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关键词： 枯草芽孢杆菌   Cry2Aa蛋白   Cry1Ac蛋白   杀虫活性  

摘要： 作物病虫害一直都是危害农业生产的主要问题。Cry2Aa和Cry1Ac是从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)中发现的一种内毒素基因,对鳞翅目昆虫有特异性杀虫毒性,可作为微生物杀虫剂被广泛应用于农业害虫的防治。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)具有生长繁殖迅速、培养简单、无致病性等优点,可作为宿主菌株表达外源蛋白。同时枯草芽孢杆菌也是一种益生菌,是重要的生物防治菌株。无论是在抑菌还是在表达外源蛋白方面枯草芽孢杆菌都占有重要地位。本论文首先构建了大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭表达载体,以Cry2Aa、Cry1Ac基因片段及穿梭表达载体为骨架,构建p BE2Aa和p TN1Ac质粒载体,依次转入枯草芽孢杆菌JCL16,成功构建一株具有广谱杀虫活性的重组枯草芽孢杆菌ΔCry2Aa+Cry1Ac。最后评估该重组枯草芽孢杆菌的生物活性。主要内容如下: 1大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭表达载体的构建。从p Mar A质粒中扩取芽孢杆菌热敏复制起点及红霉素抗性基因,从p UC19质粒中扩取大肠杆菌复制起点和氨苄青霉素抗性基因,通过PCR、酶切连接构建了p BE大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭载体。以p BE、p TN、p TK和p TC四个穿梭载体为基础,分别插入了P43、Psrf、Prep U和Plac I-IPTG四个启动子元件及T1T2转入终止子元件,最终构建了组成型启动子表达载体p BE-P43T1T2和p TK-Prep UT1T2、诱导型启动子表达载体p TC-Plac I-IPTGT1T2及时期特异型启动子表达载体p TN-Psrf T1T2。以绿色荧光蛋白和β-半乳糖苷酶为报告基因,对表达载体启动外源基因能力进行分析,其中P43和Psrf启动子下的表达载体对外源基因都有较好的表达能力,具体表达特异性研究见专利CN114292867A。 2重组枯草芽孢杆菌杀虫菌株的构建。从库斯塔克亚种HD-1菌株中扩增Cry2Aa基因片段,与p BE-P43T1T2载体通过酶切连接构建重组质粒p BE2Aa。从库斯塔克亚种HD-73菌株中扩增Cry1Ac基因片段,与p TN-Psrf T1T2载体通过酶切连接构建重组质粒p TN1Ac。然后将p BE2Aa转入枯草芽孢杆菌JCL16,通过PCR鉴定,扩到目的条带1884bp,经SDS-PAGE和Western blot鉴定,在72 k D处出现阳性蛋白条带,成功构建了表达Cry2Aa的重组枯草芽孢杆菌ΔCry2Aa。以ΔCry2Aa为宿主菌,转入p TN1Ac构建共同表达Cry2Aa和Cry1Ac的重组枯草芽孢杆菌ΔCry2Aa+Cry1Ac。通过PCR鉴定,扩到目的条带1827 bp,经SDS-PAGE和Western blot鉴定,在72 k D和69 k D处出现阳性蛋白条带,成功构建了表达Cry2Aa和Cry1Ac蛋白的重组枯草芽孢杆菌ΔCry2Aa+Cry1Ac。 3重组枯草芽孢杆菌ΔCry2Aa和ΔCry2Aa+Cry1Ac生物活性测定。首先通过胃毒法测定重组芽孢菌株对小菜蛾、二化螟及棉铃虫幼虫的室内杀虫活性,实验结果表明重组枯草芽孢杆菌ΔCry2Aa和ΔCry2Aa+Cry1Ac均具有杀虫活性,其中重组枯草芽孢杆菌ΔCry2Aa对棉铃虫的幼虫的校正死亡率最高为58.70%,其次是小菜蛾、二化螟。而重组枯草芽孢杆菌ΔCry2Aa+Cry1Ac的杀虫活性与ΔCry2Aa相比,显著提高,尤其对小菜蛾幼虫的校正死亡率高达88.64%,棉铃虫的校正死亡率为76.08%,二化螟的校正死亡率为68.00%。然后将重组枯草芽孢杆菌进行抗细菌活性测定,实验结果表明重组枯草芽孢杆菌ΔCry2Aa和ΔCry2Aa+Cry1Ac抗细菌能力与枯草芽孢杆菌JCL16相比并无明显变化,结果表明重组枯草芽孢杆菌依然保留着抗菌能力。由此可见,重组枯草芽孢杆菌ΔCry2Aa+Cry1Ac是一株既具有抑菌能力,又具有广谱杀虫活性的工程菌株。 本研究通过酶切连接技术构建了含杀虫基因的p BE2Aa、p TN1Ac表达载体,利用枯草芽孢杆菌表达体系表达Cry2Aa和Cry1Ac基因,为以后构建杀虫抑菌兼治的双效基因工程菌株、研究重组质粒稳定性提供借鉴与参考。

关键词： 益生菌   双歧杆菌   基因组   比较基因组   基因工程  

摘要： 近年来,随着健康问题越来越受到人们的关注,益生菌成为了一大研究热点。双歧杆菌属于益生菌的一种,对于促进人类健康有积极的作用,包括抗感染、预防腹泻、防止慢性便秘、抑制体内肿瘤生长、调节免疫应答等多种功效。双歧杆菌属内有较多的种及亚种,其中长双歧杆菌最为常见、数量最多。随着高通量测序技术的发展,NCBI下已登记了1406株长双歧杆菌的基因组信息。通过基因组学及比较基因组学研究整合冗杂的基因组数据,对于应用益生菌并最终作用于人体非常重要。 本研究中,通过分析长双歧杆菌W13的基因组序列,预测了菌株W13的功能,通过egg NOG数据库注释,发现菌株中关于碳水化合物的运输和代谢、氨基酸的运输和代谢的相关基因最多,分别占比10.30%、9.95%,表明菌株可能具有较高的糖代谢和氨基酸代谢能力;通过KEGG数据库注释,发现菌株中含有较多的群体感应(quorum sensing,QS)、嘌呤代谢途径相关基因,预测菌株可能具有促进肠道稳态、延缓肾脏疾病进程的能力;通过Rast数据库注释,发现菌株中含有与谷胱甘肽氧化还原循环相关酶、胆盐水解酶相关基因,预测到菌株可能具有抗氧化、高产胞外多糖的功能;通过CAZy数据库注释和基因组岛预测,发现菌株可能具有高产胞外多糖的潜力。在基因水平上证明了菌株W13具有一定的益生作用,具有开发为益生菌的潜力。此外,通过前噬菌体预测、CARD数据库注释,预测了菌株W13的安全性和耐药性。以抗性基因预测为前提,结合了抗生素耐药性实验,最终确定菌株W13对卡那霉素和庆大霉素具有一定的抵抗能力。 通过比较基因组学分析菌株W13的基因组序列,基于核心基因建立了系统发育树和平均核苷酸一致性分析(average nucleotide identity,ANI),将菌株W13分类为长双歧杆菌长亚种。此外,发现菌株W13相较于其他长双歧杆菌长亚种,具有其特定的功能基因,可能具有更好的抗炎、抗感染、抗氧化的能力。 工程益生菌的开发对于改善人类健康具有重要意义,工程益生菌可以实现递送功能基因、探究菌株益生机制等作用,因此,本文对长双歧杆菌的基因工程应用进行了初步探究。通过查阅可在双歧杆菌中复制的复制子,我们利用同源重组的原理初步构建了三个可应用于双歧杆菌的克隆载体,通过对电转化条件进行优化,最终确定了质粒p UC57-AE-p SP02可应用于菌株,最佳电转化条件为使用0.5M蔗糖溶液制备感受态细胞、电压2 k V、复苏时间2 h。该质粒在连续培养30代后,质粒的保有率为73.60%,表明该质粒具有较高的稳定性。该质粒在菌株W13中的拷贝数为7,属于低拷贝质粒。最后,我们在质粒p UC57-AE-p SP02的基础上加入了P32启动子DNA片段以构建表达载体,通过观察工程菌的发光情况、测定荧光表达量,证明了该表达载体成功将绿色荧光蛋白基因导入菌株W13中。为菌株W13的分子生物学操纵奠定了基础。

关键词： 细胞色素P450 BM3   异甜菊醇   酶催化   羟基化修饰   生物活性  

摘要： 天然产物是新药研发的宝贵资源,目前上市的小分子药物接近70%来源于天然产物。对天然产物母体结构的修饰和改造是一种经典的药物开发策略,其目的通常是增强药效或者降低毒副作用。羟基化修饰是丰富天然产物衍生物结构的一种重要方式。然而利用传统化学方法难以在碳氢（C-H）惰性位点引入羟基。细胞色素氧化酶P450 BM3（CYP102A1,P450 BM3）是从巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）发现的一种具有高催化活性的、自给自足的单加氧酶,近年来P450 BM3及其突变体被广泛应用于天然产物的羟基化修饰。 异甜菊醇（isosteviol,IST）是来源于甜叶菊(Stevia rebaudiana（Bertoni）Hemsl.)的一种四环二萜类天然产物,具有广泛的药理活性。异甜菊醇及其衍生物的惰性C-H键羟基化能显著增强其生物学活性。本研究主要以工程化改造的P450 BM3酶为工具酶对异甜菊醇进行羟基化修饰,通过对P450 BM3突变体文库的筛选,发现突变体M05（F87A/A330W/A82G）对异甜菊醇的转化效率最高,最后对异甜菊醇及其产物进行生物学活性评价。本研究为异甜菊醇惰性C-H位点羟基化修饰提供了一种新方式,为新药开发和利用提供新思路。主要研究结果如下: 利用化合物相似性分析和分子对接相结合的方法,筛选出具有高催化活性的P450 BM3突变体F87A/A330W（SM1）。以异甜菊醇为底物,利用突变体SM1对其进行催化反应,结合薄层色谱（Thin Layer Chromatography,TLC）和高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）检测发现SM1能够实现异甜菊醇的催化改造,随后分离纯化出异甜菊醇衍生物并利用质谱（Mass Spectrum,MS）和核磁共振波谱（Nuclear Magnetic Resonance,NMR）解析结构,发现突变体SM1能催化异甜菊醇的C-12羟基化反应,生成分子式为C20H30O4的化合物12β-羟基-异甜菊醇（12β-OH-isosteviol,IST-1）。 为了进一步提高突变体SM1催化效率,利用不同酶改造策略设计P450 BM3的突变体文库。通过重叠延伸PCR（gene splicing by overlap extension PCR,SOE PCR）方法引入突变从而成功构建突变文库。利用TLC和HPLC方法筛选小型文库,获得4个催化效率高于SM1的突变体,其中突变体M05（F87A/A330W/A82G）表现出最高的催化活性,其对底物异甜菊醇的转化率高达66%。 对化合物IST-1进行生物活性评估,发现IST-1相对于异甜菊醇显著提高对人乳腺癌细胞MCF-7的增殖抑制作用,其IC50为147.8μmol/L。噻唑蓝比色法（Methyl Thiazolyl Tetrazolium,MTT）检测发现异甜菊醇和IST-1对人微血管内皮细胞HMEC-1均无毒性作用,故利用细菌脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导HMEC-1细胞炎症模型对这两种化合物进行抗炎活性研究。结果显示,IST-1的抗炎效果显著优于异甜菊醇。

关键词： UDPG   天麻素   生物合成  

摘要： 背景天麻素作为兰科植物天麻根茎中的主要有效成份,在临床上有极高的药用价值,被广泛用作神经保护类药物,如眩晕症、头痛、神经衰弱及癫痫的辅助治疗。以生物合成替代操作繁琐复杂的植物提取及化学合成成为合成天麻素的研究重点。本研究旨在从糖基供体尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）出发,探究其在大肠杆菌中的循环再生及生物合成策略,以实现天麻素的高效合成。其二探究了酿酒酵母作为底盘细胞合成天麻素的潜力。目的1.在大肠杆菌和酿酒酵母中分别构建合成天麻素的基因工程菌。2.通过不同功能酶的表达,构建尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）合成体系,提高天麻素的合成效率。方法1.重组工程菌的构建从NCBI数据库获得pgm和gal U的基因序列,并设计相应的引物。利用PCR扩增出正确的目的基因,并将目的基因与质粒进行酶切、连接和转化,最终通过抗性筛选及菌落PCR验证重组质粒是否构建成功。2.重组菌的诱导表达及分析检测重组工程菌通过IPTG诱导蛋白表达,HPLC分析天麻素的产量及底物的消耗情况,最终通过SDS-PAGE检测蛋白的表达。3.重组工程菌发酵条件优化与发酵进程分析为探究多基因在工程菌中共表达的最佳发酵条件,对重组工程菌发酵的最适培养基、诱导时间、装液量、诱导温度、诱导剂浓度、诱导种龄、底物浓度进行了优化。通过发酵时间进程分析确定最佳补料时机,最终测定重组工程菌的最高产天麻素的能力。4.酿酒酵母中产天麻素菌株的构建利用无缝克隆的方法构建含有糖基转移酶的质粒,并通过启动子和终止子筛选优化在酿酒酵母中天麻素的合成。结果1.引入蔗糖合酶后天麻素的转化率提高了2.1倍,通过时间进程发酵调控天麻素的合成,产量达到234.1 mg/L。2.通过引入不同来源的多聚磷酸激酶构建UDPG合成体系,最终筛选得到最佳的多聚磷酸激酶为P2。通过对发酵条件优化得到最佳的发酵条件为:采用P2为多聚磷酸激酶的工程菌,M9为发酵培养基,OD600为0.8时添加0.4 m M IPTG在28℃诱导5 h后添加160 mg/L的对羟基苯甲醇,转化率最高为97.5%。通过时间进程发酵调控后天麻素产率可以达到100%,为初始菌株的3.7倍。3.通过过表达大肠杆菌UDPG合成的关键酶葡萄糖变位酶（PGM）和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（Gal U）,天麻素的转化率提高13.6倍。通过UDPG不同合成路径的对比,最终确定在引入蔗糖合酶的基础上过表达PGM和Gal U两个酶的效果最佳。4.通过在酿酒酵母中引入糖基转移酶,天麻素的产量达到15.49 mg/L。结论1.利用蔗糖合酶和多聚磷酸激酶构建UDPG合成体系,提高了天麻素的合成效率。2.大肠杆菌UDPG合成路线中关键基因的过表达,提高了天麻素的合成效率。3.构建了一株产天麻素的酿酒酵母菌株。

关键词： 可注射性水凝胶   基因工程多肽   化学动力学治疗   化疗   肿瘤治疗  

摘要： 癌症是威胁人类生命健康的主要疾病之一,基因功能异常和基因表达模式改变是癌症的主要特征。现今,化疗是临床治疗癌症的常见方式,但是单一的治疗方式目前很难完全根治肿瘤。因此,将化疗和其它治疗手段有效结合往往能增强治疗效果。化学动力学治疗是利用金属离子和细胞内源性的过氧化氢进行芬顿或类芬顿反应产生活性氧诱导细胞死亡的抗肿瘤策略。金属离子多采用过渡金属元素,例如Fe3+、Cu2+、Mn4+等。化学动力学治疗中的金属离子除了参与芬顿反应外还能调控肿瘤微环境中的谷胱甘肽,避免谷胱甘肽清除产生的羟基自由基和逆转化疗药物的耐药性。将化疗和化学动力学治疗集合到同一治疗体系上是联合治疗面临的一个巨大的挑战。原位可注射性水凝胶由于其创伤性小、操作简便、药物的载药量大等优点,在生物医学领域备受关注。相对于合成高分子和天然高分子材料,基因工程多肽制备的可注射性水凝胶具有成分单一、生物相容性好、结构灵活可控等优点。基于此,本论文采用基因工程多肽PC10ARGD制备水凝胶负载Cu2+和化疗药物阿霉素（DOX）构建多功能可注射性水凝胶用于4T1肿瘤的化疗和化学动力学的联合治疗。主要工作如下: （1）制备了一种基于Cu2+和脱除盐酸的疏水性DOX形成的配合物以及基因工程多肽PC10ARGD的PC10ARGD/CD(C:Cu2+,D:脱除盐酸DOX)可注射水凝胶用于4T1肿瘤的化疗和化学动力学的联合治疗。首先,Cu2+和脱除盐酸的DOX配位制备纳米颗粒CD。相比于游离的DOX,CD的紫外-可见吸收峰发生了一定程度的红移,加入GSH导致CD纳米结构解离。PC10ARGD/CD水凝胶呈现酸响应释放特性,p H5.6缓冲溶液孵育10 h,PC10ARGD/CD水凝胶中的Cu2+释放量为24.6%。通过MB和TNB实验结果表明,PC10ARGD/CD水凝胶在H2O2存在的条件下持续产生·OH和消耗GSH。体外的MTT实验结果表明PC10ARGD水凝胶具有良好的生物相容性以及PC10ARGD/CD水凝胶具有良好的细胞活性抑制效果。活体的抗肿瘤治疗结果表明,相比较于单一的化学动力学或化疗,PC10ARGD/CD治疗后肿瘤生长抑制最为明显,可以实现化学动力学和化疗的联合治疗。最后,治疗过程中小鼠的体重变化、主要器官的H&E染色及血液生化结果表明PC10ARGD/CD水凝胶没有明显毒副作用。 （2）制备了一种基于Cu2+、亲水性盐酸DOX和PC10ARGD的可注射性水凝胶PC10ARGD/Cu2+/DOX。首先,Cu2+和PC10ARGD多肽上的组氨酸配位,然后将水溶性化疗药物DOX包埋至PC10ARGD/Cu2+水凝胶中制备PC10ARGD/Cu2+/DOX水凝胶。结果表明,低浓度下的PC10ARGD/Cu2+/DOX呈现纳米水凝胶形态,透射电镜结果表明,0.05%（w/v）PC10ARGD/Cu2+/DOX纳米水凝胶尺寸为60 nm;扫描电镜结果表明,PC10ARGD/Cu2+/DOX水凝胶呈现疏松多孔形貌。体外的ROS产生结果表明,在H2O2存在的条件下PC10ARGD/Cu2+/DOX水凝胶能持续产生·OH。体外MTT结果表明,在细胞水平上PC10ARGD/Cu2+/DOX水凝胶具有良好的抑制细胞活性的能力;流式细胞术结果进一步证实了PC10ARGD/Cu2+/DOX水凝胶的抗肿瘤效果。相对于游离的DOX,可注射性PC10ARGD/Cu2+/DOX水凝胶在肿瘤部位滞留时间更长。活体实验结果表明,相对于对照组,PC10ARGD/Cu2+/DOX水凝胶治疗的小鼠肿瘤体积明显得到了抑制。通过监测小鼠体重和血液分析结果表明,PC10ARGD/Cu2+/DOX水凝胶具有良好的生物安全性。 综上所述,本论文采用基因工程多肽PC10ARGD为载体通过两种方法分别包埋了疏水性化疗药物（脱除盐酸DOX）和亲水性化疗药物（盐酸DOX）制备了两种多功能的PC10ARGD/CD水凝胶和PC10ARGD/Cu2+/DOX水凝胶用于4T1肿瘤的化学动力学和化疗的联合治疗。这些新的材料和制备方法将为肿瘤治疗提供新的策略和方法。

关键词： 红色基因  

摘要： 大力推进红色基因传承，求变就是要加快推进传统媒体与现代媒体融合，创新传播载体，用青少年喜闻乐见的方式传承红色精神。求新就是要紧扣时代脉搏、赋予其新的内涵，将红色基因融入我们开展的各项活动中，不断孕育和锤炼出新的具有时代特征的“红色精神”，从而推动社会不断前进。

关键词： 外膜囊泡   膀胱癌   抗肿瘤平台   抗肿瘤免疫反应  

摘要： 膀胱癌（bladder cancer,BCa）已成为全球最普遍的泌尿系统恶性肿瘤[1,2],约75%的患者为非肌层浸润性膀胱癌（non-muscle-invasive bladder cancer,NMIBC）。临床治疗NMIBC常先经尿道膀胱肿瘤切除术（transurethral resection of bladder tumor,TURBT）,然后膀胱内灌注化疗药预防复发。然而,仍有近75%的患者在5年内出现癌症复发或恶性进展,同时,化疗药物受限于靶向性差、清除速率快、副作用多等缺点。外膜囊泡（outer membrane vesicles,OMVs）在疫苗开发和治疗性药物输送方面有公认的优势,受到越来越多的关注。细菌来源的OMVs已被证实是一种新兴的免疫佐剂,得益于其丰富的病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns,PAMPs）,可激活抗癌免疫反应。与减毒细菌疫苗相比,无细胞结构的OMVs在生物体内应用时具有更好的有效性和安全性。利用基因工程细菌生产OMVs封装的治疗性多肽类制剂已被证实具有明显的可行性。因此,开发含抗癌肽的生物工程OMVs为癌症治疗提供了一个新的探索领域。在本研究中,以细菌外膜囊泡为纳米载体,将基因工程技术产生的Polybia-mastoparan I（MPI）融合肽包裹起来,成功地制造了一种高性能的多功能抗肿瘤制剂。在细胞层面和实体瘤模型中分别评价了其治疗肿瘤的效果和生物相容性。这项工作描述了一种新型的通用型纳米平台,为临床膀胱癌治疗提供了新的途径。本课题一共分为3章,第一章,采用基因工程技术构建了表达MPI的质粒,从重组质粒转化的大肠杆菌中获得含有MPI融合肽的OMVs（OMV-MPI）,通过SDS-PAGE,Western blot分析蛋白组分,透射电子显微镜（TEM）观察OMVs形态、纳米粒度及Zeta电位分析仪测量粒径及电位。第二章,展示了工程化OMV-MPI对膀胱癌MB49和UMUC3细胞的体外增殖抑制作用,并对各种药物的半数抑制浓度进行了对比分析。通过细胞划痕实验和流式细胞术测试了OMV-MPI对细胞细胞迁移的抑制和细胞凋亡的促进作用。除此之外,探究了OMVs对BMDCs细胞的刺激作用,结果表明可以使未成熟DCs刺激为成熟DCs,激发在肿瘤特异性免疫应答中的作用。第三章,建立了小鼠膀胱癌皮下瘤模型,瘤内注射OMVs,通过肿瘤体积变化,病理分析等评价OMV-MPI对肿瘤抑制效果。同时对肿瘤内免疫细胞的类型、浸润情况进行分析,并测定肿瘤组织促炎性细胞因子含量,进一步证实了机体抗肿瘤免疫效应。结果表明,将基因工程OMVs注射到瘤内后,皮下MB49肿瘤的生长明显受到限制。OMVs固有的免疫刺激触发DCs的成熟、巨噬细胞的招募、细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）和辅助性T淋巴细胞（Th）的浸润,引起促炎性细胞因子（IL-6、TNF-α和IFN-γ）分泌量增加。与此同时,一些证据也表明生物工程OMVs具有令人满意的生物安全性。综上所述,本研究为拓展MPI多肽和OMVs在癌症治疗中的应用提供了重要策略。图24表21参101

关键词： 人胚胎干细胞   肝富集转录因子   C/EBPβ   肝向分化   调控机制  

摘要： 背景及目的:人胚胎干细胞(Human embryonic stem cells,hESCs)可以在体外经过特定的诱导,分化为多种成体组织细胞,其中包括肝细胞。这对于解决人源功能性肝细胞匮乏的问题以及在临床应用和药物开发中具有重要潜力。然而,由hESCs诱导得到的肝细胞样细胞(Hepatocyte-like cells,HLCs)与人原代肝细胞(Primary human hepatocytes,PHHs)相比存在明显的差异,包括在多个肝基因表达和肝功能水平上。体外分化的HLCs的功能相对较弱,无法有效替代PHHs发挥同样的作用。因此,提升体外分化的HLCs肝特异性功能成为当前研究的重点和热点。近年来研究表明,肝富集转录因子(Liver-enriched transcription factors,LETFs)是维持肝细胞特异性基因表达和肝功能的必要因素。通过过表达特定转录因子,能够显著提高肝细胞的功能水平。然而,研究发现在HLCs中,绝大多数LETFs的表达相对于PHHs来说明显降低。因此,本课题的首要目标是研究HLCs与PHHs之间的主要差异,并确定关键的肝富集转录因子C/EBPβ在肝细胞分化过程中的重要性。C/EBPβ(CCAAT/enhancer binding proteinβ,C/EBPβ)是CCAAT增强子结合蛋白(C/EBP)家族成员之一。C/EBP家族的多个成员参与多种组织细胞的发育和分化。作为肝富集转录因子,C/EBPβ在肝细胞的多种生理功能维持以及应激条件下的肝再生反应中发挥重要作用,是肝细胞发育和再生过程中的一个关键分子。然而目前尚不清楚C/EBPβ是否参与调控来自hESCs的肝细胞分化以及其调控机制。因此,本课题的第二个目标是阐明C/EBPβ在hESCs定向分化为肝细胞的过程中的调控作用,并深入揭示其调控机制。此外,研究表明胞外信号,如生长因子或激素,能够通过与胞膜受体结合并传递信号进入胞内,激活特定的信号通路,从而促使相关蛋白入核并磷酸化转录因子C/EBPβ,从而增强其转录活性。因此,本课题的第三个目标是探究特定的信号通路以及相关蛋白如何进入细胞核调控C/EBPβ的转录活性,并揭示胞外分子、信号通路、C/EBPβ及其下游调控基因之间的级联调控关系,为靶向调控C/EBPβ进而促进肝细胞分化提供科学依据。方法:本课题首先利用hESCs进行阶段性分化获得HLCs,并与PHHs进行全方面的比较。通过转录组测序和基因定量分析识别C/EBPβ作为主要研究对象。随后,在肝细胞分化过程中两个时期(分化期和成熟期),对C/EBPβ进行过表达和敲低,通过多方面的实验验证了C/EBPβ在肝细胞分化和功能调控中的作用。为了深入揭示C/EBPβ的调控机制,本课题进行CUT&Tag实验探究了C/EBPβ与特定基因转录调控区的结合活性。为了验证CUT&Tag测序结果,课题还进行了荧光素酶实验和染色质免疫共沉淀实验,验证了C/EBPβ对特定基因的转录调控。此外,为了探究C/EBPβ与其他因子的相互作用以及C/EBPβ在蛋白水平上的调控机制,课题进行了以C/EBPβ为靶蛋白的coIP实验和蛋白质谱测序。这些实验初步揭示了C/EBPβ在蛋白水平上的调控机制。结果:在本研究中,首先通过对比HLCs和PHHs之间的差异,发现虽然HLCs在肝特异性基因表达、功能蛋白表达、白蛋白分泌能力以及尿素合成水平上表现出一定的肝细胞特征,但与PHHs相比仍存在较大差距。此外,HLCs表现出较强的胎肝细胞表型,并且多个关键代谢酶基因和肝富集转录因子的表达水平较低。随后,在肝细胞分化过程中的分化期和成熟期,对C/EBPβ进行过表达或敲低实验,以观察其对肝细胞表型的影响。结果显示,在分化期,C/EBPβ能够显著正向调节肝祖细胞的肝向分化进程,表现为肝特异性基因AFP、ALB和HNF4α的表达上调。此外,研究还发现,分化期调控C/EBPβ表达后对细胞增殖表型产生显著影响,包括CDC25C、CDC45L、PCNA等增殖基因和蛋白的表达变化。转录组测序结果也显示C/EBPβ在细胞增殖和有丝分裂相关基因集及信号通路中显著富集。通过CUT&Tag实验,我们发现C/EBPβ能够结合到多个增殖基因的调控子区,荧光素酶实验进一步验证了其直接结合活性。另外,蛋白Co-IP实验结果显示C/EBPβ与E2F2蛋白直接结合,从而共同调控肝祖细胞的增殖表型。在成熟期,我们发现C/EBPβ能够提升HLCs的功能,并促进肝特异性基因ALB和ASGPR1、氨代谢基因CPS1和ARG1以及上皮细胞标志基因E-cad的表达。此外,过表达C/EBPβ还能够抑制TGF-β信号诱导的上皮-间质转化表型。进一步蛋白质谱结果显示C/EBPβ显著富集结合MAPK1蛋白,通过Co-IP实验验证了MAPK1与C

关键词： 葡聚糖粒子   HBTTPIP   表征   生物安全性   HBTTPIP/GPs   示踪   巨细细胞   IBD   PD-L1   HBTTPIP/GPs   工程化巨噬细胞   CTLA4-Ig   移植排斥反应  

摘要： 第一部分仿生葡聚糖粒子探针的制备及性质研究 【目的】巨噬细胞显像在移植排斥反应诊疗中发挥着重要作用。葡聚糖粒子（GPs）可被巨噬细胞表达的病原识别受体Dectin-1特异性识别,使其具备靶向成像巨噬细胞的潜能。GPs以中空囊状和右手三螺旋结构形式存在,这为课题组前期合成的正电荷新型聚集诱导发光分子（HBTTPIP）提供了潜在限域空间。因此,本研究拟采用GPs作为载体,结合正电荷的HBTTPIP,构建新型仿生葡聚糖探针（HBTTPIP/GPs）,并对其表征,评价其在体内外的生物安全性,为巨噬细胞的示踪提供一种新策略。 【方法】（1）从安琪酵母中提取GPs,与HBTTPIP共孵育制备HBTTPIP/GPs,然后采用激光共聚焦显微镜（CLSM）、透射电镜（TEM）、荧光分光光度计、台式快速粉末衍射仪等对其进行表征。（2）C57BL/6小鼠口服HBTTPIP/GPs后,通过检测免疫原性、血常规、肝肾功、主要脏器病理学以及代谢指标评估其生物安全性。 【结果】（1）成功制备HBTTPIP/GPs:HBTTPIP/GPs的粒径约3.1μm;TEM下可见GPs空腔被HBTTPTP填充。（2）HBTTPIP/GPs具备良好的发光性能:CLSM结果显示GPs核心可见明显HBTTPIP红光发射。x射线衍射（XRD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和固体荧光光谱结果显示GPs与HBTTPIP孵育后,荧光强度明显增强,HBTTPIP/GPs特征红外吸收峰与GPs相似。（3）HBTTPIP/GPs具备良好的生物安全性:C57BL/6小鼠口服HBTTPIP/GPs后,相较于对照组,免疫原性、血常规及肝肾功能指标未见显著变化,主要脏器H&E染色结果显示心、肺、肝、脾、肾未见改变;口服生物利用度结果显示HBTTPIP的最大血药浓度(Cmax)、末端消除半衰期(T1/2)和药时曲线下面积(AUC（0-t）)分别为（17.61±2.44）μg/L、（2.38±0.38）h和（145.63±20.06）μg/L·h;活体荧光结果显示口服HBTTPIP/GPs主要分布于肝脏和肺。 【结论】本研究成功构建了具有AIE效应的仿生葡聚糖粒子探针,其具备良好的发光性能,且稳定性、生物安全性高。 第二部分仿生葡聚糖粒子成像、转运机制及生物学功能研究 【目的】葡聚糖粒子可模拟酵母菌肠道感染路径,被肠道相关淋巴组织中巨噬细胞表面的Dectin-1受体特异性识别吞噬的天然属性,赋予了其口服靶向在体巨噬细胞的巨大潜能。因此,本研究旨在探索HBTTPIP/GPs成像靶向示踪在体巨噬细胞的潜能,并评价其转运机制及生物学功能。 【方法】（1）将巨噬细胞与HBTTPIP/GPs共孵育,采用TEM、CLSM和流式细胞术（FCM）观察巨噬细胞对HBTTPIP/GPs的吞噬;通过细胞增殖/凋亡检测试剂盒（CCK-8）及细胞迁移实验检测HBTTPIP/GPs对巨噬细胞生物学功能的影响。（2）构建C57BL/6小鼠炎症性肠病（IBD）模型,通过荧光成像检测口服HBTTPIP/GPs示踪巨噬细胞浸润IBD程度,及对FK506治疗效果的监测,并探讨机制。（3）C57BL/6小鼠IBD模型口服HBTTPIP/GPs,通过体重变化、DAI评分、结肠重量、炎性介质、肠粘膜屏障功能及病理学指标评价其生物学功能。 【结果】（1）巨噬细胞能识别吞噬HBTTPIP/GPs:HBTTPIP/GPs在体外能够被巨噬细胞识别吞噬,吞噬率近100%,吞噬后不影响巨噬细胞的生物学功能。（2）HBTTPIP/GPs可在体示踪巨噬细胞迁移:成功构建小鼠IBD模型,口服HBTTPIP/GPs后,活体成像显示荧光强度随IBD严重程度增加而增强,呈正相关,经FK506治疗后,荧光强度显著减低。派氏淋巴结（PP）,肠系膜淋巴结（MLNs）和结肠组织切片结果显示,口服HBTTPIP/GPs通过PPs中巨噬细胞吞噬,然后经过MLNs,最终迁移至肠道炎症部位。（3）HBTTPIP/GPs可缓解IBD:小鼠IBD模型口服HBTTPIP/GPs后可下调结肠组织IL-1β和IL-6的含量,降低一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）的水平和抗髓过氧化物酶抗体（MPO）的活性,同时可改善结肠黏膜屏障功能;免疫组化染色结果显示HBTTPIP/GPs可减轻结肠炎症,减少结肠组织细胞凋亡。 【结论】本研究制备的HBTTPIP/GPs能够被巨噬细胞识别吞噬。HBTTPIP/GPs经口服后能够示踪巨噬细胞在IBD模型的转运行为,实现监测IBD的进程,反映IBD的疗效。并且,口服HBTTPIP/GPs可缓解IBD。本研究拓宽了巨噬细胞示踪方法,为巨噬细胞相关性疾病的诊治提供了新策略。 第三部分仿生葡聚糖探针/PD-L1工程化巨噬细胞在移植排斥反应诊疗中的应用 【目的】程序性

关键词： 木霉菌素   紫杉木霉   基因工程  

摘要： 木霉菌素作为木霉菌剂的一种,具有卓越的生物防治作用,在防治植物病虫害的生物菌剂中扮演着关键角色,主要应用于抗肿瘤药物的研发和生物防治,具有良好的市场前景。紫杉木霉中最主要的生物防治因子便是木霉菌素,为了能够开发出高效生产木霉菌素且能够稳定遗传的紫杉木霉菌株,本论文研究内容如下: (1)以紫杉木霉S1961为出发菌株,首先对S1961的潮霉素和G-418抗生素的耐受浓度进行了摸索,得到紫杉木霉野生型菌株S1961对潮霉素的最高耐受浓度为40μg/m L,对G-418的最高耐受浓度为200μg/m L;然后对紫杉木霉原生质体的制备过程进行了条件优化,确立了紫杉木霉原生质体制备的方法;进而对外源DNA片段转化进入紫杉木霉原生质体的方法进行了摸索实验,通过对电击转化法和PEG介导法进行比较得出,PEG介导法可以成功将外源DNA片段成功转化进入紫杉木霉原生质体内,成功筛选获得了含有hph基因的重组子,最终成功建立了紫杉木霉遗传操作方法。然后在紫杉木霉菌株S1961的基础上,建立了以Tet-on::Cre-lox P为基础的筛选标记重复利用系统,得到了紫杉木霉底盘细胞S2530,能够通过强力霉素诱导Tet-on调控Cre重组酶的表达过程,完成对lox P-hph-lox P标记基因的诱导消除,从而实现应用一个筛选标记hph基因多次重复使用。 (2)强化紫杉木霉对木霉菌素的合成能力,提高木霉菌素的积累。在紫杉木霉基因组上,tri3编码的乙酰基转移酶负责将木霉菌醇乙酰化为木霉菌素,tri11编码的细胞色素P450加氧酶负责将12,13-epoxytrichothec-9-ene(EPT)氧化为木霉菌醇,tri4编码的细胞色素P450加氧酶负责将trichodiene氧化为isotrichodiol,;tri5编码的单端孢霉烯合成酶负责将法尼基焦磷酸(FPP)环化为trichodiene,它们是木霉菌素合成途径中的关键基因。本研究在底盘细胞S2530中依次过量表达了tri3、tri11、tri4和tri5。依次得到tri3过表达菌株S2729、tri3和tri11过表达菌株S3042以及tri3、tri11、tri4和tri5过表达菌S3190。S2729和S3042菌株的摇瓶发酵木霉菌素产量分别为1.2 g/L和1.5 g/L,较上一代的改造菌株木霉菌素产量均提高了33.3%,说明tri3和tri11基因为合成通路的关键基因,对其进行过量表达有利于木霉菌素产量的提升;tri3、tri11、tri4和tri5过表达菌株S3190的木霉菌素产量达到1.58 g/L,基本与上一代改造菌株S3042的产量相持平。通过摇瓶发酵数据分析,菌株S3190的7天木霉菌素的产量相对于出发菌株S1961提高了163%。 综上,本课题建立了紫杉木霉原生质体制备以及PEG介导的转化方法,并在紫杉木霉菌株S1961的基础上,建立了以Tet-on::Cre-lox P为基础的抗性标记重复利用系统,得到了紫杉木霉底盘细胞S2530;在紫杉木霉底盘细胞S2530中依次过量表达了自身来源的tri3、tri11、tri4和tri5,最终得到了tri3、tri11、tri4和tri5共过表达菌株S3190,木霉菌素产量达到1.58 g/L,相较于出发菌株S1961提高了163%。具有遗传稳定、木霉菌素产量高等工业化发展潜力,其构建流程为工业生产中构建高效生产木霉菌素的紫杉木霉菌株提供一定的参考价值,为以后实现木霉菌素高效生产奠定了基础。