关键词：
肌肉卫星细胞
肌腱干细胞
生物学特性研究
多分化潜能
肌肉损伤
肌腱损伤
细胞治疗
摘要：
运动损伤主要包括肌肉组织部位的拉伤、扭伤和挫伤,以及肌腱和韧带损伤。这些损伤不仅会影响身体健康而且阻碍日常生活与工作,当前医学领域中干细胞治疗的出现使得治疗相关疾病被寄予厚望。本研究旨在建立骨骼肌卫星细胞与肌腱干细胞的体外扩增培养体系,并探索其细胞增殖、分化等生物学特性及其在肌肉损伤模型与肌腱损伤模型移植后体内迁移情况,得到结论如下:1.采用机械分离法与酶消化法,成功分离获得肌肉卫星细胞和肌腱干细胞,分离后的两种细胞传代培养后增殖能力强,其中肌肉卫星细胞传至27代,肌腱干细胞传至38代,此外经冻存后复苏的细胞仍具有较高的活性。2.通过RT-PCR、免疫荧光以及流式细胞仪对细胞相关特异性基因和表面标记物进行检测,结果显示肌肉卫星细胞中Desmin、Pax7、c-Met、Myf5、Myo D,肌腱干细胞中collagen I,collagen III,CD44,Nucleostemin和Tenascin-C等特异性基因及表面抗原均呈阳性表达,表明所分离的细胞分别具有肌肉卫星细胞和肌腱干细胞的特性,此外对分离的两种细胞进行生长曲线和克隆形成能力、核型分析等生物学特性鉴定,表明细胞具有较强的增值能力并且无染色体突变,以此保证本实验获取两种干细胞可用于细胞库的构建及日后相关研究的使用。3.为鉴定肌肉卫星细胞的多分化潜能特性,在体外将肌肉卫星细胞分别向成肌细胞、成脂肪细胞、和成骨细胞进行诱导,而肌腱干细胞则向成脂细胞、成骨细胞及软骨细胞进行诱导并对诱导结果进行鉴定,结果表明:肌肉卫星细胞在向成肌细胞诱导7天后形态明显发生变化,通过免疫组化对fast skeletal myosin抗体进行染色结果呈阳性,RT-PCR检测成肌相关基因Myo G与fast skeletal myosin均阳性表达;肌腱干细胞向软骨细胞诱导软骨球形态明显,阿利新蓝染色成阳性,RT-PCR相关基因Collagen II,SOX9和ACAN均表达;此外两种细胞在向成脂和成骨细胞诱导时均获得成功,利用脂肪诱导液对肌肉卫星细胞进行成脂诱导,21天后油红O染色可见到红色脂滴,RT-PCR检测到脂肪细胞特异性分子标记LPL和PPAR-γ阳性表达;肌肉卫星细胞在成骨诱导液中诱导4周后进行茜素红染色呈阳性,RT-PCR检测到成骨细胞特异性分子标记Collagen I,OPN,Run X2和ALP阳性表达;以上研究表明肌肉卫星细胞在体外培养的过程中具有多分化潜能特性。4.分别采用心脏毒素(Cytotoxin,CTX)和胶原酶构建小鼠肌肉损伤模型与肌腱损伤模型,H&E(Hematoxylin-Eosin Staining,)染色显示肌肉和肌腱组织正常结构均被破坏,血清检测发现CK均明显超出正常范围表明建模成功。对肌肉卫星细胞进行CM-Dil细胞示踪剂标记,将标记的细胞直接注射到小鼠肌肉损伤位点,荧光显微镜下可见组织中分布标记的细胞,血清检测显示干细胞移植组CK值与损伤组和生理盐水组相比有所降低,研究结果表明,对两种模型进行干细胞移植后可在三周内稳定的迁移到相应组织中对损伤可能具有一定的作用。综上所述,本实验在体外成功分离培养了肌肉卫星细胞与肌腱干细胞,并对其生物学特性和多分化潜能进行了研究,通过体外小鼠肌肉损伤模型移植,肌肉卫星细胞移植后可在三周内稳定的迁移到相应组织中,对小鼠肌肉损伤具有一定的恢复作用,并初步为以干细胞为基础的细胞疗法治疗损伤、促进组织再生修复的临床应用提供实验依据。
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