关键词:
高分辨磁共振血管壁成像
颈动脉狭窄
动脉粥样硬化
新发同侧脑缺血
外泌体miRNAs
摘要:
目的:
1.采用高分辨磁共振血管壁成像(high-resolution magnetic resonance vessel wall imaging,HR-VWI)评估颈动脉斑块特征与颈动脉支架置入术(carotid artery stenting,CAS)术后新发同侧脑缺血(new ipsilateral ischemic lesions,NIILs)的相关性。
2.通过评估易损斑块患者血浆外泌体miRNAs表达谱,探索易损斑块的新型诊断标志物。
方法:
1.依据入选及排除标准连续收集2023年1月至2024年10月就诊于承德医学院附属医院神经外科确诊为颈动脉狭窄并行CAS的患者共278例,留取所有患者的血浆样本。根据术后磁共振弥散加权成像(diffusion weighted imaging,DWI)是否出现新发同侧脑缺血病灶选取NIILs阳性组(50例),NIILs阴性组(50例)。对比两组组间基线资料和影像学特征,以P<0.05为差异具有统计学意义。
2.依据术前HR-VWI对斑块稳定性的分析结果将上述100例研究对象分为易损斑块组(57例)和稳定斑块组(43例),另外纳入10例就诊于我院神经外科经影像学检查无颈动脉斑块和脑血管疾病患者,留取患者的血浆样本。开展以下研究:(1)发现组:易损斑块组及稳定斑块组血浆样本各10例、无斑块组血浆样本5例,用于外泌体miRNAs测序及差异miRNAs检测。方法如下:提取外泌体,并通过透射电镜、纳米流式分析技术和western blot对其进行鉴定。提取样本中的总RNA,行高通量小RNA测序并构建易损斑块差异表达的miRNAs文库,筛选表达量较高(平均值>10)、|fold change|≥1.5且P<0.05的显著差异miRNAs进行靶基因预测和功能富集分析。(2)验证组:易损斑块组及稳定斑块组血浆样本各20例。通过实时荧光定量逆转录PCR(real-time fluorescence quantitative reverse transcription PCR,q RT-PCR)验证挑选出的显著差异miRNAs表达趋势,分析外泌体miRNAs与斑块稳定性之间的关系。
结果:
1.依据CAS术后是否发生NIILs分组:NIILs阳性组易损斑块较NIILs阴性组检出率高(74%比40%),差异具有统计学意义(P<0.05)。NIILs阳性组斑块内出血(intraplaque hemorrhage,IPH)(58%比22%)、富含脂质的坏死核心(lipid-rich necrotic core,LRNC)(70%比38%)、薄或破裂的纤维帽(thinned ruptured fibrous cap,TRFC)(54%比34%)检出率均高于NIILs阴性组,差异具有统计学意义(P<0.05);而钙化(calcification,CA)(46%比64%)检出率低于NIILs阴性组,差异无统计学意义(P>0.05)。NIILs阳性组中糖尿病史(40%比20%)、同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)(15.12±2.75比13.25±3.20)水平等指标高于NIILs阴性组,差异具有统计学意义(P<0.05)。多因素logistic回归分析显示,IPH(OR=3.635,95%CI(1.328,9.955),P=0.012)、LRNC(OR=3.460,95%CI(1.248,9.593),P=0.017)及Hcy(OR=1.302,95%CI(1.100,1.542),P=0.002)水平升高是支架术后新发同侧脑缺血的独立危险因素。ROC曲线分析显示,IPH、LRNC和Hcy水平升高对于支架术后新发同侧脑缺血有较高的预测价值。三者联合的预测效能最佳(曲线下面积0.803,95%CI(0.717,0.888),P<0.001)。
2.依据斑块稳定性分组:
通过透射电镜观察发现,分离得到的微囊泡呈特征性无完整核膜的椭球形态。纳米流式分析显示,这些微囊泡的尺寸分布范围为40-150nm。western blot分析检测到四种外泌体特异性标志蛋白:Tsg101、Alix、CD9及HSP70,而内质网标志物Calnexin呈阴性表达。上述检测结果与外泌体的典型特征相符。
与稳定斑块组相比,易损斑块组患者血浆外泌体中共有135个差异表达的miRNAs(97个上调和38个下调);与无斑块组相比,易损斑块组患者血浆外泌体中共有152个差异表达的miRNAs(149个上调和3个下调)。经维恩分析确认两对比组合有83种重叠性miRNAs,基于表达量(均值>10)、|fold change|≥1.5且P<0.05三重标准,最终筛选出14个显著表达差异miRNAs。进一步靶基因预测