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关键词： 胚胎干细胞   自我更新   转录因子   基因表达   细胞自噬  

摘要： 小鼠胚胎干细胞(MouseEmbryonicStemCells,mESCs)有两种独特的生物学特性:自我更新和细胞多能性。为了确保mESCs的干性状态，研究人员可以采用两种不同的体外培养方法:一种是使用添加了2i的无血清培养基，另一种是使用含有白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor,LIF)的血清培养基。目前，国内外科研学者对mESCs的体外培养和基础研究已取得了一定研究成果，但是其他哺乳动物ESCs的体外技术仍然存在着巨大的挑战。解析ESCs干细胞维持关键基因的作用机制是解决这一问题的途径之一。转录因子Tfcp211已经被证实与ESCs自我更新密切相关，其在干细胞中高表达，过表达Tfcp211可以有效地促进ESCs干性的维持，已成为鉴定干细胞的标志基因之一。前期本团队成员已初步证明Tfcp2l1能够激活Esrrb或抑制Lef1等下游基因的表达来促进ESCs未分化状态的维持，但其下游调控网络和机制还有待深入地研究。　　本文通过PiggyBac(PB)载体构建一个过表达Tfcp2l1基因的质粒，将其转染到小鼠46CmESCs中，收集细胞进行转录组高通量测序，并将测序结果与Tfcp2l1的染色质免疫共沉淀测序结果进行联合分析,以筛选Tfcp2l1直接调控的靶基因。KEGG和GO分析显示Tfcp2l1的下游基因主要富集在与干细胞多能性的相关的调控通路，其中Tfeb被报告在mESCs干性的维持中可能发挥重要功能，因此本研究首先重点检测Tfeb与Tfcp2l1之间的关联。本研究在Tfcp2l1过表达的细胞中检测Tfeb的表达，发现后者的表达量显著增加了。相反，当使用pLKO.1慢病毒载体系统下调Tfcp2l1表达时，Tfeb的表达也降低了。而过表达和干扰Tfeb的表达，Tfcp2l1的转录并未发生改变。接着，本文在撤LIF的小鼠46CmESCs中加入LIF处理1小时和12小时，结果显示Tfcp2l1和Tfeb的表达趋势相似，可是当下调Tfcp2l1表达时，发现LIF并不能提高Tfeb的转录。以上结果说明LIF部分通过Tfcp2l1诱导Tfeb的表达。以上数据表明Tfeb是Tfcp2l1的直接下游靶基因。　　为了检测Tfeb是否可以调控Tfcp2l1促进mESCs自我更新的能力，首先本研究在无LIF存在的条件下，对培养8天的Tfeb过表达细胞株(PB-Tfeb)进行了碱性磷酸酶(AP)染色，结果显示PB-Tfeb细胞具有较高的AP活性，而PB转染的对照组细胞却分化了。同样，免疫荧光染色(IF)显示PB-Tfeb细胞高表达自我更新标志基因Klf4。以上数据表明Tfeb具有和Tfcp2l1类似的促进mESCs自我更新的功能。接着，本研究过表达Tfcp2l1的mESCs中干扰Tfeb表达，发现该细胞的边缘出现了分化，AP活性降低，低表达Klf4。表明敲低Tfeb会削弱Tfcp2l1促进mESCs自我更新的作用。　　由于Tfeb是细胞自噬的一个重要调控基因，因此在mESCs中过表达Tfeb后自噬的标志蛋白LC3A/B蛋白水平增强，而敲低Tfeb则会下调LC3A/B的蛋白水平降低。于是本文推测Tfcp2l1可能调控自噬的发生，为了验证此假设，本研究首先检测了过表达Tfcp2l1的mESCs在饥饿的条件下发生自噬情况，结果显示，与对照组PB细胞相比，PB-Tfcp2l1中的自噬标记蛋白LC3A/B的表达量显著减少，溶酶体探针的荧光强度降低了，线粒体探针荧光并未明显降低，Tfeb表达量也没有明显变化。以上数据表明Tfcp2l1负调控自噬发生，但并不是通过诱导Tfeb的。　　综上所述，本文的研究结果证明了Tfeb是Tfcp2l1的直接下游靶基因，其可以部分调控Tfcp2l1促进mESCs自我更新的功能;同时，本文还发现Tfcp2l1负调控自噬发生。本文的研究结果丰富了Tfcp2l1作用的调控网络，使科研人员对干细胞多能性的认识更加全面。

关键词： 小鼠胚胎干细胞   DPF2因子   神经外胚层   Wnt/β-catenin信号通路   TGF-β/Nodal信号通路  

摘要： 小鼠胚胎干细胞(mouse Embryonic Stem Cells,mESCs)在适当的培养条件下,可以在体外定向分化成神经干细胞。BAF染色质重塑复合物DPF2因子在早期神经发生过程中发挥重要作用,但具体的分子机制还不明确。为了解决这一问题,本课题利用Dpf2条件性敲除的mESCs,通过改进一种体外定向诱导神经分化的无血清培养体系,并结合拟胚体分化实验,验证Dpf2缺失会促进mESCs向神经外胚层进行分化。我们发现 Dpf2 缺失导致Bmp4(Bone morphogenetic protein 4,Bmp4)和Rest(Repressor element 1 silencing transcription factor,Rest)的下调是Dpf2缺失引起神经分化的必要条件;进一步研究发现在分化的mESCs中,诱导敲除Dpf2会导致β-catenin与SMAD2在神经外胚层标志基因启动子位点的结合增加,在Dpf2 KO mESCs分别过表达Bmp4与Rest会导致β-catenin与SMAD2在神经外胚层标志基因位点的结合减少;此外,我们发现在Dpf2 KO mESCs和分化的Dpf2 KO mESCs中TGF-β/Nodal信号通路的靶基因及编码TGF-β(Transforming growth factor-β)配体与受体基因的表达显著上调,说明Dpf2缺失通过调控TGF-β/Nodal信号通路促进神经分化;最后,本研究发现,Dpf2缺失会上调神经源性因子Oct6(Octamer-binding transcription factor 6,Oct6)的表达,进一步研究,我们发现Oct6通过调控Wnt/β-catenin信号通路活性促进神经发生。总之,该研究证明,DPF2与BAF复合物的核心亚基BRG1、神经因子REST、OCT6 及 Wnt/β-catenin 信号通路关键指标β-catenin、TGF-β/Nodal 信号通路的 SMAD2形成一个复合物,共同调控mESCs的神经分化;同时,这些组分之间也可以形成环路相互调控。例如,当敲除Dpf2后,可以通过直接调控Wnt/β-catenin与TGF-β/Nodal信号通路,促进mESCs向神经外胚层进行分化;此外,通过间接调控下调Bmp4、Rest的表达进而调控上述通路促进神经分化;最后,当敲除Dpf2后,通过上调Oct6的表达,也可以调控Wnt/β-catenin信号通路,从而促进mESCs的神经分化。该研究揭示了 BAF染色质重塑复合物DPF2因子调控mESCs向神经外胚层进行分化的分子机理,阐述了细胞内早期神经发生过程中信号通路参与的复杂网络调控,为了解早期神经发生过程中的分子机制提供了新的视角。

关键词： 黄原胶   xanK   菌黄素   野油菜黄单胞菌   基因工程  

摘要： 菌黄素的存在使得野油菜黄单胞菌产生的黄原胶发酵液呈现黄色,并显著影响了黄原胶的性状、产量及提取工艺。研究过程中得到一株自然突变的不产生菌黄素的黄原胶生产菌株XW,测序发现该菌株xanK基因的一处碱基突变使相应编码的天冬氨酸突变为甘氨酸。为探究xanK基因突变对菌黄素合成的影响,通过回补试验将野生型菌株的xanK基因导入到突变菌株中,发现突变菌株的菌黄素合成恢复,说明该突变导致菌黄素合成受阻。此外,对两种黄原胶产物进行分析,结果显示突变菌株产生的黄原胶在黏度和丙酮酸含量上均高于野生型菌株,而分子量和乙酰基含量要低于野生型菌株,说明菌黄素对黄原胶的合成可能具有复杂的影响。

关键词： 转基因   转基因作物   安全种植   法规保护  

摘要： 本研究分析了中国转基因农作物种植监管法规体系中,存在转基因农作物种植监管法规体系不完善、监管法规规范性不足、监管部门职责不明确等显著问题,针对性地提出了通过完善转基因农作物种植监管法规制度、规范转基因农作物种植科学监管理念、明确设立转基因农作物种植监管机构的优化策略,以期更好地部署转基因农作物种植的监管工作,为依法种植转基因农作物提供法规保护。

关键词： 人类基因组计划   精准医疗   基因组学   基因治疗   公共卫生  

摘要： 近几十年来,伴随着基因组学研究的巨大进步与发展,生物医学领域也随之出现巨大转变,诸多以个体化精准医疗实践为出发点,对基于基因检测、生物标志物筛查和靶向药物开发等研究的投资不断增加。国内外许多学者开始质疑精准医疗是否真的是通往更健康世界的途径,对于精准医疗的投入与成果已经开始产生争论。因此,本文以《人类基因组计划对医学和社会后果》最初的愿景为切入点,探讨该愿景的假设、承诺、限制和可能性,以期为更合理、客观地认识精准医疗提供参考。

关键词： 作物   转基因   除草剂  

摘要： 随着全球人口的不断增长,传统的作物育种技术已经不能满足人类对作物产量、质量、营养性、低成本的需求。转基因作物具有高产优质、抗病虫、抗逆、抗除草剂、耐储存和提高营养成分含量、效率高等特点。对于促进现代农业产业健康发展具有重要作用。本文综述了主要转基因作物的发展概况及我国主要转基因作物的基本情况,为了解转基因作物的发展提供有价值的参考。

关键词： 免疫持续期   抗体消长   猪细小病毒  

摘要： 取实验室试制的安全性符合规定的3批次猪细小病毒杆状病毒载体灭活疫苗(rPP03株)分别免疫5~6月龄后备母猪、4~6月龄种公猪和经产母猪,免疫后不同时间采血,通过血凝抑制试验检测猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)血清抗体,观察抗体消长规律。根据试验结果确定该疫苗的免疫持续期和免疫程序:后备母猪5~6月龄免疫1次,2~3周后加强免疫一次;经产母猪于配种前1个月免疫一次;种公猪每6个月免疫一次,免疫持续期为6个月。

关键词： 高考   基因工程   试题分析  

摘要： 基因工程是历年高考的核心考点,重点考查基因工程的基本操作过程。2022年山东省普通高中学业水平等级性考试生物学试题第25题以文字、图形、表格结合的形式呈现,设问角度独特,突破了必修与选修课程之间的界限,在分析和解决生物学问题中考查学生的学科关键能力。