关键词:
动脉粥样硬化
间充质干细胞
巨噬细胞
碱性亮氨酸拉链转录因子
炎症反应
摘要:
目的本研究旨在评估人胎盘来源的间充质干细胞(hp-MSCs)通过调控巨噬细胞极化抑制动脉粥样硬化(AS)的作用及其潜在分子机制。探索hp-MSCs对巨噬细胞极化的调控作用,探讨其在炎症反应和脂质代谢中的作用。初步阐明hp-MSCs抑制AS进展的分子机制,为理解巨噬细胞极化抑制AS提供新的理论依据,为AS的免疫干预提供新思路。评估hp-MSCs在AS小鼠模型中的治疗潜力,并结合临床标本进行验证,以明确其在抑制AS斑块进展中的作用。
方法本研究采用细胞实验、动物模型实验和临床样本分析相结合的方法。
在细胞实验中,通过形态学观察结合流式细胞技术对hp-MSCs进行鉴定。随后,利用THP-1细胞分化为巨噬细胞,并诱导为M1型(IFN-γ和LPS处理),然后与hp-MSCs共培养。巨噬细胞极化标志物(如CD86、i NOS、CD163、CD206、Arg1)采用流式细胞技术、细胞免疫荧光以及RT-q PCR方法鉴定,细胞因子分泌水平利用ELISA检测。
在动物实验中,通过高脂饮食(HFD)诱导ApoE-/-小鼠构建AS模型,分为HFD组、HFD+hp-MSCs组和HFD+hp-MSCs-luc组。尾静脉注射hp-MSCs,利用化学发光荧光影像分析系统(IVIS)和小动物超声/光声成像系统检测细胞在体内的分布和斑块变化。收集小鼠血样、主动脉斑块,进行生化和免疫指标检测、组织学染色(H&E、Masson、油红O)和免疫荧光分析,评估hp-MSCs对AS病变的改善效果。
为验证实验结果的临床相关性,本研究收集AS患者的动脉斑块组织和正常动脉组织样本。通过Western blot检测炎症因子相关蛋白的表达水平,利用组织免疫荧光分析巨噬细胞极化状态。
最后,通过蛋白质组学分析筛选出差异表达蛋白,并结合GO和KEGG富集分析确定关键基因。利用CO-IP和Western blot实验验证。此外,通过RT-q PCR技术检测了该基因对巨噬细胞极化相关指标的调控作用,揭示其在巨噬细胞极化过程中的作用。
结果细胞水平研究结果表明,hp-MSCs的鉴定结果显示,细胞形态呈典型的长梭形或纺锤形。流式细胞术检测hp-MSCs特征性标志物(CD44、CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、HLA-DR),结果符合国际细胞治疗学会(ISCT)定义的MSC标准。流式细胞术和细胞免疫荧光分析进一步显示,与M1型巨噬细胞相比,M1+hp-MSCs组中促炎标志物CD86的表达显著降低,而抗炎标志物CD206的表达显著升高。
RT-qPCR结果表明,促炎因子i NOS的m RNA表达在M1+hp-MSCs组中显著降低,而抗炎因子Arg1的m RNA表达显著升高。吞噬实验表明hp-MSCs能显著增强巨噬细胞对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的摄取能力。ELISA法检测发现,炎症相关因子如IL-1β、TNF-α的水平以及CXCL10等趋化因子的表达量均出现显著下降。与此同时,具有免疫调节功能的IL-10和TGF-β等抗炎因子的分泌量则呈现出明显的上升趋势。
动物实验结果表明,hp-MSCs显著调节ApoE-/-小鼠的外周白细胞谱,降低白细胞总数、中性粒细胞和单核细胞数量,同时改善血脂水平,即显著减少血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(T-CHO)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的浓度,同时促进高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量的上升。hp-MSCs对肝脏和肾脏功能也显示出保护作用,降低丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、尿素氮(BUN)和胱抑素C(Cys C)水平。在炎症微环境调节方面,hp-MSCs显著降低血清中的促炎因子水平(如IL-1β、IL-6、TNF-α),同时显著提高抗炎因子水平(如IL-4、IL-10、TGF-β)。多模式成像和组织学分析显示,hp-MSCs能够有效定植于动脉斑块区域,通过调节局部炎症微环境,显著改善斑块的稳定性。油红O染色、H&E染色和Masson染色结果显示,与HFD组相比,HFD+hp-MSCs组的斑块面积、胶原纤维含量和脂质沉积水平均显著降低。组织免疫荧光分析显示,hp-MSCs处理后,斑块中M2型巨噬细胞的比例显著增加,M1型巨噬细胞的比例明显减少(巨噬细胞M1型与M2型的比值由约2.5:1提升至1:2)。
临床样本分析结果表明,AS患者斑块组织中促炎因子(如MCP-1、TNF-α、iNOS)的显著表达高于正常动脉组织,而抗炎因子(如Arg1、TGF-β1)的表达显著降低,表明斑块内炎症反应显著加剧,修复机制相对不足。组织免疫荧光分析表明,斑块组织中M1型巨噬细胞标志物CD86的信号显著增强,而M2型巨噬细胞标志物CD163的信号较弱。相比之下,正常动脉组织中,CD86和CD163的