关键词:
动脉粥样硬化
大黄酚
炎症
自噬
泡沫细胞形成
NF-κB/HMGB1
PI3K/Akt/mTOR
摘要:
旨在探讨大黄酚(chrysophanol, Chr)减轻氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein, ox-LDL)所致炎症和泡沫细胞形成的潜在机制,探索大黄酚与冠状动脉粥样硬化的相关作用靶点及通路,为临床新药研发提供理论依据。采用体外培养RAW264.7巨噬细胞,通过细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)确定大黄酚和ox-LDL对RAW264.7巨噬细胞适当给药浓度后,用不同浓度的大黄酚(10、15μmol·L^(-1))、不同浓度的ox-LDL(含或不含80 mg·mL^(-1))处理RAW264.7巨噬细胞24 h,即将RAW264.7巨噬细胞分为4组,对照组、模型组(80 mg·mL^(-1)ox-LDL)、大黄酚低剂量组(80 mg·mL^(-1)ox-LDL+大黄酚10μmol·L^(-1))、大黄酚高剂量组(80 mg·mL^(-1)ox-LDL+大黄酚15μmol·L^(-1)),并用油红O染色检测各组的脂质累积情况、流式细胞术分析各组中白细胞分化抗原36(CD36)的表达情况、蛋白免疫印迹(Western blot)法检测A1类清道夫受体(SR-A1)、B族Ⅰ型清道夫受体(SR-B1)、自噬相关蛋白5(Atg5)、苄氯素1(Beclin1)、自噬衔接蛋白p62(P62)、微管相关蛋白轻链3(LC3)Ⅱ与LC3Ⅰ比值(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ)和核转录因子κB P65(NF-κB P65)、抑制性κB激酶β(IKKβ)、核因子κB激酶亚基β抑制因子(IκB)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B (Akt)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)磷酸化的蛋白表达,实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)检测三磷酸腺苷结合盒转运子A1(ABCA1)、三磷酸腺苷结合盒转运体G1 (ABCG1)、白细胞介素-1β(IL^(-1)β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、HMGB1、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶1(Arg1)、巨噬细胞半乳糖型凝集素-1(Mgl-1)和NF-κB P65的mRNA表达水平,免疫荧光分析确定HMGB1在各组RAW264.7细胞中的定位,后增加自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)作为抑制剂对照进行反向验证,即重新将RAW264.7巨噬细胞分成4组,对照组、模型组(80 mg·mL^(-1)ox-LDL组)、给药组(80 mg·mL^(-1)ox-LDL+大黄酚15μmol·L^(-1))、抑制剂组(80 mg·mL^(-1)ox-LDL+大黄酚15μmol·L^(-1)+3-MA)进行以上实验。结果显示大黄酚通过调节SR-A1、ABCA1、ABCG1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Atg5、Beclin-1和p62的表达水平,同时还抑制NF-κB/HMGB1-PI3K/Akt/mTOR信号通路,从而有效地减少泡沫细胞形成,并且大黄酚对自噬和NF-κB/HMGB1-PI3K/Akt/mTOR通路的抑制作用可被自噬抑制剂3-MA逆转。综上所述,大黄酚通过诱导自噬和调节NF-κB/HMGB1和PI3K/Akt/mTOR通路,抑制巨噬细胞炎症泡沫细胞的形成,具有治疗动脉粥样硬化的潜力。