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关键词： 多环倍半萜   温敏型调控   紫穗槐-4   11-二烯   酿酒酵母  

摘要： 倍半萜类化合物是一类具有广泛应用的植物源天然产物,其碳链骨架由3个异戊二烯单元组成,多为具有15个碳原子的不饱和链状/环状烯烃。由于其特殊的分子结构和生理活性,目前被广泛应用于食品、医药、精细化工等行业。多环倍半萜是指分子中含有1个以上环状结构的倍半萜类化合物,由于其结构特殊性,常被用于药物、营养化学品、香料等高值化合物合成前体,如与青蒿素结构接近的紫穗槐-4,11-二烯,被用于青蒿素合成过程且受到广泛关注。但长期以来,由于其结构复杂性,多环倍半萜类化合物的生产方法主要以植物提取为主,但提取过程普遍需要消耗大量溶剂而易造成环境污染且提取产物多为混合物。因此,如何实现倍半萜类化合物高纯度绿色合成成为目前该方向的研究热点。生物合成具有专一性强、产品纯度高等特点。近年来,合成生物学技术的快速发展使异源表达生物合成途径成为天然产物高效合成的重要手段。因此,本研究以实现多环倍半萜类化合物高纯度绿色合成为目的,首先进行了适用于多环倍半萜合成的底盘菌株(BFSC0001)构建,并在该底盘中进行了多种倍半萜合酶表达验证,进一步地,针对具有重要应用前景的紫穗槐-4,11-二烯合酶表达进行了温度敏感型调控探索,研究取得的结果如下:(1)构建了1株强化甲羟戊酸途径的酿酒酵母底盘菌株。以具有内源甲羟戊酸(Mevalonate,MVA)途径的*** 113-5D酿酒酵母为出发菌株,敲除GAL80使其可利用廉价葡萄糖碳源,并完成MVA途径8个关键酶的过表达,增加了倍半萜前体供应,前体通量提高45倍。(2)完成了14种倍半萜合酶在所构建酿酒酵母底盘中表达,获得12种倍半萜产物并完成产物定性定量,其中紫穗槐-4,11-二烯摇瓶发酵产量为68 mg/L(出发菌株产量161倍)。为验证其倍半萜合成能力,本研究利用强化MVA途径的酿酒酵母为底盘菌株对具有重要潜在应用前景的14种倍半萜合酶进行了表达,选择不同来源、不同骨架结构的倍半萜合酶进行适应性发酵验证,通过GC-MS进行定性分析,并利用标准曲线法对倍半萜产物进行定量,为其后续应用菌株的构建奠定基础,其中,2.5 L发酵罐中紫穗槐-4,11-二烯产量可达1.3 g/L。(3)完成了紫穗槐-4,11-二烯合酶(Amorpha-4,11-diene synthase,ADS)表达温度敏感型调控策略探索,应用该策略可使发酵罐水平紫穗槐-4,11-二烯产量提高2倍。鉴于异源蛋白ADS的表达会干扰宿主细胞代谢,前体FPP和部分次级代谢产物的积累存在细胞毒性,影响细胞生长和蛋白表达,本研究选择突变体GAL4M9代替GAL4作为GAL系列启动子的调节因子,通过构建不同启动子的GAL4M9表达盒来平衡整体代谢通量,在不同温度模式下进行摇瓶发酵验证,发现30℃/26℃下BFSC0001Δ-p CYC1效果最好,96 h摇瓶紫穗槐-4,11-二烯产量达到216 mg/L,2.5 L发酵罐产量最终达到4 g/L,较单一温度发酵提升了2倍,实现了温度控制的两阶段发酵,减轻代谢负担的同时增加了产物的积累。综上,本研究构建了一株适用于多环倍半萜生产的强化MVA途径酿酒酵母底盘菌株,并在此基础上完成了14种倍半萜合酶表达,获得12种倍半萜产物并分别完成其定性定量表征,其中紫穗槐-4,11-二烯摇瓶发酵产量为68 mg/L(出发菌株产量161倍)。为进一步提高紫穗槐-4,11-二烯产量,论文探索了温度敏感型调控策略对倍半萜合酶表达影响,所构建的基于温敏型调控策略的酿酒酵母工程菌株,在30℃/26℃下可获得紫穗槐-4,11-二烯最高产量,2.5 L发酵罐产量可达4 g/L,较单一温度发酵提升了2倍,具有进一步应用推广的潜力。

关键词： 全基因组分析   亚单位疫苗   DNA核酸疫苗   联合免疫   保护效果  

摘要： 鸡传染性贫血(Chicken infectious anemia,CIA)是由鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV)引起的,以雏鸡再生障碍性贫血和全身性淋巴组织萎缩为主要特征的免疫抑制病。CIAV主要感染10-14日龄雏鸡,被感染的雏鸡极易发生其他病原继发感染和疫苗免疫失败,从而给养禽业造成巨大经济损失。近年来,我国鸡场中CIAV阳性率逐年升高。根据流行病学调查数据,CIAV已广泛存在于我国的各种类型鸡群中。疫苗免疫是防控该病的重要方式。然而,目前国外使用的CIAV弱毒疫苗毒力较强;虽然已有灭活疫苗、基因工程疫苗的研究报导,但存在生产成本高、保护效果不佳等缺陷。本研究首先对采集自山东省肉鸡鸡群的疑似CIAV病料进行了检测,并对分离到的33株毒株进行了全基因组测序分析;进一步制备了CIAV亚单位疫苗和DNA核酸疫苗,并对两种疫苗联合接种“Prime-boost”免疫策略的保护效果进行了评价。1.山东省部分地区肉鸡源CIAV分离鉴定与全基因组序列分析为了解山东地区肉鸡CIAV感染情况及毒株基因组特征,本研究于2020年1月至2021年9月采集山东省疑似发病的肉鸡组织样本进行PCR检测,结果发现所采集样品的CIAV阳性率为52.05%(38/73)。将阳性病料接种于MDCC-MSB1细胞,成功分离出33株CIAV。随后,对这33株病毒全基因组序列进行了测定和分析。结果表明,33株CIAV全基因组序列同源性为95.7%～99.3%,与Gen Bank参考株的同源性为95.3%～99.3%。33株CIAV的VP1核苷酸序列同源性为95.1%～99.8%,在VP1氨基酸序列共发现了35个氨基酸位点发生了替换。分离株VP1的第394位均为Q,推测这些分离株可能具有较强致病性。通过RDP4软件对可能存在的基因组重组现象进行预测,发现SD2014、SD2009、SD2103和SD2102这四个毒株存在基因重组。上述结果有助于深入了解CIAV流行株的分子流行病学特征和基因演变规律,提示我们有必要加强对CIAV的监测和防控。***亚单位疫苗和DNA核酸疫苗的制备与免疫效果检测为制备安全有效的CIAV疫苗、探索高效的免疫方式,本研究首先构建了原核表达质粒pET32-VP1和pET28-VP2,利用大肠杆菌表达系统分别诱导表达VP1重组蛋白和VP2重组蛋白,SDS-PAGE和Western blot试验验证表明重组蛋白成功表达。将两种蛋白按1:1混合,与弗氏完全佐剂混合后即为亚单位疫苗。随后,将CIAV VP1基因和VP2基因连入pBud CE 4.0双向表达载体,构建同时表达VP1和VP2的真核表达质粒pBud-VP1-VP2。将真核质粒转染到DF-1细胞,Western blot试验证实目的蛋白可以成功进行表达。将pBud-VP1-VP2质粒与脂质体混合后即为DNA核酸疫苗。根据文献报道,亚单位疫苗免疫虽然能刺激产生抗体,但很难诱发机体细胞免疫;核酸疫苗诱发的免疫应答更加全面,但对动物保护效果不佳。据此,我们探索了先接种DNA核酸疫苗、再接种亚单位疫苗的“Prime-boost”免疫方式。将60只1日龄SPF鸡随机分为4组,第1组在1、14日龄免疫DNA核酸疫苗;第2组在1、14日龄免疫亚单位疫苗;第3组在1日龄免疫DNA核酸疫苗、14日龄免疫亚单位疫苗;第4组在1、14日龄免疫空载体质粒。一免后每周采集血清,检测CIAV抗体滴度。结果发现,亚单位疫苗和DNA核酸疫苗均可诱发抗体免疫反应,而且二免2周后DNA-亚单位疫苗联合免疫所诱发的抗体水平最高。为了解疫苗免疫对细胞免疫功能的影响,通过淋巴细胞增殖试验测定各组脾脏淋巴细胞增殖反应。结果显示,三个疫苗免疫组的SI指数均高于对照组,且DNA-亚单位疫苗联合免疫组的SI指数显著高于单独免疫组(P<0.05)。利用VP1重组蛋白刺激各组淋巴细胞并用ELISA方法检测上清中IL-2、IL6和IFN-γ的含量,结果显示,三个疫苗接种组的IL-2、IL-4和IFN-γ水平显著升高(P<0.05),其中DNA-亚单位疫苗联合免疫组细胞因子表达水平最高。为进一步验证联合免疫的保护效果,进行了动物攻毒保护试验。将75只1日龄SPF鸡随机分为5组,分别为DNA核酸疫苗免疫组、亚单位疫苗免疫组、DNA-亚单位疫苗联合免疫组、攻毒对照组和空白对照组。1～4组在21日龄肌肉注射CIAV SD15野毒株,通过红细胞压积(Hct)、胸腺指数和血浆病毒载量评估疫苗保护效果。结果表明,未免疫CIAV攻毒组的Hct值和胸腺指数显著降低,而免疫组Hct值和胸腺指数均有所恢复,其中联合免疫组恢复最为显著。在攻毒后的第1、2周采血,通过荧光定量PCR方法检测病毒载量。结果显示,除

关键词： 普通小球藻   油脂   氮限制   氮饥饿   基因工程   遗传转化体系  

摘要： 目前,能源危机已引起全世界的广泛关注,因此,寻找经济环保、可再生的新型能源已经迫在眉睫。近年来,生物柴油作为一种可再生的能源物质,逐渐受到研究者的青睐。其中,微藻被认为是生产生物柴油的优质原料,越来越受到人们的关注。普通小球藻(Chlorella vulgaris)作为微藻中常见的藻种,具有良好的生产生物柴油的潜力。普通小球藻的油脂产率与培养条件(如氮调控等)密切相关,但藻细胞在氮调控下的形态和细胞组分变化等机制还并不是很清晰,亟需更好地理解氮调控条件下生长和油脂积累的机制。另外,还可以通过对藻种的油脂代谢途径进行基因工程改造来提高油脂产率。但是适用于该藻种高效稳定的遗传转化体系仍较少,亟需在该藻种中建立一个稳定的遗传转化体系,以便为日后通过遗传改良提高油脂积累量奠定基础。本研究首先筛选了具有良好产油潜力的优势富油普通小球藻,其次考察了其在不同的氮调控策略下的生长特性、细胞生化组分和形态变化,最后利用基因工程的方法在藻株中建立了一个基于新型筛选标记的稳定遗传转化体系。本研究的主要结果如下:(1)考察了 6 株普通小球藻 GF-4、FACHB-8、FACHB-31、FACHB-1068、FACHB-1072及FACHB-1227在相同条件下的生长动力学特性、光合色素浓度、油脂生成情况,发现FACHB-1068的菌体干重、菌体产率和比生长速率、对数期的叶绿素a和类胡萝卜素浓度、油脂含量和产率均高于其他5株藻。当培养结束时,其生物量、油脂含量和油脂产率分别高达2.23 g/L、28.07%和46.38 mg L-1d-1。最终选择FACHB-1068作为优势出发藻株,进行后续试验的研究。并使用ITS法对该藻株进行了鉴定,发现其属于普通小球藻(***)。(2)探究了普通小球藻FACHB-1068在不同氮调控策略(氮限制和氮饥饿条件)下的生长特性、细胞生化组分变化和细胞形态变化。结果表明,一定程度的氮限制(硝酸盐浓度低于21.66 mg/L)和氮饥饿培养能够增加藻细胞内的脂质含量,但普遍降低了菌体产率、光合色素浓度和蛋白质含量。与氮限制法相比,氮饥饿3d的方法在提高油脂积累方面更胜一筹。氮饥饿对藻细胞的形态变化有明显的影响,会导致脂质体和淀粉粒的数量和总体积增加。脂肪酸分析表明,饱和脂肪酸(C-16:0,C-20:0和C-18:0)是总脂肪酸的主要成分(>80%)。本研究将有助于更好地理解微藻在氮胁迫下的生化组分变化和形态变化,同时可为富油微藻油脂产率的提高提供思路。(3)考察了藻细胞对4种抗生素的敏感性,发现藻细胞对巴龙霉素高度敏感,30μg/mL的巴龙霉素即可完全抑制藻细胞的生长。因此选择巴龙霉素作为抗性筛选剂,其所对应AphⅧ基因作为本研究中的筛选标记基因,进而在该藻株中建立了一个基于AphⅧ基因的新型筛选标记。另外,通过PEG法将筛选标记AphⅧ基因及报告基因Venus基因转化至普通小球藻中,PCR和southern杂交法证明其已成功整合到基因组DNA上,荧光观察发现Venus在藻细胞的细胞质中可表达出黄色的荧光。经传代3次,遗传稳定性良好。至此,在该藻株中成功构建了一个稳定的遗传转化体系,可为今后进一步通过基因工程方法提高油脂产量奠定基础。

关键词： 胚胎干细胞   Snap29   自噬   自我更新   分化潜能  

摘要： 胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)的两大特点是自我更新和多潜能分化,在临床上具有广阔的应用前景,随着研究进程的深入,ESCs有望成为再生医学、细胞农业的供体细胞来源。多能性转录调控网络的核心部分由转录因子Oct4、Sox2和Nanog组成。ESCs在添加生长因子的培养基中培养。生长因子通过影响多潜能转录调控网络,调节ESCs的自我更新和分化。自噬是真核细胞中一个由溶酶体介导的高度保守分解代谢过程,满足细胞对代谢物和能量的需求。自噬能够清除有错误折叠或聚集倾向的蛋白和受损的细胞器,是维持细胞内稳态的关键过程。 以往的研究报道了自噬体形成阶段的关键因子ATG3、ULK1等在小鼠ESCs(mESCs)多能性维持中起到至关重要的作用,但是介导自噬体和溶酶体融合的SNARE蛋白,包括Vamp8、Stx17、Snap29,对mESCs多能性的调节作用和分子机制未有报道。Snap29在介导自噬体与溶酶体融合的SNARE复合物形成中起到关键作用,不论是Stx17-Snap29-Vamp8复合物还是YKT6-Snap29-Stx7复合物,Snap29都作为QbcSNARE参与此过程。Snap29在mESCs中调节自噬流,调控自我更新能力和多能性维持的作用尚不清楚。 针对以上问题,本研究拟通过CRISPR/Cas9技术构建自噬特异性SNARE基因Snap29敲除的mESCs细胞系,对细胞的自噬水平、多能性调控网络和发育潜能进行检测。同时,通过转录组分析探究Snap29调节多能性的分子机制。实验过程中的检测方法为实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹、免疫荧光等。 本研究实验结果表明: (1)稳定敲除Snap29的mESCs细胞系中多能性因子Oct4、Nanog、Sox2等的表达量无显著性变化。Snap29缺失不影响mESCs的自我更新能力。 (2)Snap29在mESCs分化中起到重要作用。敲除Snap29导致mESCs分化出肌肉谱系细胞的概率增大,拟胚体直径增大。综上,Snap29参与调节mESCs的分化进程。 (3)转录组分析表明敲除Snap29的mESCs分化后,心肌分化相关的基因表达量显著升高,大多数上调的差异基因富集到了心肌收缩、横纹肌收缩、肌管分化调节等在内的肌肉形成相关通路。缺失Snap29改变了mESCs的分化潜能。 (4)敲除Snap29后mESC中自噬水平没有显著变化,不会阻断mESCs自噬流。在敲除Snap29的mESCs中敲低Snap47会导致p62和LC3Ⅱ型积累,表明Snap47是潜在的代替Snap29参与SNARE复合物形成的QbcSNARE。 综上,通过CRISPR/Cas9建立稳定敲除Snap29的mESCs细胞系后发现,敲除Snap29不会导致mESCs多能性的丧失,不改变多能性基因和蛋白的表达。但Snap29的缺失会促进分化过程中向肌肉谱系细胞的分化。敲除Snap29不能阻断mESCs的自噬,我们推测Snap47作为Qbc-SNARE参与自噬体与溶酶体的融合。接下来的研究工作应当聚焦在Snap29为何在mESCs中不能显著调节自噬,mESCs中可能存在独特的自噬调节机制,参与这个过程的关键因子以及作用机制需要我们进一步的探索。

关键词： KDM5A   心脏发育   心肌致密化不全   胚胎干细胞   心肌分化  

摘要： 背景和目的先天性心脏病(Congenital heart disease,CHD)是在胚胎发育时期由于心脏和大血管形成障碍或发育缺陷而诱发的先天性疾病,除解剖结构异常外,也伴随着心脏发育相关基因表达的异常。作为哺乳动物发育过程中首个形成的功能性器官,心脏由中胚层衍生而来,其前侧板中胚层的区域一旦受到向心肌特异分化的“指令”,则形成新月形生心区(Cardiac crescent)。随后生心区发育成直心管,直心管继续延长并向右扭转,由此形成原始心房心室,在此基础上,具有四个腔室的心脏和传导系统得以形成。这一过程中心脏特异转录因子NKX2.5(NK2homeobox 5)、GATA4(GATA binding protein 4)、MEF2C(Myocyte enhancer factor 2C)和TBX5(T-box 5)等发挥重要的调节作用,同时表观遗传修饰如DNA甲基化和去甲基化、组蛋白甲基化、泛素化、乙酰化以及非编码RNA等也在精确地调控心脏相关基因的表达,影响心脏发育。研究表明,组蛋白修饰与心脏相关基因表达的调控密不可分。其中,组蛋白H3赖氨酸甲基化修饰能够通过改变染色质结构的紧密或疏松状态,调控基因的激活或沉默,而组蛋白甲基化修饰主要是由组蛋白甲基转移酶和去甲基化酶调控。其中,组蛋白去甲基化酶KDM5C(Lysine-specific histone demethylase 5C,KDM5C)和KDM5D能与心脏相关转录因子相互作用进而影响心脏发育。目前,KDM5A作为KDM5C、KDM5D同一家族的成员之一,其研究主要集中在肿瘤领域,而在心脏发育中的功能尚未阐明,鉴于此,开展了本课题的研究。本课题旨在探索组蛋白去甲基化酶KDM5A在小鼠心脏发育过程中发挥的作用及机制,以期为先天性心脏病的防治提供新的思路及靶点。方法1分析敲除KDM5A对小鼠心脏发育的影响选取适龄KDM5A+/-杂合子小鼠进行交配,获得E12.5(Embryonic12.5)和E15.5天的KDM5A+/-杂合子和同窝野生型(KDM5A+/+)小鼠胚胎。通过马松染色观察两组小鼠胚胎心脏形态,并提取胚胎心脏RNA,通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR)验证KDM5A在两组心脏中的表达。2分析胚胎期小鼠心脏中KDM5A对心肌细胞增殖能力的影响在KDM5A+/-杂合子和野生型小鼠胚胎心肌细胞中,通过q RT-PCR检测Cdkn2b(Cyclin dependent kinase inhibitor 2B)的表达水平;免疫组化检测p H3(Phosphorylated histone H3)和细胞周期蛋白cyclin D1的表达水平。3分析KDM5A在小鼠心脏发育过程中的分子机制在KDM5A+/-杂合子和野生型小鼠胚胎心脏中,通过免疫组化检测H3K4me2和H3K4me3的水平,以及心脏发育重要转录因子GATA4的表达。4分析KDM5A对小鼠胚胎干细胞E14TG2a向心肌细胞分化的影响构建稳定敲除KDM5A的E14TG2a细胞株,随后诱导其向心肌细胞分化,以未敲除的E14TG2a细胞作为对照,分析敲除KDM5A对E14TG2a细胞向心肌细胞分化的影响。5分析KDM5A在E14TG2a细胞向心肌细胞分化中的分子机制qRT-PCR检测向心肌细胞分化中KDM5A敲除组和对照组在第2、4、10天中内胚层和中胚层标志物以及心脏特异性基因的表达。结果1在E12.5和E15.5天,KDM5A+/-杂合子小鼠胚胎心脏呈现发育迟缓和心室壁变薄的现象,并且在E15.5天,KDM5A+/-杂合子小鼠胚胎体型明显小于同窝野生型(KDM5A+/+)胚胎。2 KDM5A+/-杂合子小鼠胚胎心肌细胞中pH3和cyclin D1的表达量减少,而Cdkn2b上调。3 KDM5A+/-杂合子小鼠胚胎心肌细胞中H3K4me2水平未发生明显变化,而H3K4me3水平明显增高,心脏发育重要转录因子GATA4的表达水平降低。4在E14TG2a细胞向心肌细胞分化过程中,如果敲除KDM5A则导致分化过程受到抑制。5 KDM5A敲除后,与对照组相比,在诱导分化第2天,GATA4和GATA6表达水平降低,内胚层特异基因SOX7(SRY-Box transcription factor 7)表达水平降低;第4天,中胚层标志物Brachyury和Bmp7(Bone morphogenetic protein 7)表达水平降低,内胚层特异基因SOX7表达水平增高,WNT信号通路中重要蛋白Wnt3(Wingless-type MMTV integration site family,member 3)表达水平降低。结论1在小鼠胚胎发育过程中,组蛋白去甲基化酶KDM

关键词： 第三代DNA测序   纠错算法   测序数据纠错结果评估   深度学习   卷积神经网络  

摘要： 基因测序是人类了解遗传信息的主要手段,在癌症研究、遗传性疾病检测以及传染病防治等领域发挥重要作用。第三代基因测序技术具有读段长、测序区域均匀、成本低以及高通量的优点,因此被广泛的应用于基因组和转录组研究中。然而,这种技术的固有缺陷在于它产生的结果存在极高的错误率,通常会达到6-15%,严重影响如测序读段在参考基因组上的定位以及基因序列组装等下游分析。目前已有许多采用计算性的方法降低数据错误率的手段,根据是否使用额外的二代测序数据分成混合校正策略和自校正策略两种。其中,自校正策略无需额外的二代测序,具有更好的易用性。这些自校正方法虽然使用的算法原理不同,但本质上都只使用单个位置上碱基出现的频率进行校正,没有利用序列前后的关联信息,因此较为依赖输入的数据量,在低测序深度时效果不佳。同时,由于对计算资源要求很高,大部分方法对大型基因组测序数据纠错的计算需求无法负荷。针对以上不足,本文针对如何将深度学习应用于第三代DNA测序数据的自校正展开了深入的研究。首先从开源项目和公共数据库全面收集数据,制作了大肠杆菌、酿酒酵母、黑腹果蝇、拟南芥和人类五个物种的数据集。其次,分析数据集的读段长度和错误类型比例,确定纠错任务的重点目标为长度小于30000bp的读段上的插入和删除两种类型的错误。然后,考虑到DNA测序数据纠错任务与传统深度学习任务的评价标准区别较大,本文提出了一种对纠错结果的自动化评估方法。该评估方法从纠错性能、资源需求和下游应用三个方向考虑,包含了十个评价指标,最终实现为一个开源软件,命名为LoRSCA(Long Reads Self-Correction Assess)。接着提出了一种序列编码方法,综合碱基序列、测序质量和比对质量三种数据信息,将一维序列数据编码成尺寸为21*4*3的二维图像,以便模型进行特征提取。最后,构建了一个基于多任务学习的卷积神经网络,命名为DeepSC,采用多分支卷积和跳层连接的设计思想,用于解决三代测序的自纠错问题。在与现有的十种纠错算法的比较评估中,DeepSC成为仅有的四个能在人类基因组上顺利运行的算法之一,并在低测序深度情况下在所有五个物种上取得了敏感度、输出深度和基因组覆盖率的领先。本文将深度学习方法引入处理三代DNA测序数据纠错问题,改善了计算性方法在低测序深度数据上的纠错性能,为未来的纠错算法设计提供新思路。

关键词： 胚胎干细胞   含溴结构域蛋白   染色质免疫沉淀测序   免疫共沉淀-质谱  

摘要： 组蛋白乙酰化是研究最为广泛的组蛋白翻译后修饰之一，它能够减弱与带负电荷的DNA的静电作用，放松染色质紧密的结构，促进与各种染色体相关蛋白的结合。含溴结构域(Bromodomain，BrD)蛋白能够识别组蛋白乙酰化赖氨酸残基位点，该性质使含BrD蛋白在调节蛋白质-蛋白质相互作用中发挥重要的功能，包括介导染色质的转录激活，DNA的复制与修复等。因含BrD蛋白家族的转录调控功能，使它们成为多种癌症与炎症治疗中的靶蛋白，BET蛋白家族（含BrD蛋白家族中的一类）的抑制剂JQ1，已被验证拥有很好的疗效。截止至2022年3月，全球已有约30个与含BrD蛋白相关的临床试验正在进行中。虽然，已有多个独立研究对含BrD蛋白在多个领域进行了功能探索，特别是对BRD4，EP300和TRIM28等蛋白的功能研究，但是至今尚未有在功能层面上，系统性地解析整个含BrD蛋白家族功能的研究。含BrD蛋白的数量较多，人类基因组中有46个含BrD蛋白，小鼠基因组中有39个含BrD蛋白，这对系统性实验所需的抗体是一个挑战。为了解决这个问题，基于小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞与CRISPR-Cas9基因编辑技术，本研究对小鼠中39个含BrD蛋白的内源性编码基因进行编辑，构建了39个带有HA标签的小鼠胚胎干细胞。基于带有HA标签的小鼠胚胎干细胞进行了染色质免疫沉淀测序与免疫共沉淀-质谱实验，并创造了多种计算方法，包括基于多蛋白结合位点的非负矩阵分解聚类和高置信度蛋白质-蛋白质相互作用的网络分析等。本研究得到了多个结论，包括但不限于含BrD蛋白在基因组上的结合位置可分为4类且各类功能不同;发现了多个与含BrD蛋白共定位的染色体相关蛋白，如TFE3蛋白与多个含BrD蛋白在端粒上存在相同的结合基序;构建了含BrD蛋白的高置信度蛋白质-蛋白质相互作用网络;描绘了与多个含BrD蛋白同时存在相互作用的“伙伴”蛋白;计算了“伙伴”蛋白和含BrD蛋白的内在无序序列比例并对其液-液相分离能力进行了预测;搭建了基于本研究数据的查询网站以支持含BrD蛋白的功能研究。这是第一次从蛋白质-核酸相互作用与蛋白质-蛋白质相互作用去系统性地揭示整个含BrD蛋白家族在小鼠胚胎干细胞中的功能。对于未来更大规模的蛋白质功能研究，本项目提供了一定的支撑作用。

关键词： 小鼠胚胎干细胞   Rif1   胚层分化   组蛋白修饰   ERK1/2  

摘要： 研究背景与目的:对多能干细胞的应用取决于我们对其分化过程中分子机制的理解,正常胚胎在分化发育过程中,必须经过谱系特异性分化使内细胞团细胞分化为三个胚层:中胚层、内胚层、外胚层,三胚层的特化是早期发育过程中的关键过程。小鼠胚胎干细胞来源于囊胚期的内细胞团,具有多能性(pluripotency)和自我更新(self-renewal)的特性,因其具有开放的染色质结构,自我更新和分化能力受到组蛋白修饰和染色质重塑的调节。Rif1(RAP1 interacting factor 1)最早在出芽酵母中被鉴定为是一种负调控端粒长度的端粒相关蛋白。在哺乳动物中,Rif1除了调节端粒长度稳态,还指导DNA双链断裂损伤修复方式选择,抑制断裂后直接切除修复,促进G1期非同源末端重组(NHEJ),并且通过结合G4-四链体和3D染色质的变化参与复制时序(Replication Timing)程序的全局调节。Rif1在体内早期发育阶段胚胎及体外小鼠胚胎干细胞中高表达,但在成体分化完全的细胞中除生殖细胞外几乎不表达。此外,在小鼠体内Rif1缺失会导致小鼠胚胎致死,这表明Rif1对调控早期胚胎发育至关重要,但Rif1是否调控小鼠胚胎干细胞(mESCs)的早期分化及其机制尚不清楚。本研究旨在了解Rif1在胚胎干细胞胚层分化过程中的作用及其分子机制,为在发育研究、疾病模型、药物筛选、再生医学等方面的应用奠定基础。研究方法:首先构建可稳定诱导敲除Rif1的小鼠胚胎干细胞系,接着通过实时荧光定量逆转录酶聚合酶链反应(RT-qPCR)、免疫荧光(Immunofluorescence,IF)、蛋白质印迹法(Western blot)、流式细胞荧光分选技术(FACS)等检测Rif1缺失小鼠胚胎干细胞(mESCs)多能性、细胞周期进程及增殖能力的变化;其次采用拟胚体作为mESCs体外分化的模型,检测mESCs分化的不同时间点D2、D4、D6胚层特异性基因的表达;接着以畸胎瘤作为mESCs体内分化的模型,病理切片染色观察三胚层结构的发育情况;然后提取Rif1敲除和对照组mESCs的RNA,通过RNA高通量测序(RNA-Seq)的方法确定哪些基因的表达受到Rif1缺失的影响,并分析已经发表的细胞分化关键信号通路成员ERK1/2,将ERK1/2和Rif1缺失的RNA-seq数据进行比对,观察它们影响基因表达变化的相似性;利用RIF1抗体进行染色质免疫共沉淀伴随高通量测序(ChIP-Seq)实验,确定RIF1直接结合的基因,结合RNA-seq数据分析出RIF1直接结合并且表达量受到Rif1缺失影响的基因,预测RIF1下游靶基因的功能分类和下游生物学行为;最后,分析已发表野生型mESCs的H3K27甲基转移酶EZH2、ERK2以及Rif1敲除和对照组组蛋白H3第27位赖氨酸上三甲基化(H3K27me3)ChIP-Seq数据,观察它们在基因组的结合位点的相似性以及Rif1缺失导致哪些基因H3K27me3结合峰值发生变化,明确RIF1是否通过调控组蛋白甲基化修饰控制分化相关基因的表达,通过RIF1抗体免疫共沉淀(co-IP)实验明确RIF1是通过EZH2调控H3K27me3进而控制基因表达,对于中内胚层特异性基因,通过染色质免疫共沉淀定量PCR(ChIP-qPCR)验证ChIP-seq的结果,确定EZH2、H3K27me3、p-ERK1/2在这些基因上结合情况的变化。研究结果:利用CRISPR基因编辑技术建立稳定的条件性Rif1敲除的小鼠胚胎干细胞系,mESCs敲除Rif1后多能性基因Oct4、Esrrb、Klf2、Sox2的表达降低,细胞周期G1/S的转变受到抑制,增殖能力减弱,证明Rif1对于维持mESCs的多能性及自我更新至关重要;RNA-seq结果显示,Rif1敲除后表达上调的基因显著富集到与细胞分化及发育相关的过程和信号通路,表达下调的基因主要富集到细胞周期相关的过程,与我们观察到的表型结果一致。利用拟胚体、LIF withdraw和视黄酸(Retinoic acid,RA)诱导三种体外分化模型显示随着分化的进程,Rif1表达逐渐降低,提示Rif1与细胞分化发育高度相关;体外拟胚体自由分化的过程中检测Rif1敲除后胚层特异性基因的表达,发现内胚层特异性基因Sox17、Foxa2,外胚层特异性基因Foxf1、GSC、Mixl1、T表达量显著升高(P<0.05),体内畸胎瘤模型H&E染色结果也显示Rif1缺失促进中内胚层分化。为了确定Rif1直接下游靶基因,我们联合分析mESCs中RIF1的染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)与RNA-seq数据,结果表明,发现RIF1通过直接结合到分化相关基因的启动子区域,抑制其基因表达。RIF1、EZH2、H3K27me3在基因组中存在广泛的

关键词： 组蛋白H1   表观遗传调控   染色质重塑   染色质高级结构   核小体与组蛋白修饰  

摘要： 高活动性蛋白家族(High mobility group,HMG)在基因组上分布很广。HMGA1是HMG家族中三个主要分支之一,主要特征是具有AT-hook结构域。前人研究提示,HMGA1对染色质状态与高级结构有潜在的调控作用,但具体机制尚不清楚。而且,HMGA1在人类细胞基因组中的结合图谱也未见报道。因此,绘制人类基因组中HMGA1的结合图谱,并探明其对染色质状态与高级结构的调控机制具有重要意义。我们前期在CRISPR-Cas9的大规模基因负向筛选实验结果中发现,HMGA1敲除可促进人胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)向神经外胚层细胞分化。同时,HMGA1在人ESC中的表达水平显著高于分化后细胞。这暗示HMGA1对人ESC全能性与分化潜能有重要作用。因此,本课题以胚胎干细胞为研究材料,揭示HMGA1对染色质状态与高级结构的调控作用及内在机制。 通过Ch IP-seq测定HMGA1的DNA靶点后,我们绘制人ESC中全基因组HMGA1结合图谱,总结HMGA1的基因组结合特征。结果发现,HMGA1对于基因组AT碱基富集的区域具有极强的偏好性。在HMGA1敲降后,也是在这些基因组AT碱基富集的区域,HMGA1结合信号显著地下降。 为深入研究HMGA1对染色质状态的调控作用,我们比较HMGA1敲降前后染色质可及性与核小体占有(Occupancy)变化。结果发现,HMGA1敲降后,染色质开放程度下降并伴随核小体占有的增加,提示HMGA1的敲降会造成染色质压缩变紧。通过比较HMGA1敲降前后关键组蛋白修饰信号变化,发现HMGA1敲降后,全局上H3K27me3信号上升,而H3K27ac、H3K36me3与H3K36me2信号下降,且均是在基因组AT碱基富集的区域变化更显著,最终它们共同营造出相对沉默的染色质环境助推染色质压缩变紧。此外,为聚焦研究HMGA1对基因表达调控的作用,我们还着重观察HMGA1敲降前后基因区的局部染色质状态变化。结果发现,HMGA1敲降后造成HMGA1、RNA Pol II与CTCF在启动区的结合下降,染色质开放性同步减弱,并伴随活跃型修饰(H3K4me3和H3K9ac)的下降和抑制型修饰(H3K27me3)的上升,从而阻碍基因正常表达。 接着探索HMGA1对染色质高级结构的调控作用,通过分析HMGA1敲降前后Hi C-seq数据,发现HMGA1敲降后,染色体内部互作增加而染色体间互作减少,而且近距离互作频率升高,远距离互作频率变化不大,这与前文所述染色质压缩变紧的结论一致。此外,在HMGA1敲降后,A区室内部及之间的互作显著增加,而B区室的情况则相反。 最后为揭示HMGA1调控染色质状态与高级结构的内在机制,基于文献报道的HMGA1与H1之间的潜在竞争关系,我们重点研究HMGA1与H1.2和H1.4在基因组上结合分布之间的关系。我们首次绘制出人ESC中H1.2和H1.4的全基因组结合图谱。令人惊讶的是,HMGA1与H1.4在基因组上的结合分布呈现互斥关系,而与H1.2则相互重叠。同时还发现与HMGA1类似,H1.2偏好结合在高AT含量区域,而H1.4则相反。在HMGA1敲降后,H1.2结合位点与强度基本没变化;但H1.4在基因组上的结合分布发生剧烈变化,丧失对基因组序列的结合偏好,其中H1.4结合信号主要在高AT含量区域升高。这表明,H1.2对DNA的结合偏好可能与HMGA1无关,而H1.4则受HMGA1调控。深入分析发现,B区室AT含量高,缺失SINE(Alu)序列,富含HMGA1结合,缺失H1.4;A区室情况则相反。有意思的是,在HMGA1敲降后,B区室H1.4结合信号显著升高,并伴有核小体占有增加,而H1.2变化不大;H3K27me3信号上升,而H3K27ac、H3K36me3与H3K36me2信号下降。这些结果表明,HMGA1偏好结合在高AT含量区域,阻碍H1.4结合,维持该区域特定的组蛋白修饰组成、核小体占有与染色质可及性,以此为基础调控染色质A/B区室内高级结构。 综上所述,本课题绘制出首个人ESC中HMGA1全基因组结合图谱,并总结其特征;阐述HMGA1敲降后,染色质状态和高级结构的变化;揭示HMGA1对染色质状态和高级结构的调控机制。本研究结果为深入研究HMGA1功能提供丰富的数据资源和理论依据。