关键词:
喙尾琵琶甲
结直肠癌
CT26
甲基对苯醌
肌苷
摘要:
目的:通过建立小鼠体内CT26(小鼠结直肠癌细胞)结直肠肿瘤模型,对前期自喙尾琵琶甲防御性分泌液中获得的具有显著体外肿瘤细胞增殖抑制活性的单体成分甲基对苯醌(MBQ)和具有显著体内外免疫调节活性的提取部位(BRAF)及其中的主要组分肌苷(Inosine,IS)进行肿瘤抑制活性及可能的作用机制研究。方法:(1)采用皮下接种肿瘤细胞方法建立BALB/c小鼠体内CT26结直肠肿瘤模型。设置正常组、模型组、阳性药组(5-Fu,25 mg/kg)、MBQ低、中、高剂量组(i.v,0.75 mg/kg、1.5 mg/kg和3 mg/kg),连续给药14天。通过瘤重和瘤组织HE染色等考察MBQ的抗肿瘤作用;免疫荧光法检测瘤组织中的增殖相关因子Ki-67和凋亡相关蛋白Caspase-3的表达,流式细胞术检测肿瘤组织中CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞和Treg细胞的占比水平探究可能的作用机制。(2)建立相同模型,给予BRAF(i.g,2 g/kg)及BRAF低、中、高(0.5 g/kg、1g/kg和2 g/kg)剂量联合5-Fu(12.5 mg/kg)处理。通过小鼠一般状态、瘤重、免疫器官指数及流式细胞术检测小鼠脾脏中树突细胞、肿瘤组织中T、B细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞和Treg细胞的占比水平,探究BRAF联合5-Fu对CT26结直肠肿瘤小鼠生存状态改善及免疫系统的影响。(3)建立相同模型,给予IS低、高剂量(i.v,5 mg/kg和50 mg/kg)处理。通过瘤重、肿瘤组织中Ki-67的表达及免疫荧光法检测瘤组织中M1型巨噬细胞标志物F4/80+CD86和M2型巨噬细胞标志物F4/80+CD206的表达,探究IS肿瘤增殖抑制作用及对肿瘤微环境M1和M2巨噬细胞极化的影响。结果:(1)MBQ低剂量组抑瘤率为32.56%、有一定的抑制活性,但中、高剂量组无明显增殖抑制作用;MBQ可以降低肿瘤组织中CD3+T细胞和Treg细胞占比,升高CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞占比,降低Ki-67蛋白表达量、增加Caspaese-3蛋白表达量。(2)5-Fu抑瘤率为65.69%,但小鼠体重显著降低(P<0.01)。BRAF单独给药无肿瘤增殖抑制作用,联合5-Fu给药,低、中、高剂量组的抑瘤率分别为:64.96%、54.74%和63.50%,均不能增加抑瘤率,但能显著改善5-Fu导致的小鼠体重下降(P<0.05),明显改善小鼠生存状态和生存质量。流式细胞术结果显示:BRAF和5-Fu联用增加了树突细胞和T、B细胞的占比,减少了Treg细胞的占比。(3)IS低、高剂量组抑瘤率分别为34.35%和47.33%。免疫组织化学结果显示:5-Fu和IS均能显著降低Ki-67蛋白的表达(P<0.01);免疫荧光结果显示:IS能以浓度依赖性增加巨噬细胞M1极化表型F4/80+CD86的表达,但对M2极化表型F4/80+CD206的表达无明显影响。结论:喙尾琵琶甲防御液中的主要成分MBQ体内对CT26结直肠肿瘤具有一定的抑制作用,可能通过抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞坏死和凋亡发挥作用。活性提取部位BRAF对肿瘤无明显抑制作用,但与5-Fu联合使用时能明显改善5-Fu导致的小鼠体重下降,部分改善小鼠的生存状态和生存质量。IS对CT26结直肠肿瘤具有一定的抑制作用,可能通过抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤微环境中巨噬细胞M1型极化发挥作用。