关键词：
脾气虚
GC-MS技术
代谢组学
人参
作用机制
摘要：
目的:脾气虚证常见于中医临床,是因脾气不足所表现的虚弱证候,而筛选出与脾气虚证相关的差异代谢物有助于临床诊断。人参作为传统中药治疗脾气虚证已有数千年的历史。本研究旨在基于GC-MS技术和代谢组学技术探讨人参对脾气虚证的治疗作用及作用机制。方法:1.将60只Wistar雄性大鼠随机分为空白对照组(C)、模型对照组(M)、阳性对照组(Y,参苓白术散,1.7 g/kg·bw)、人参低剂量组(GL,生药浓度0.41g/kg·bw)、人参中剂量组(GM,生药浓度0.81 g/kg·bw)、人参高剂量组(GH,生药浓度1.62 g/kg·bw)。利用“饮食失节+疲劳过度”复合法制备脾气虚证大鼠模型;以脾脏组织病理改变、IL-2,IL-6,TNF-ɑ,IFN-γ,SIg A和D-xylose水平以及体重指数为指标,考察人参对脾气虚证大鼠的治疗作用。2.制备大鼠血清、尿液和粪便样品,采用GC-MS技术进行代谢组学分析。采用多元统计分析处理所得数据,如:PCA和OPLS-DA等。结合数据库中的精确质谱和文献分析,筛选与脾气虚证相关的差异代谢标志物。通过分析关键差异代谢物的相对浓度,以及代谢通路富集研究,从而初步阐明人参对脾气虚证大鼠的作用机理。3.通过GC-MS技术,对粪便中丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸共5种短链脂肪酸进行定量分析,从而考察人参对脾气虚证肠道菌群代谢产物短链脂肪酸的影响。4.将代谢通路与信号通路进行关联分析,采用Western blot方法,检测Keap1/Nrf2/ARE信号通路中的Keap1、Nqo1、Nrf2、HO-1蛋白,验证人参通过调控Keap1/Nrf2/ARE信号通路,进而发挥人参对脾气虚治疗的作用机制。结果:***组可显著改变脾气虚大鼠的体征,可显著改善脾气虚大鼠的体重增长缓慢的情况。通过对HE切片的观察结果表明,GH组可恢复脾脏指数,使其基本恢复趋于正常水平。通过对IL-2、IL-6、TNF-ɑ、IFN-γ、SIg A和D-xylose进行测定,发现GH组可显著提高免疫力。结果表明,GH组可显著调节免疫力,调节效果强于GM、GL组,与Y组持平。人参具有改善脾气虚证的治疗作用。2.在血清中共鉴定出29种潜在的差异代谢物,包括二氢胸腺嘧啶、乙醛酸、二甲基甘氨酸、β-丙氨酸和羟基丙酮酸等。代谢途径主要与酮体的合成与降解、甘油脂代谢、丁酸代谢、β-丙氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢以及戊糖磷酸途径相关。在尿液中确定了34个潜在的差异代谢物,包括1,3-二氨基丙烷、次牛磺酸、甘氨酸、甘油、β-丙氨酸、双氢尿嘧啶和二羟基丙酮等。代谢途径主要涉及了甘油酯代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、β-丙氨酸代谢和甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸途径。在粪便中共鉴定出79种潜在的差异代谢物,包括次牛磺酸、甘氨酸、甘油、二羟基丙酮、L-α-氨基丁酸、L-苏氨酸等。代谢途径主要与组氨酸代谢、磷酸戊糖途径、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢和氨酰-t RNA生物合成途径相关。3.对粪便中的短链脂肪酸进行定量分析,M组粪便中的丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸的含量较C组明显降低,样本中各短链脂肪酸受各给药组调节的范围和强度略有不同,GH组对丙酸的调节作用优于其他给药组,与Y组持平,说明GH组给药效果好,从而考察人参对脾气虚证肠道菌群代谢产物短链脂肪酸的影响。4.将代谢通路和信号通路进行关联,发现Keap1/Nrf2/ARE信号通路与代谢通路有关。用Western-blot进行验证,初步探讨了人参发挥作用的分子机制。人参可使Keap1蛋白表达含量相对减少,使Nqo1、Nrf2、HO-1蛋白表达含量相对增加,从而起到抗氧化应激的作用。结论:通过建立脾气虚证大鼠模型、生物信息学和代谢组学分析方法,明确了机体处于脾气虚状态下的血液、粪便与尿液的代谢组学变化,短链脂肪酸含量的变化,并初步阐明人参治疗脾气虚证的作用机制,为人参进一步开发利用提供新思路及理论依据。
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