关键词:
类弹性蛋白
白蛋白结合结构域
胰高血糖素样肽1受体激动剂
降血糖
半衰期
大肠埃希菌
摘要:
目的 构建以类弹性蛋白(elastin-like polypeptide,ELP)和白蛋白结合结构域(albumin-binding domain,ABD)为载体的胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)受体激动剂并探究其降血糖作用。方法 通过基因融合的方式,将GLP-1与ELP及ABD融合,构建GLP-ELP_(AGV)及GLP-ELP_(AGV)-ABD融合蛋白。以大鼠胰岛素瘤细胞(RINm-5F)为研究对象,考察不同浓度的GLP-1阳性对照分子、GLP-ELP_(AGV)-ABD及GLP-ELP_(AGV)融合蛋白的促细胞增殖活性。通过测定RIN-m5F细胞内环磷酸腺苷的量表征融合蛋白对胰高血糖素样肽1受体(glucagon-like peptide-1 receptor,GLP-1R)亲和力的影响。利用ELISA的方式检测融合蛋白与人血清白蛋白的亲和力。使用C57BL/6小鼠,通过皮下注射融合蛋白后在不同时间点测定血糖水平,研究其体内降血糖活性。结果 体外细胞实验显示,在100 nmol·L^(-1)范围内,GLP-1、GLP-ELP_(AGV)-ABD及GLP-ELP_(AGV)融合蛋白均能促进细胞增殖,且随着浓度的增加促增殖能力增加,差异无统计学意义(100 nmol·L^(-1)时,3组比较F=0.985,P=0.089)。在1~10 nmol·L^(-1)范围内,GLP-ELP_(AGV)及GLP-ELP_(AGV)-ABD融合蛋白与GLP-1R结合的亲和力均下降,10 nmol·L^(-1)时,GLP-ELP_(AGV)-ABD组与GLP-1组、GLP-ELP_(AGV)组与GLP-1组比较,差异均有统计学意义(t=4.542,P=0.004,t=7.987,P<0.001)。ELISA结果显示,GLP-ELP_(AGV)-ABD融合蛋白与人血清白蛋白有较高的亲和力。体内实验显示,GLP-ELP_(AGV)及GLP-ELP_(AGV)-ABD融合蛋白能够降低小鼠的血糖水平达72 h和96 h,比GLP-1(1 h)明显延长。72 h时GLP-ELP_(AGV)组与PBS组、96 h时GLP-ELP_(AGV)-ABD组与PBS组比较,差异均有统计学意义(t=3.811,P=0.008;t=3.559,P=0.003)。结论 GLP-ELP_(AGV)及GLP-ELP_(AGV)-ABD融合蛋白可以延长GLP-1的半衰期和降血糖时间,ELP与ABD可以协同发挥作用增强GLP-1的降血糖活性。