳定、序列保守以及细胞或组织特异性等特点,使其在开发椎间盘退变修复策略方面比其他RNA更具优势。然而,单纯的基因药物易被核酸酶降解和转染效率低而难以进入细胞发挥其功效,必须借助适宜的基因载体实现其有效递送。阳离子脂质体能够包装DNA或RNA并吸附在细胞膜上而被广泛用作基因载体。但是,直接注射到靶器官会导致基因载体迅速分散和丢失而难以靶向局部病灶。并且,基于载体的核酸生物学表达是瞬时性的,并不总是适用于需要进行长期持续再生修复的研究。此外,基因药物的不可控性表达,可能产生过量的细胞外基质导致病理性纤维化。因此,急需开发一种高效、持续和可控的基因递送系统来局部靶向修复椎间盘退变。 先进生物材料引导的基因载体传递允许以时空精准的方式控制和传递基因药物,是一种新兴的、极具吸引力的靶向修复治疗方案。基于微流控技术制备的单分散、粒径均一、携载生物活性物的水凝胶微球,可以微创注射的方式减少组织损伤并实现精准治疗。另外,水凝胶微球可以保护和缓释封装在其内部的生物活性物,并以较低的局部药物浓度和施用频率,就可以提供安全和有效的治疗。因此,本研究拟从营养受限诱导椎间盘退变的病理机制出发,根据微阵列芯片筛选出的可靠circ RNA靶点,结合先进的可注射水凝胶微球技术,期望通过化学接枝的方式构建一种理想的局部靶向递送系统,从而实现退变椎间盘的长期修复。 目的:1.筛选和鉴定营养受限诱导椎间盘退变过程中的关键circ RNA;2.评估circ RNA沉默基因工程化的可注射水凝胶微球的相关性能;3.评估circ RNA沉默基因工程化的可注射水凝胶微球在体内外修复椎间盘退变的能力。 方法:第一部分:葡萄糖剥夺培养髓核细胞模拟椎间盘营养受限微环境。葡萄糖剥夺培养髓核细胞0 h、6 h、12 h和24 h后,收集样本,利用circ RNA芯片检测每个时间点髓核细胞中环状RNA表达量。STEM软件对时间序列进行聚类分析,筛选随着培养时间连续性变化的差异表达circ RNAs。功能富集分析用于预测连续性上调和下调circ RNAs的潜在功能。选择连续性上调最显著的5个circ RNAs和下调最显著的5个circ RNAs构建circ RNA-mi RNA调控网络,筛选关键的circ RNA。q RT-PCR检测关键circ RNA在退变髓核组织和葡萄糖剥夺培养的髓核细胞中的表达情况。Sanger测序和RNase R耐受实验用于验证关键circ RNA的结构。Western Blot实验检测沉默关键circ RNA后,葡萄糖剥夺培养的髓核细胞外基质成分的表达情况。 第二部分:薄膜分散法制备1,2-二油酰-3-三甲基氨基丙烷/胆固醇/1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane/cholesterol/1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,DOTAP/Chol/DOPE）阳离子脂质体。根据DOTAP的氮原子比上p DNA的磷酸盐配制不同N/P比的基因-脂质体复合物（lipoplexes）。动态光散射（Dynamic light scattering,DLS）和透射电子显微镜（Transmission electron microscopy,TEM）观察阳离子脂质体和不同N/P比的lipoplexes的尺寸、Zeta电位以及形貌。凝胶电泳阻滞实验检测阳离子脂质体聚合p DNA的能力。流式细胞仪检测GFP阳性细胞百分率,CCK-8实验和q

摘要： 在2021年12期的导语中,我提及了我对创意写作专栏的一些愿景,其中最根本的想法,就是想要能够展示出创意写作学科的专业性和独立性,而这仅靠一些作品展示其实是难以令人信服的,我希望能够在栏目中展示出某些"过程"。正如诗人保尔·瓦雷里所言:"没有什么比漂亮的手稿更美妙的了……一首完整的诗应该包含它最初的孕育阶段,以及它产生出来的每一个阶段所形成的链条,还有那些意想不到的突变与尝试。这才叫真正的创始与创作。"

关键词： 体液斑鉴定   DNA甲基化   MPS   甲基化单倍型   随机森林模型  

摘要： 背景基于组织差异性DNA甲基化标记推断体液斑的组织来源是近年来法医学研究热点。DNA甲基化的组织特异性和稳定性是法医学应用的重要评估指标。基于组织差异性单CpG位点甲基化的体液推断方法,显示出较高的法医学应用价值。然而,单CpG位点甲基化较大的个体差异性降低了该方法的准确性,而区域甲基化单倍型模式具有更高的组织特异性和个体稳定性,有望成为更好的体液鉴定标记。MPS则是可深入分析组织差异性甲基化模式的技术方法,有助于探索出更好的体液鉴定标记。目的建立基于MPS的甲基化检测方法,探索不同体液特异性甲基化模式标记鉴别法医体液的准确性。方法构建亚硫酸盐转化扩增子测序文库,采用Miseq双端测序技术,对165例体液样本的41个体液特异性甲基化片段进行测序,运用生物信息学分析软件对测序数据进行甲基化分析,获取所有片段CpG位点的甲基化水平,筛选组织特异性强、稳定性好的甲基化标记建立体液推断随机森林模型,根据体液推断的准确性选出体液鉴定的最佳标记。结果所有样本片段的测序结果质量良好。大部分片段的CpG位点甲基化水平在每种体液中具有高度一致性,在靶体液与其它体液之间呈现显著性差异。基于其中9个片段的10个位点甲基化水平推断体液的准确性达到97.58%;基于9个片段的18个体液特异性更强的位点组成单倍型甲基化标记推断体液的准确率达到98.18%。基于所有片段的5个体液特异区分度最大的位点推断体液的准确率达到100%。结论基于MPS的甲基化检测方法可筛选出体液特异性更强的甲基化模式。多个组织特异性甲基化CpG位点组成的单倍型标记有助于提高基于DNA甲基化鉴定体液斑的准确性。

关键词： 鲍尔斯   《快乐基因》   伦理身份   伦理冲突   伦理环境   伦理选择  

摘要： 作为享有国际声誉的20世纪后现代小说家,理查德·鲍尔斯无疑是美国当代文坛中一位卓尔不群的人物,被称为美国后品钦时代的“三剑客”之一。其作品主要打破科学和艺术两种文化间的界限,探索现代科学技术对人类生存和社会的影响,寻求科学和艺术两种文化融通的途径。他的创作善于切中信息时代生活的本质,极易引起读者对现代科学技术的发展和应用进行重新认识和反思。其作品《快乐基因》便是集上述特色于一体,成为美国后现代文学中的重要代表作品。《快乐基因》作为鲍尔斯的第十部小说,向读者展现了以基因编辑技术为底色的人类美好发展前景图画背后所隐藏的相关伦理问题。通过阅读小说,读者可以了解鲍尔斯对科学技术应用问题的伦理担忧,也可以对科学技术的伦理维度进行重构,以使科学技术为人类牟取更多福利。虽然小说对于人类的长远发展有着至关重要的意义,但是国内研究这部作品的学者却寥寥无几。因此,本论文将运用文学伦理学批评的相关理论,分析主要人物因伦理身份的多样性引起的与社会群体间的伦理冲突,而后又在混乱的伦理环境中做出伦理选择的过程。从而揭示理查德·鲍尔斯的伦理思想,挖掘小说《快乐基因》中的伦理启示。本篇论文共分为五个部分:首先介绍作者理查德·鲍尔斯和其作品《快乐基因》,其次,综述近年来国内外学者对鲍尔斯及其作品的研究成果。然后是论文的理论基础,包括概述伦理学批评的意义和功能以及文学伦理学批评的定义、起源、发展和核心观点。再次,主要从人物的伦理身份、伦理冲突、伦理环境、伦理选择四个层面剖析小说中由基因编辑技术引发的伦理问题。最后,总结全文并重申主要观点,呼吁人们关注基因编辑技术发展过程中带来的伦理挑战,引导人们正确地定位基因编辑技术。

关键词： 脑淀粉样血管病   DNA甲基化   HTRA4  

摘要： 研究目的脑淀粉样血管病(Cerebral Amyloid Angiopathy,CAA)是造成老年人自发性脑叶出血和年龄相关认知障碍的主要原因,由β-淀粉样蛋白(Amyloid-β,Aβ)沉积在脑血管中所引起。目前CAA的发病机制尚未完全明确,其中神经血管及遗传因素是CAA的重要危险因子。神经血管单元(Neurovascular Unit,NVU)作为大脑中重要的功能域,在Aβ的积聚和清除中起着至关重要的作用。β-淀粉样蛋白前体蛋白(β-amyloid Precursor Protein,APP)及载脂蛋白E(APOE)等遗传因素通过影响Aβ构象、纤维形成、毒性及沉积位点,促进CAA的发生、发展。此外,CAA作为一种年龄相关性的复杂疾病,表观遗传调控或许在其发病机制中发挥重大作用。表观遗传学修饰在不改变DNA序列的情况下,调控基因的表达,影响和调节基因的功能和特性。然而,表观遗传修饰是否在CAA的发生、发展及其预后中发挥一定作用,尚未得到系统研究。因此,本研究通过全基因组甲基化850K芯片(Illumina Infinium Methylation EPIC 850K Bead Chip)及独立样本验证,分析CAA患者与对照者外周血DNA甲基化水平差异并筛选出差异基因,明确DNA甲基化在CAA发生、发展过程中的作用,探索CAA中差异甲基化基因可能的病理机制,为CAA的早期诊断及治疗提供新的思路和理论依据。研究方法(1)本研究自2019年9月-2021年12月根据波士顿1.5版诊断标准于青岛大学附属医院收集CAA患者全血样本,并按照年龄、性别匹配对照者,提取外周血DNA。通过Human Methylation 850K芯片对4例CAA患者及4例对照者的基因组DNA样本进行杂交分析,数据处理,进而获得差异基因。此外,对差异基因进行Gene Ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)功能富集分析。(2)根据GO及KEGG富集分析结果并参考相关文献,最终筛选出7个候选基因(PRSS50、RUFY1、HTRA4、CCDC3、CIZ1、NFKB2以及LRP1)进行验证。在32例独立样本中(16例CAA患者和16例对照者),采用Methyl Target DNA甲基化目的区域测序技术,分析PRSS50、RUFY1、HTRA4、CCDC3、CIZ1、NFKB2以及LRP1基因中注释的Cp G位点和区域,从而比较CAA患者与对照人群的甲基化水平差异。通过仔细回顾16例CAA患者的病史及影像学检查,总结CAA患者的临床及影像学特征,并对差异甲基化基因的甲基化程度与CAA患者临床表型进行统计学分析。研究结果(1)通过比较CAA病例组与对照组全基因组甲基化水平,在P值<0.05以及单位点甲基化差值(***)的绝对值>0.1的情况下,共筛选出7378个甲基化差异位点,其中高甲基化位点1169个,涉及665个基因,低甲基化位点6029个,涉及2926个基因。此外,筛选出45个甲基化差异区域(P<0.05),涉及42个基因。GO和KEGG富集分析表明,差异基因的生物学功能主要集中在小GTP酶介导的信号转导、激素及类固醇激素介导的信号转导、中枢神经系统发育、脂代谢以及钙信号通路等方面。这些功能通路中差异基因的DNA甲基化水平变化可能是造成CAA发病的原因之一。(2)在独立样本验证阶段,对筛选出的7个基因(PRSS50、RUFY1、HTRA4、CIZ1、CCDC3、NFKB2以及LRP1)共176个Cp G位点及17个片段进行甲基化水平检测,结果显示HTRA4基因目的区域内有多个位点的甲基化水平在CAA组与对照组间的差异具有统计学意义(P<0.05)。结果表明CAA患者与对照者相比,HTRA4基因整体甲基化水平降低,此外,HTRA4基因中4个片段(HTRA4＿3、HTRA4＿4、HTRA4＿5及HTRA4＿6)与24个Cp G位点均处于低甲基化状态。(3)通过分析CAA患者临床资料,发现CAA患者脑出血以枕叶出血为主,并伴有脑白质病变,血管周围间隙扩大、腔隙性梗死及蛛网膜下腔出血等影像学表现。对HTRA4甲基化程度与CAA患者临床表型之间的关系进行统计分析,结果表明无论是否存在脑出血以及不同脑出血部位(额叶、颞叶、顶叶和枕叶)的CAA患者HTRA4甲基化程度无差异(P<0.05)。此外,HTRA4甲基化程度与CAA中脑出血患者出血量无相关性(P<0.05)。结论(1)CAA患者与对照者相比,DNA甲基化水平有显著不同,这可能是促进CAA发生、发展的重要表观遗传学原因之一。(2)CAA患者外周血DNA的HTRA4甲基化水平明显降低,HTRA4可能与CAA发病机制相关。

关键词： HES1   胚胎干细胞   肠类器官   上皮细胞   体外模型  

摘要： 背景与目的:Notch-HES1信号轴是细胞命运决定的主要调节通路,人类肠上皮连续发育过程中HES1的作用尚未阐明。体外多能干细胞向肠类器官诱导能够模拟人肠道发育的过程。本研究拟在构建h ESC向肠类器官诱导分化的基础上,比较HES1基因缺陷的人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,h ESCs)与野生型h ESCs向肠类器官诱导分化过程中的差异,探讨HES1在人类肠道上皮细胞早期发育中的作用。 方法:本研究采用定向诱导将人胚胎干细胞诱导分化为肠类器官,并以此为模型,通过显微观察、H&E染色比较HES1基因缺陷与野生型h ESCs在诱导分化过程中的形态变化;通过流式细胞术、免疫细胞化学、免疫组织化学、免疫荧光等技术检测肠类器官发育不同阶段相关标记物的差异;通过转录组测序分析比较HES1缺陷导致的肠类器官发育过程中基因表达差异。 结果:(1)h ESCs向肠类器官诱导分化过程中,细胞形态、表面标记与基因表达在限制性内胚层(Day3)、中后肠球(Day7)、类器官肠腔扩增(Day8-21)、类器官成熟(Day22-)几个关键阶段呈动态变化。(2)HES1基因缺陷组与野生型组h ESCs向限制性内胚层定向分化过程中,形态无明显差异,SOX17、CXCR4(CD184)双阳性细胞均达到约90%。(3)在形成中后肠球体的过程中,两组间形态学无明显差异,均表达E-cadherin,CDX2阳性细胞超过90%,CD90阳性细胞小于5%。(4)两组间在类器官肠腔扩增阶段Day14时,形态出现差异,野生型组肠类器官腺腔周围有较多的间质细胞,而缺陷组肠类器官腺腔周围零星散布较少的间质细胞,两组间具有统计学差异,P<0.001。在Day21,野生型组肠类器官上皮多为假复层上皮,而缺陷组肠类器官已经发育为单层柱状上皮。在Day21两组均可检测到Epcam阳性的上皮细胞、CDX2阳性的肠上皮细胞、Villin阳性的肠上皮细胞和MUC2阳性的杯状细胞。HES1缺陷组还可以检测到提早发育的Lysozyme阳性的潘氏细胞和CGA阳性的内分泌细胞。在这一阶段,存在566个差异表达基因,其中483个基因在缺陷型上调,83个基因下调。(5)HES1基因缺陷组在类器官成熟阶段,分泌型细胞显著增加,间质生长速率大于野生型组。在D56,两组间存在785个差异表达基因,其中686个基因在缺陷型上调,99个基因下调。 结论:(1)在h ESCs向限制性内胚层、中后肠球体分化阶段,HES1缺陷未造成明显的形态及关键表面标记物差异。(2)在肠类器官肠腔扩增阶段,HES1缺陷造成肠腔假复层上皮向单层柱状上皮发育提前,潘氏细胞和内分泌细胞发育提前。(3)在肠类器官诱导分化成熟阶段,HES1缺陷的肠类器官上皮倾向于分化为分泌型细胞。

关键词： 棉花转化   农杆菌转化法   杀虫蛋白Cry   害虫生物测定   转基因作物  

摘要： 转基因技术减少了农药的使用,对培育抗虫植物有很大帮助。本文报道了两种用于增强棉花抗咀嚼害虫的杀虫蛋白cry3Bb1和cry3的异源表达。杀虫蛋白cry3Bb1和cry3基因的载体构建通过人工合成并使用适当的调控元件,然后通过茎尖农杆菌侵染法转化Eagle-2基因型棉花受体。对棉籽脱绒后进行杀菌处理,其萌发指数为77.14%,转化效率为1.56%。主要研究结果如下: 1.将分离的胚与含有目的基因的农杆菌在Murashige Skoog培养基中进行共培养,在含潮霉素(25 mg/m L)的MS培养基上进行筛选,将筛选后存活的幼苗移入温室进行进一步生长和增殖。利用上述Cry基因侧翼引物,通过聚合酶链反应验证了转基因整合的成功。以GADPH为内参基因,采用q RT-PCR检测了转基因植株中目的基因的表达。相对表达倍数分析表明,该转基因在棉花M1植株中表达量最高,为4.5倍(Cry3+Cry3Bb1),其次为M3(表达倍数,3.0,Cry3Bb1)和M2(表达倍数,3.1,Cry3)。 2.将转基因植株接种于红蜘蛛和棉铃虫的侵染条件下,生物测定结果表明,红蜘蛛取食Cry3Bb1和Cry3转基因植株(M1转基因植株)的死亡率为60%,棉铃虫取食Cry3Bb1和Cry3转基因植株(M1转基因植株)的死亡率为75%。在只取食Cry3Bb1基因的M2转基因植株中,红蜘蛛的死亡率为40%,棉铃虫的死亡率为45%。在含有Cry3单基因的M3转基因植株中,红蜘蛛的死亡率为20%,棉铃虫的死亡率为30%。在非转基因的Eagle-2对照植株中几乎没有观察到害虫死亡。因此,本研究的转基因棉花对咀嚼害虫具有较好的抗性。 3.我们构建了一个包含两个Cry基因(Cry1Fa和Cry32Aa)和两个PME基因的表达盒(一个来自拟南芥At PME,另一个来自曲霉An PME),利用CAMV-35S启动子构建p CAMBIA1301植物表达载体,采用茎尖农杆菌介导的方法将该植物表达载体转化Eagle-2棉花品种,通过q PCR验证Cry基因和PME基因的表达。在非转基因棉花对照和Cry基因和PME基因转化植株中测量甲醇产量,结果显示只有Cry和PME转基因棉花植株能产生甲醇。 4.最后用表达Cry和PME基因的转基因棉花植株进行农业害虫生物测定,结果显示取食转基因棉花植株的棉铃虫Helicoverpaarmigera幼虫的死亡率为100%,取食转基因棉花植株的棉红铃虫Pectinophoragossypiella幼虫的死亡率为70%,取食转基因棉花植株的斑点棉铃虫Eariasfabia幼虫的死亡率为95%;相对比的,取食表达单一Cry转基因棉花植株的棉铃虫、棉红铃虫、斑点棉铃虫的死亡率分别为84%、49%和79%。 综上所述,***基因与PME基因联合,可以提高棉花对不同害虫的抗性能力。

关键词： 微生物燃料电池   基因工程   菌种选育   基因过表达菌株   光依赖性  

摘要： 微生物燃料电池（MFC）是一种电化学装置,在学术界受到了广泛的关注。产电微生物对有机物的降解代谢是MFC工作的基础,直接影响到MFC的性能。较低的性能效率限制了MFC的应用。本论文设计了产电微生物的基因工程和筛选获取新产电菌种两条技术路线,以期获得具有较高产电能力和较强有机物降解率的微生物,从而为提升MFC整体性能提供理论和技术支持。论文的主要研究结果如下: 1.本论文首先选取了葡萄糖代谢途径中的6种关键酶作为基因工程的靶点,以大肠杆菌（***）为底盘细胞,采用基因过表达的方法,分别构建了过表达pfk1、pfk2、pk1、pk2、cs和acs 6个野生型基因的***菌株,并各自建立了MFC装置。检测上述各装置的产电效果,结果表明,在5 g/L葡萄糖底物浓度时,PFK1菌株使MFC的开路电压峰值（98.06 m V）比对照组（25.9 m V）提高了278.61%,PK2菌株的开路电压峰值（147.14 m V）提高了468.11%。通过分析MFC装置的电功率密度同样可以看到基因过表达菌株产电能力的提升:PFK1菌株组的电功率密度（0.36μW/cm2）比对照组（0.14μW/cm2）提高了158.01%,PFK2菌株组（0.32μW/cm2）提高了130.87%,PK1菌株组（0.35μW/cm2）提高了153.83%,PK2菌株（0.27μW/cm2）提高了93.47%。基因过表达菌株对有机物的降解能力则通过分析阳极液COD值进行比较。结果发现,PK2菌株的有机物降解能力最强,其COD值比对照组降低了80.37%。因此,通过基因过表达手段促进葡萄糖的消耗,能够提高***的产电能力。 2.本论文采用过表达nad A基因的方式来促进***胞内NADH/NAD+的合成,并分析该基因过表达手段对***产电能力的影响。结果表明,在5 g/L天冬氨酸底物浓度时,过表达Nad A菌株组的开路电压峰值（70.81 m V）比对照组（15.22 m V）提高了365.24%,电功率密度（0.32μW/cm2）比对照组（0.26μW/cm2）提高了21.51%。由此可见,提高NAD+/NADH含量有助于增强***的产电能力。 3.以获得电化学性能优秀的产电微生物为目标,除了上述对已知的产电微生物进行基因过表达的方法,另一方法就是菌种选育,即从自然界中筛选获得新的微生物,并探究其在MFC中的表现。本论文使用BG11培养基,在光照条件下从湖水和淤泥中筛选获得7株具有明显光依赖性生长的菌株,经16S r RNA分子鉴定,分别属于微杆菌属、金芽孢杆菌属、根瘤菌属、费氏中华根瘤菌属、红细菌属和门多萨假单胞菌属。将这些菌株引入MFC的阴极室中,同时在阳极室培养***,观察MFC整体性能的情况。结果表明,门多萨假单胞菌属菌株LR134290能够较大幅度提高MFC的整体产电性能,在3 g/L葡萄糖底物浓度时开路电压峰值可达25.83 m V,比对照组的13.68m V提高了88.86%;电功率密度为0.622μW/cm2,比对照组的0.492μW/cm2提高了26.42%。随后检测发现,阴极室内的LR134290能够促进阳极室内***对有机物的降解,使其COD值降低到对照组的50.56%。如果将阳极室的微生物换成PFK2或Nad A等基因过表达菌株,LR134290同样能够提升MFC的整体产电性能。 获得电化学性能优异的产电微生物对提升MFC性能具有关键的作用。本论文采用基因工程和菌种选育两种技术路线,分别获得了多个新型微生物菌株。过表达糖代谢酶基因的***能够更高效地降解有机底物,提升MFC的开路电压和电功率密度;筛选获得的门多萨假单胞菌（Pseudomonas mendocina）,在MFC阴极室内能够发挥出对阳极室微生物代谢的促进作用,优化增强了MFC的产电性能。本论文的方法和结果为进一步改进MFC提供了有益的参考。