关键词:
鹅源坦布苏病毒
遗传进化分析
生物学特性
致病性
摘要:
水禽坦布苏病毒病是一种以水禽产蛋下降、生殖系统受损为主要特征的新发传染病,病原为坦布苏病毒(Tembusu Virus,TMUV)。近年来,由于鹅养殖数量激增等原因,鹅群中坦布苏病毒频发。同时,坦布苏病毒出现变异,新划分了一个分支Cluster 3,该分支毒株可感染多种动物。本研究旨在分析鹅源Cluster 3坦布苏病毒的基因组变异情况及其对鹅、对小鼠的致病性,为进一步研究Cluster3坦布苏病毒的宿主范围与后续的致病机制研究提供理论参考。
本研究从广东省江门市的鹅养殖场中病死鹅肝脏、脾脏样品中检测到2份鹅源坦布苏病毒的核酸阳性样品,利用乳仓鼠肾细胞(BHK-21)进行病原分离,间接免疫荧光鉴定、透射电镜鉴定得到2株鹅源坦布苏病毒(命名为JM3株、JM1205株)。对JM3株、JM1205株进行遗传演化分析,E基因进化树结果显示2株分离株均属于Cluster 3分支,与2020年鸡源分离株CTLN株、2020年蚊源分离株YN2020株最为接近,表明该分支毒株可感染多个宿主。与现有疫苗株DF-2相比,本研究毒株存在多个氨基酸位点突变,一些突变位点位于抗原表位中,可能导致分离毒株的毒力发生改变。
为探究2株分离株对其自然宿主雏鹅的致病性,选取51只30日龄雏鹅进行致病性实验,17只/组,12只用于剖杀,5只用于观察。感染组腿部肌肉注射1×10~7TCID50病毒液,对照组注射同剂量含100U/m L青-链霉素的DMEM,感染后每天采集观察组咽拭子、肛拭子和体重数据,分析排毒、体重增长规律。在感染后1 d、3 d、5 d、7 d于剖杀组定量随机剖检,观察感染组脏器病变情况,收集病变脏器用于切片制备与病毒载量检测,于感染后14 d剖检剩余全部动物。结果显示2株分离株均对雏鹅有致病性,但不致死,可引起雏鹅脾脏肿大、卵巢出血、胰腺出现白色坏死点、肝脏发白等病变;感染组JM3、JM1205的雏鹅分别于感染后第9 d、第7 d出现共济失调的症状;雏鹅感染病毒后第1 d开始从呼吸道和消化道排毒,感染JM1205株的雏鹅于感染后第12 d结束排毒,而感染JM3株的雏鹅直至感染后14 d仍在排毒;感染后脾脏载毒量最高,感染JM1205株的雏鹅脾脏在3 dpi时病毒载量达到104.8copies/mg;感染JM3株的雏鹅脾脏在1 dpi时病毒载量达到104.4copies/mg。组织切片观察可见心肌细胞坏死、脑内神经元固缩等病变情况出现。
为探究2株分离株能否感染哺乳动物,本研究选取180只3周龄ICR小鼠进行致病性实验,30只/组,15只用于定期剖杀,15只用于观察。感染组分别通过颅内、皮下途径感染2.94×10~5TCID50的病毒。每天采集体重数据,分析体重增长规律;感染后1 d、3 d、5 d、7 d于剖杀组随机定量剖检,观察组织脏器病变情况,收集病变脏器用于切片制备与病毒载量检测,感染后14 d剖检所有动物。颅内途径感染JM3株的小鼠于7 dpi时出现后肢瘫痪、眼部有脓性分泌物等典型临床症状,并于第9天开始死亡;颅内途径感染JM1205株的小鼠于2 dpi开始死亡,死亡小鼠表现为消瘦、精神沉郁,其余小鼠未见明显症状;皮下感染组未出现明显症状。利用q RT-PCR检测感染组小鼠各脏器不同时间段的病毒载量,结果表明JM3株、JM1205株均可在小鼠体内各脏器中复制,在脑组织中的病毒载量最高,颅内感染JM3株的小鼠脑组织病毒载量可达107.3copies/mg,在肾中的病毒载量可达106.2copies/mg;颅内感染JM1205株的小鼠脑组织中的病毒载量可达106.1copies/mg;值得注意的是,7 dpi时,皮下感染JM1205株的小鼠大脑组织拷贝数高达106.1copies/mg,说明皮下途径也可有效感染小鼠。组织切片观察可见多个组织细胞出现坏死情况,如脑内神经元细胞坏死、肝细胞坏死等。
综上所述,本研究初步探究鹅源Cluster 3坦布苏病毒JM3株、JM1205株的分子特征,同时进行了雏鹅、小鼠的致病性实验,研究结果可为坦布苏病毒的防控及疫苗研制提供理论依据。