关键词:
肝素/硫酸乙酰肝素
栉孔扇贝
皮氏蛾螺
抗凝活性
抗肿瘤转移活性
酶法硫酸化修饰
摘要:
肝素(heparin,Hep)/硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)是由β-D-葡萄糖醛酸(β-D-glucuronic acid,GlcA)或 α-L-艾杜糖醛酸(α-L-iduronic acid,IdoA)和 α-N-乙酰-D-葡萄糖胺(α-N-acetyl-D-glucosamine,GlcNAc)通过 1→4糖苷键连接组成的二糖单元重复连接而形成的一种酸性直链多糖,Hep/HS可以与体内各种各样的蛋白配体相互作用,与机体的生理病理活动息息相关,并且Hep/HS在医药领域也具有十分重要的应用。然而,Hep在临床上的应用会带来一定的出血性风险,甚至诱发严重的药物不良反应;目前Hep/HS主要提取自猪小肠粘膜或牛肺等哺乳动物组织,存在一定的生物安全风险和宗教限制。当前,随着Hep/HS的应用和需求的不断增加,亟需拓展Hep/HS的来源,在避免已有Hep/HS产品所存在的生物安全风险及宗教限制的同时,寻找和鉴定具有新颖结构和功能的Hep/HS成为迫切需求。
海洋占地球表面积的70%以上,具有最为多样的生境,蕴含着多种多样的动植物资源,是一座亟待开发的药物资源宝库。近年来,研究人员已经从海洋动物中发现了一系列结构新颖的Hep/HS,这些Hep/HS表现出各种重要的生物学活性。海洋动物来源的Hep/HS具有资源丰富、结构和功能更加多样、生物安全风险低、不受宗教因素限制等优点。因此,海洋是寻找和开发利用新型Hep/HS的理想资源宝库。为从海洋动物中寻找和鉴定具有新颖结构和功能的Hep/HS,本论文首次对栉孔扇贝(Chlamys farreri)加工副产物裙边和低值海产品皮氏蛾螺(Volutharpaampullaceaperryi)腹足中所含Hep/HS的结构和功能进行了深入研究,并进一步对皮氏蛾螺腹足来源的HS的结构进行了酶法修饰改造,显著提高了其抗凝活性。具体研究结果如下:
1.栉孔扇贝裙边来源新型HS(CMHS)的分离提取与结构鉴定:本研究以栉孔扇贝加工过程中产生的大量低食用价值的裙边为研究对象,通过蛋白酶解、三氯乙酸除蛋白、阴离子交换层析从其中分离得到了一种糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)组分,琼脂糖凝胶电泳分析表明该GAG组分是一种高度纯化的HS,命名为CMHS,其收率达到6.8mg/g干重;分子排阻色谱分析表明,CMHS的分子量约35.9 kDa,高于商品化及大部分海洋动物来源的Hep/HS;酶解分析表明,CMHS不能被肝素酶Ⅰ或Ⅲ彻底降解,预示着其含有不同于普通Hep/HS的特殊结构;进一步利用HPLC和MS对酶解产物中未知结构的分析显示,CMHS中很可能含有稀有的3-O-硫酸化GlcA残基;最后,利用1D NMR(1H NMR、13C NMR)和 2D NMR(1H-1H COSY,1H-13C HSQC和TOCSY)对CMHS结构进行表征,进一步确证CMHS是一种富含6-O-硫酸化葡萄糖胺残基(约80%)和稀有3-O-硫酸化GlcA的新型HS。CMHS新颖而独特的结构预示着其可能具有特殊的生物学活性。
***的生物学活性评价:在对CMHS结构分析的基础上,我们研究了CMHS的抗凝血活性、与各种生长因子的相互作用及其在体外和体内的抗肿瘤活性。抗凝活性分析表明,CMHS的抗凝血活性温和,抗IIa因子和抗Xa因子活性分别为26 IU/mg和24 IU/mg,仅为商品化Hep的1/9至1/10;相互作用分析表明,CMHS可以与aFGF、bFGF、HGF、PTN和HBEGF以强亲和力结合,其中CMHS与HGF(KD=0.017 nM)和PTN(KD=2.23 nM)亲和力显著高于Hep 与 HGF(KD=0.2-3 nM)和 PTN(KD=4.0-16.1 nM)的亲和力,这可能是由于CMHS富含6-O-硫酸化GlcNAc和3-O-硫酸化GlcA所致;在细胞水平上,CMHS可以竞争性抑制Glypican-3介导的Wnt在细胞表面的结合,从而抑制Wnt细胞信号转导;在体外,CMHS可以显著抑制多种肿瘤细胞增殖,而在体内其可以显著抑制4T1肿瘤细胞肺转移。以上结果表明,CMHS具有相当温和的抗凝血活性,可以通过与多种生长因子结合,竞争性抑制细胞信号转导,从而抑制肿瘤细胞生长和转移,是一种潜在的HS类抗肿瘤药物候选。
3.皮氏蛾螺腹足来源新型HS(VpHS)的结构鉴定与生物学活性的初步评价:本研究通过蛋白酶酶解、三氯乙酸除蛋白、阴离子交换层析结合分子排阻色谱从皮氏蛾螺腹足中纯化得到一种主要的GAG组分,琼脂糖凝胶电泳分析表明,该GAG组分是一种高度纯化的HS,命名为VpHS,其收率约为3.1 mg/g干重;分子排阻色谱法分析表明,VpHS的分子量约为30.4kDa,高于商品化H