关键词:
植物乳杆菌
生物学特征
氧化胁迫
转录物组
谷氨酸脱羧酶
摘要:
背景肿瘤治疗作为困扰全人类的一项重大难题,临床一般通过手术切除、放疗化疗等尽可能抑制肿瘤的发生转移。目前,诱导肿瘤细胞氧化应激是放化疗主要的作用机制,高能量射线和化学药物持续作用于恶性肿瘤,产生的过量活性氧自由基(ROS)引起细胞和组织中的DNA、蛋白质等生物大分子变性、脂质过氧化,多种细胞凋亡信号途径被激活,加速肿瘤细胞凋亡、自噬。但是,长期接受放化疗的患者,ROS毒副反应大量积累,氧化胁迫干扰加剧,患者胃肠道微生态系统容易受到影响。益生菌制备的微生态调节剂作用于受损的胃肠道系统,有助于提高胃肠道黏膜防御能力,减少致病菌定植,维持肠道微生态系统稳态。然而,目前在临床应用上尚缺乏既能够抗氧化胁迫,又可以调节肠道菌群的益生菌类微生态调节剂。目的分析植物乳杆菌SAL(Lactobacillus plantarum SAL)的生物学活性,筛选出*** SAL抗氧化胁迫的关键靶点基因,并验证靶点基因的可靠性,探寻*** SAL抗氧化胁迫的分子机制和代谢途径。方法*** SAL的生物学特征配制含0-8 g/100 m L Na Cl的MRS培养基,含0.1%-0.5%胆盐浓度的MRS培养基,p H为1.5-2.5含1 g/100 m L胃蛋白酶的人工胃液,含1 g/100 m L胰蛋白酶的人工肠液。耐高盐和耐胆盐试验计数培养至生长对数末期的活菌数,人工胃液耐受试验计数培养1 h、2 h、4 h后的活菌数,人工肠液耐受试验计数培养2 h、4h、6 h后的活菌数。利用双层琼脂夹心法结合滴种法检测*** SAL对6株指示菌的抑菌活性。*** SAL响应氧化胁迫的调控机制设置不同浓度梯度的HO培养条件,建立*** SAL抗氧化胁迫模型。RNA-seq高通量测序技术筛选*** SAL氧化胁迫模型下的差异表达基因集。利用生物信息学技术探寻*** SAL的氧化胁迫应激机制:差异表达基因集进行GO、KEGG富集分析;依次利用STRING在线工具、Cytoscape软件构建蛋白质互作网络;利用Centiscape插件和MCODE插件,通过设置参数,分别筛选出符合参数标准的枢纽基因、瓶颈基因和核心基因;利用Venn在线工具获取三种基因的交集,最终获得发挥关键作用的抗氧化胁迫调控基因。*** SAL gad B基因的功能分析优化*** SAL gad B基因序列,构建大肠埃希菌p Smart-I-gad B原核表达系统。IPTG诱导目的蛋白大量表达,利用Ni柱亲和层析法吸附并纯化获得含6×His标签的SUMO-GAD融合蛋白,通过柱前PITC衍生高效液相色谱法检测融合蛋白酶活,检测BL21(DE3)/p Smart-I-gad B重组菌株的抗氧化能力。4.L-谷氨酸对*** SAL抗氧化胁迫的影响设置0-3%浓度梯度的L-谷氨酸培养液,检测L-谷氨酸对*** SAL的最适添加浓度。通过添加作用底物L-谷氨酸,间接验证GAD蛋白表达对于*** SAL抗氧化胁迫的影响。结论*** SAL具有较好的益生特性。在高盐、人工胃液等胁迫条件下的生长情况优于经典株*** WCFS1,在胆盐、人工肠液等胁迫条件下与经典株旗鼓相当,只有抑菌活性稍逊于经典株。2.建立了5 m M HO刺激0.5 h的*** SAL氧化胁迫模型。转录物组测序共计得到313个差异表达基因,其中149个表达上调、164个表达下调。差异基因集主要注释在GO数据库RNA转录过程、核糖体蛋白组成、细胞结构分子活性等方面,以及KEGG通路数据库核糖体通路、脂肪酸生物合成、脂肪酸代谢等途径上。通过Cytoscape可视化网络筛选,得到关键基因gad B和pur A,且两者上调表达均与细菌新陈代谢途径以及丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢途径相关。经q PCR验证发现gad B基因在细菌细胞内表达量更高,与转录物组测序结果一致。3.成功构建BL21(DE3)/p Smart-I-gad B原核表达系统。经0.8 m M IPTG,37℃诱导4 h得到分子量约为66.91 k Da的SUMO-GAD重组融合蛋白的优化表达,且以包涵体形式为主,利用Ni柱亲和层析方法获得纯化的重组蛋白,其表达量为0.202 mg/L,酶活为14.06 U/mg。4.在培养环境中添加1.5%L-谷氨酸能够增强*** SAL的抗氧化胁迫作用。