关键词:
铁笛丸
shotgun metabarcoding
叶绿体基因组
线粒体基因组
物种鉴定
摘要:
中成药的生物成分鉴定是中药鉴定中的一大难点。由于中成药原料药材的错误投料或虚假投料,严重损害了中成药的安全性、有效性和在国际市场的发展,因此,有必要采取更加有效的技术手段来解决中成药处方成分的物种鉴定问题,以确保中成药的安全性和有效性。铁笛丸对慢性咽炎有较好的临床疗效,是历史上的名验方。铁笛丸是由植物药(诃子肉、浙贝母、桔梗、麦冬、玄参、瓜蒌皮、青果、甘草)、动物药(凤凰衣)、和真菌药(茯苓)等10味中药制成的大蜜丸。目前2020版《中国药典》针对铁笛丸的鉴定只有7味药材的显微鉴定,以没食子酸和贝母素甲为对照的薄层色谱法和以检测甘草酸含量的高效液相色谱法。传统检测方法对于物种与成分的关系不能一一对应,且只能检测部分物种的成分,不能对全部处方成分鉴定。分子鉴定以遗传物质DNA为研究对象,不受药材形态结构和化学成分影响,准确性高,该技术已在中药材鉴定中广泛应用。基于DNA条形码鉴定的DNA metabarcoding技术和shotgun metabarcoding技术可对中成药的生物成分进行检测,但由于条形码序列长度短,片段变异位点少,存在对某些物种检不全的问题。随着研究进入基因组时代,叶绿体和线粒体全基因组作为“super barcode”具有丰富的遗传信息,其结构、基因顺序和基因含量比较保守等特点,可用于中成药全成分物种鉴定。因此本论文以中成药铁笛丸为例,建立10种原料药材及其近缘物种的叶绿体基因组及线粒体基因组数据库,通过shotgun测序,去除低质量数据,将reads mapping到叶绿体及线粒体基因组数据库,使用python脚本进行物种构成分析,尝试构建基于叶绿体及线粒体基因组全长的中成药铁笛丸生物成分鉴定方法,为中成药的鉴定提供新的方法,也为中成药在市场上的安全流通提供一种新的监管手段。目的:本研究以含有植物药、动物药及真菌药10种原料药材的铁笛丸为例,建立基于叶绿体及线粒体全长的中成药鉴定分析流程,并结合传统鉴定方法系统全面地对铁笛丸基原物种鉴定,从而为中成药提供更加全面的鉴定方法。方法:1.从药店收集铁笛丸中的诃子肉、浙贝母、茯苓、桔梗、麦冬、玄参、瓜蒌皮、青果、凤凰衣、甘草各药材饮片及阳性对照药材西洋参,根据《中国药典》进行形态学鉴定,之后提取各原料药材的DNA,植物药采用ITS2、psb A-trn H、mat K、rbc L 4种DNA条形码,动物药采用COI条形码扩增测序,去除引物后与NCBI的Gen Bank数据库比对,鉴定原料药材及对照药材的准确。2.按照2020版《中国药典》中铁笛丸组方规定在实验室制作2份自制样品并在其中1份加入西洋参药材粉末作阳性对照。收集不同批次的市售铁笛丸样品3份,采用传统鉴定方法检测。在生物显微镜下观察市售中成药铁笛丸粉末的7种显微特征。薄层色谱法(TLC)以没食子酸和贝母素甲作为对照品,通过层析观察市售样品与对照品的斑点位置和颜色。高效液相色谱法(HPLC)以甘草酸的含量为指标,对市售样品溶液和甘草酸对照品溶液在相同液相系统下进行含量检测。3.采用DNA提取试剂盒法中的提取步骤提取DNA,使用Illumina Nova Seq测序平台对这5个样本的DNA进行高通量测序。使用Shotgun metabarcoding方法,从高通量数据集中生成了ITS2、psb A-trn H、mat K、rbc L和COI序列。每个条形码的Taxa通过blast分配给NCBI的Gen Bank库,对中成药中的正品物种精确鉴定。最后,使用Megan软件将中成药的物种组成进行可视化分析。4.通过公共数据库,整合现有的铁笛丸组方成分及近缘物种的叶绿体及线粒体基因组,构建铁笛丸组方成分及近缘物种的叶绿体及线粒体基因组数据库。基于mapping的策略分析叶绿体及线粒体基因组高通量数据鉴定铁笛丸的生物成分。通过数据库中的序列作为参考基因组,使用bowtie2 v2.***.4.3进行mapping,使用samtools v1.10计算测序深度和覆盖度。采用seqtk v1.3提取mapping到基因组的reads,统计数据。通过python脚本对mapping到的reads进行回溯到基因及基因间隔区。筛选可信度高的基因及基因间隔区,对物种构成分析。通过Megan v6.21对各样品的数据进行可视化分析,比较样品间的差异。结果:1.结合药材的形态特征对收集的中成药铁笛丸原料药材进行DNA条形码鉴定,确定各药材的准确性。原料药材的DNA条形码结果显示,除了茯苓和诃子肉由于含有多糖等成分且DNA降解的原因没有提取到DNA外,ITS2、psb A-trn H、mat K、rbc L和COI序列分别成功获得了麦冬、桔梗、玄参、浙贝母、青果、瓜蒌皮、甘草、凤凰衣及阳性对照药材西洋参的序列。经过与NCBI的Genban