关键词:
动脉粥样硬化
靶向递送
纳米液滴
超声
PCSK9
疫苗
细胞外囊泡
蛋白降解
摘要:
研究背景和目的
动脉粥样硬化是全球心血管疾病的首要病因,降低低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)是防控关键。前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶9型(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)是调控肝细胞低密度脂蛋白受体(low-density lipoprotein receptor,LDLR)降解的重要分子,已成为新型降脂靶点。现有PCSK9抑制剂(如单克隆抗体、si RNA药物)已取得显著疗效,进一步开发新型抑制策略,对提升治疗效果、改善患者依从性、降低医疗成本、应对耐药等具有重要的价值。
纳米递送系统以及超声辅助药物递送策略卓越的递送优势,为开发新的PCSK9抑制策略提供了新选择。本研究旨在通过递送技术的多重创新,创建新型PCSK9抑制策略,为动脉粥样硬化防治提供高效、精准且可持续的治疗方案,同时为其他相似药物靶点的疾病防治策略研发提供可参考的范式。具体目标包括:
(1)创建超声(ultrasound,US)辅助抗原提呈的PCSK9疫苗策略;
(2)建立基于细胞外囊泡(extracellular vesicle,EV)的肝脏高选择性PCSK9清除策略。
研究内容与方法
(一)超声增强型PCSK9疫苗的研发及其防治动脉粥样硬化效果
1、超声联合纳米液滴的PCSK9纳米疫苗构建
设计并合成表达PCSK9(D374Y)抗原序列与Lamp2b融合蛋白的质粒。质粒转染细胞后提取细胞膜并制备抗原纳米液滴(nanodroplet with PCSK9,NDPCSK9),通过Western blot、扫描电镜和纳米粒径追踪(nanoparticle tracking analysis,NTA)进行表征鉴定。同时设置不含突变PCSK9的对照。
将装载EVc GAMP的GM-CSF@Gel MA水凝胶(GelEV)植入小鼠皮下,48 h后在凝胶处原位注射NDPCSK9,即PCSK9纳米疫苗。在此基础上,进行超声爆破(即GelEV+NDPCSK9+US处理,命名为超声增强型PCSK9纳米疫苗),使用共聚焦显微镜验证超声爆破增强递送效果及树突状细胞(dendritic cell,DC)的激活效果。
2、超声增强型PCSK9疫苗的效果评估
选取6-8周龄C57小鼠进行PCSK9纳米疫苗及超声增强型接种,同时设置以下阴性对照:GelEV组(单纯注射凝胶)、GelEV+NDCtrl组(凝胶原位注射NDCtrl)。为进行加强免疫,于凝胶注射一周后进行第二针ND注射。于免疫后指定时间采集血清,ELISA检测PCSK9抗体水平和滴度。
选取Apo E-/-小鼠高脂喂养4周后,进行初次免疫,隔周进行第二针加强免疫。小鼠继续高脂饮食,于第12周结束实验。ELISA检测血清PCSK9水平,Western blot评价肝脏LDLR表达水平,油红O染色评价肝脏脂肪样变。血清生化检测血脂改变。超声影像检测小鼠肝肾灰度比和脉搏波传导速度。HE、Masson、油红O染色等组织学分析评价动脉粥样硬化斑块。
(二)肝脏高选择性抑制PCSK9的纳米递药策略及其治疗动脉粥样硬化效果
1、构建高效吸附PCSK9的EV
通过基因工程技术将突变型LDLR EGF-A结构域(H306Y)与候选骨架蛋白胞外区融合,构建CD63-EGF-A、CD81-EGF-A及Δ687 PTGFRN-EGF-A三种融合质粒。转染细胞后提取EV,TEM、NTA及Western blot进行表征鉴定。通过超高速离心共沉淀、ELISA及纳米流式细胞术定量分析EV表面EGF-A拷贝数及功能活性EV占比,免疫电镜检测EV与PCSK9的结合能力。
2、EV诱导PCSK9靶向溶酶体降解
Δ687 PTGFRN-EGF-A修饰的EV定义为EVTx。构建PCSK9-e GFP融合蛋白质粒,转染细胞后收集上清,并与Di I标记EV共同加入肝细胞培养基。荧光共聚焦显微镜观察EV、PCSK9-e GFP与溶酶体标志物LAMP1的共定位。ELISA检测培养基中PCSK9浓度。Western blot分析细胞及细胞膜组分中LDLR表达水平。同时,以PCSK9单克隆抗体Alirocumab作为阳性对照。
3、EV防治动脉粥样硬化的效果
使用小动物活体成像系统(IVIS)示踪Di R/Di I标记的EV,分析其体内分布特征。高脂喂养Apo E-/-小鼠10周后,随机分为PBS组、Alirocumab组、EVNone组、EVCtrl组和EVTx组,每周使用EV或单抗治疗1次,持续6周。治疗后系统分析动脉粥样硬化防治效果,具体方法同前。
研究结果
(一)超声增强型PCSK9疫苗的