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关键词： 线粒体   呼吸状态   氧化磷酸化   呼吸控制   P   O比   胁迫  

摘要： 线粒体呼吸状态是指当线粒体中呼吸底物及ADP以不同浓度存在时线粒体的呼吸速率,它是用来研究线粒体功能的重要指标。本文结合我们的研究经验,详细阐述了线粒体呼吸状态的研究方法,介绍了该方法在分析线粒体电子传递链功能和氧化磷酸化活性中的应用,此外概述了线粒体呼吸状态的测定和分析方法在植物生理生态研究中的具体应用。

关键词： 益生菌   植物乳杆菌   菌株分离鉴定   生物学特性   饲料添加  

摘要： 植物乳杆菌是健康动物肠道的正常菌群，具有预防肠道疾病和促进健康的作用，因此，植物乳杆菌可以作为益生菌添加到动物饲料中。本研究的目的是分离筛选出具有良好益生特性的植物乳杆菌，为开发具有自主知识产权的动物微生态制剂奠定基础。\n 本研究以采集的健康猪直肠内容物作为菌种来源，采用选择培养基和厌氧选择性培养，分离出4株疑似菌株，依据伯杰氏手册中植物乳杆菌的特征，结合菌落特征、菌体形态、生理生化试验和16S rRNA基因序列分析结果，鉴定出2株植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌CQ和CY。\n 以抑菌性、抗逆性和繁殖能力作为植物乳杆菌CQ和CY进一步筛选的指标,筛选候选苗株。结果显示，菌株CQ和CY对革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性（G-）肠道致病菌具有明显的抑菌作用；能耐受pH2.5的强酸性环境，可在0.3%的高胆盐浓度下存活，能耐受80℃30 sec的高温，并保持较高的活菌数；繁殖速度快，迟缓期短。\n 为确保候选菌株饲喂动物的安全性，对植物乳杆菌CQ和CY进行了安全性能评价，包括抗生素敏感性和动物急性毒性试验。结果显示，菌株CQ和CY的耐药性与常用植物乳杆菌相比没有明显优势，即对多种常用抗生素，如氨基糖苷类、多肽类、喹诺酮类和万古霉素具有耐药性，属于多重耐药，但对头孢菌素类、磺胺类、β-内酰胺类、大环内酯类和呋喃类中的大部分抗生素敏感；饲喂小鼠不引起动物产生不良反应和死亡。结果表明，菌株CQ和CY为相对安全无毒性菌株。\n 本论文从植物乳杆菌菌株分离鉴定、生物学特性和安全性评价三个方面进行研究，筛选到2株抑菌效果好、抗逆性强、繁殖速度快、安全无毒的植物乳杆菌菌株，为开发具有自主知识产权的植物乳杆菌微生态制剂奠定了基础。

关键词： Microgravity   plant biology in space   radiation   spaceflight  

摘要： Gravity has shaped the evolution of life since its origin. However, experiments in the absence of this overriding force, necessary to precisely analyse its role, e.g. for growth, development, and orientation of plants and single cells, only became possible with the advent of spaceflight. Consequently, this research has been supported especially by space agencies around the world for decades, mainly for two reasons: first, to enable fundamental research on gravity perception and transduction during growth and development of plants;and second, to successfully grow plants under microgravity conditions with the goal of establishing a bioregenerative life support system providing oxygen and food for astronauts in long-term exploratory missions. For the second time, the International Space Life Sciences Working Group (ISLSWG), comprised of space agencies with substantial life sciences programmes in the world, organised a workshop on plant biology research in space. The present contribution summarises the outcome of this workshop. In the first part, an analysis is undertaken, if and how the recommendations of the first workshop held in Bad Honnef, Germany, in 1996 have been implemented. A chapter summarising major scientific breakthroughs obtained in the last 15years from plant research in space concludes this first part. In the second part, recommendations for future research in plant biology in space are put together that have been elaborated in the various discussion sessions during the workshop, as well as provided in written statements from the session chairs. The present paper clearly shows that plant biology in space has contributed significantly to progress in plant gravity perception, transduction and responses - processes also relevant for general plant biology, including agricultural aspects. In addition, the interplay between light and gravity effects has increasingly received attention. It also became evident that plants will play a major role as components of

关键词： 山白树   大小孢子发生   雌雄配子体发育   ITS   保护策略  

摘要： 山白树（Sinowilsonia henryi Hemsi.）为金缕梅科（Hamamelidaceae）山白树属（Sinowilsonia）的落叶乔木，分布于陕西、山西、河南、甘肃、湖北及重庆等地。山白树具有重要的科研价值、经济价值和环保价值，但目前其野生种群稀少，濒临灭绝，已被列为陕西省第一批保护物种和国家Ⅱ级重点保护植物。目前山白树的研究涉及形态解剖学、孢粉学、植物化学、地理分布等方面，但对其胚胎发育、遗传多样性分析等方面的研究报道尚属空白。本研究采用常规石蜡切片和ITS序列分析技术对山白树的胚胎学、群体遗传多样性分析及其致濒机制进行了研究，旨在揭示山白树的致濒机理并为保护该濒危植物制定科学有效的保护策略提供必要的基础资料。主要得到以下结论： 1.花药发育特征 山白树雄蕊发育初期，形成雄蕊原基，位于其下四个角隅的表皮下一层细胞分裂活跃，形成孢原细胞。孢原细胞进行平周分裂，产生初生周缘细胞和初生造孢细胞，初生周缘细胞经过2次分裂形成花药壁细胞。花药有2个室，花药壁完全分化时，从外至内依次是表皮、药室内壁和绒毡层。 2.小孢子发生 每一花药中有一层雄性孢原细胞，发生于幼小花药表皮下方。孢原细胞进行平周分裂，产生初生周源细胞和初生造孢细胞。在小孢子母细胞减数分裂形成四分体，随后很快分开，游离在药室中，成为单核花粉粒。随着细胞的长大细胞质中出现液泡，并逐渐合并成中央大液泡，细胞质和细胞核移到一侧。成熟花粉粒外形呈球形，具有三个萌发孔。 3.大孢子发生及雌配子体发育 在幼嫩子房内，胎座上分化出2枚胚珠原基。孢原细胞经过平周分裂，形成外侧的周缘细胞和内侧的造孢细胞。外侧的周缘细胞随后进行多次平周分裂和垂周分裂，使珠心顶端的珠心细胞层数增加。造孢细胞则发育成胚囊母细胞，胚囊母细胞接着进行减数分裂，形成线状四分体，四个细胞中只有远离珠孔的1个大孢子细胞继续发育成单核胚囊。单核胚囊第一次分裂形成两核，随着液泡的形成，这两个核分别移至胚囊两端，形成二核胚囊。山白树胚珠的发育属于蓼形胚囊。 4.遗传多样性分析 通过对山白树DNA提取，rDNA-ITS区PCR扩增和序列测定。利用Clustal、DnaSP、MEGA、和Alequine等软件进行了群体遗传分析。结果表明，ITS排序后总长度均为817bp，无gap(空位)。整个ITS共有15个变异位点，11个转换位点，4个颠换位点，信息位点数达到11个。AMOVA分析得出山白树的遗传分化系数FST为0.5063，说明山白树的遗传变异主要存在于居群间，在物种水平和群体水平上的遗传多样性低，居群间遗传分化明显。Mantel测试结果（r=0.51，p=0.01）表明居群间的遗传距离与地理距离有相关性，说明地理隔离对山白树居群遗传结构的形成具有重要的作用。 5.致濒机制和物种保护 山白树濒危来自其内因和外因两方面。内因主要体现在两方面：一是山白树有限的生态幅使其对环境变化的适用性差;二是该物种生长缓慢、种群小，产生遗传漂变等。外在因素主要体现在人为破坏其生境使山白树的有效群体下降，导致山白树群体内近交几率增加和近交衰退，最终使其适用性和生活力下降。山白树居群的遗传结构受到长期的进化和生态历史的影响，包括分布范围的改变，生境片段化和居群隔离等。因此，为防止其遗传多样性的降低，本研究在小居群和大居群兼顾的前提下，制定了以就地保护为主的保护策略。

关键词： 大豆苷元   MG63   凋亡   分化   迁移   PPARγ  

摘要： 研究背景： 骨肉瘤(osteosarcoma)是骨组织中最常见的一种恶性程度高的骨肿瘤,其发生很可能起源于成骨细胞终末分化以及骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的过程中。骨肉瘤细胞具有显著的早期迁移能力与局部侵袭性,而这一特性也成为了骨肉瘤患者晚期致死的主要原因。因此深入研究骨肉瘤细胞的凋亡、分化及侵袭迁移等过程的信号通路,并寻找可以有效的逆转肿瘤细胞发生发展的分子靶点,可为骨肉瘤治疗及肿瘤转移抑制提供有价值的理论和实验依据。研究表明,配体依赖转录因子核激素受体超家族的成员过氧化物酶体增殖活化受体(peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR) Y对多种肿瘤细胞凋亡和分化起着重要调控作用。近年来研究显示,植物雌激素具有预防和抑制多种肿瘤,如乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、结肠癌等的作用。作为PPARY激动剂配体的植物雌激素成员之一的大豆苷元(daidzein, DAI),是一种从日常豆类食品中提取出来的黄酮类化合物,其药理作用丰富,可诱导肿瘤细胞的凋亡、分化,且可抑制肿瘤迁移及癌组织血管生成的相关基因,但其机制目前尚未完全阐明。因此,探讨DAI对人骨肉瘤细胞的凋亡、分化及生物学性状的影响,揭示其作用机制,将为骨肉瘤的临床治疗提供新的思路和策略。 研究目的： 本研究选择人骨肉瘤细胞MG63为实验对象,探讨不同浓度的植物雌激素DAI对MG63细胞增殖活力、凋亡及细胞侵袭、迁移等生物学性状的影响；同时观察低浓度的DAI对MG63细胞诱导分化的作用及其可能的分子机制。以期对恶性肿瘤的治疗找到更适合的毒性更小的方法和策略,为临床治疗提供更多实验依据。 方法： 1.采用噻唑蓝(MTT)比色法检测浓度为0μM、1μM、10μM、20μM、40μM、80gM和160μM的DAI在不同时间内对MG63细胞增殖的影响。 2. AV-FITC/PI双荧光标记流式细胞术检测浓度为0μM、20μM和80gM的DAI作用24h和48h,细胞早期凋亡情况。 3. Tune1法检测DAI对MG63细胞凋亡的影响。 4.实时荧光定量PCR (Q-PCR)检测浓度为0μM、20μM、40μM和80gM的DAI干预后,细胞凋亡与分化等相关基因表达量的变化。 5.磷酸苯二钠法测定不同浓度的DAI干预后,细胞内碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)表达活性的改变。 6.微量酶联免疫法(ELISAL)检测不同浓度的DAI干预后,I型胶原含量的变化。 7.茜素红染色法观察不同浓度DAI干预后,MG63细胞内钙盐沉积的情况。 8.划痕实验观察浓度为0μM、20μM、40μM和80μM的DAI对MG63细胞迁移的影响。 9. Transwell侵袭实验观察浓度为0μM、20μM、40μM和80μM的DAI对MG63细胞侵袭能力的影响。 10.免疫细胞化学技术(immunocytochemistry, SP)检测0μM、20μM、40μM和80gM的DAI干预后MG63细胞侵袭迁移及凋亡相关蛋白表达的变化。 结果： 1)MTT检测结果显示：DAI可以抑制细胞的增殖活力,且随着药物浓度的增加和作用时间的延长,抑制作用增强,各组间比较其差异有统计学意义(P<0.01)。 2) AV-FITC/PI双荧光标记流式细胞术检测结果显示：不同浓度的DA1分别干预MG63细胞24h和48h后,干预组的凋亡率较对照组均升高(P<0.01),其中80μM组的凋亡率明显高于20gM及对照组；80μM浓度时,48h凋亡率显著高于24h。 3) Tunel检测结果显示：DAI干预MG63细胞后,各干预组细胞凋亡阳性染色结果均高于对照组(P<0.01),且阳性率与DAI浓度呈正相关。 4) qPCR检测结果显示：各浓度组DAI干预MG63细胞48h后,PPARy表达量较对照组均升高(P<0.01),且随干预浓度增加而增强,而Runx2的表达含量较对照组降低(P<0.01)。 5)碱性磷酸酶(ALP)检测结果显示：10μM、20μM和40gM低浓度的DAI作用于细胞6d、9d和12d后,三个时间点检测ALP活性较对照组均升高,且在DAI作用的浓度区间内ALP活性与干预细胞的DAI浓度呈正相关,在9d其活性到达峰值(P<0.01) 6)Ⅰ型胶原蛋白检测结果显示：10μM、20μM和40gM低浓度的DAI作用的MG63细胞I型胶原的相对表达含量均高于对照组(P<0.01),经同一时间点组间两两比较,除了1d和24d的20μ M与40μM组无显著差异外其它各组间均有差异(P<0.05)。I型胶原的相对含量可随D

关键词： 羊角槭   生境条件   开花生物学   种子休眠   配子体发育  

摘要： 羊角槭(Acer yanjuechi Fang et ***)为槭树科(Aceracae)槭树属(Acer)落叶乔木,特产于浙江省临安市西天目山,生于海拔750～900米的亚热带常绿、落叶阔叶混交林中,为我国特有的古老孑遗植物、国家二级保护树种,具有科学研究和景观应用的重要价值。本文对羊角槭生境条件、开花生物学特性、配子体发育、破除休眠等方面进行了研究,初步探讨了羊角槭的濒危机制,并提出科学合理的保育策略。主要研究结果如下:(1)对天目山自然保护区人工栽植羊角槭进行了生境条件调查和土壤养分分析,为制定羊角槭人工栽植保护策略提供科学依据。结果表明,各立地土壤养分变幅较大,其中有机质52.24～217.25g·kg-1,碱解氮170.82～***-1,有效磷7.85～20.25mg·kg-1,速效钾140～450mg·kg-1,pH 4.78～7.06。土壤养分,氮,磷,钾的比例失衡,表现为氮质量分数较高和有效磷不足。调查发现土壤养分含量、pH值、光照条件及生境郁闭度均对羊角槭的生长发育有重要影响。土壤肥沃、呈酸性,阳光充足的地方羊角槭生长健壮、结实较好。(2)羊角槭4月初现蕾,4月中旬进入盛花期,9月底果实成熟;羊角槭在不同生境下表现出不同的开花物候特征;羊角槭的花序中,主轴花多为两性花,极少数为雄花,分枝轴多为雄花,只个别基部二级分枝轴顶端着两性花。(3)采用常规石蜡切片技术,对濒危植物羊角槭大孢子发生及雌配子体的发育过程进行观察研究,并分析了其败育的原因。结果表明:羊角槭子房2心皮2室,每室各2枚倒生胚珠,基生胎座,双珠被,厚珠心;大孢子四分体直线型排列,合点端的大孢子为功能大孢子,胚囊发育为寥型;羊角槭雌配子体发育时期,2枚倒生胚珠中多数在后期仅有一个发育成为种子;在羊角槭胚胎发育过程中,出现胚珠败育、胚囊退化及珠心组织细胞死亡等现象,因此,羊角槭在雌配子体发育过程中存在严重的生殖障碍,是使其濒危的一个重要原因。(4)连续3年调查统计了浙江天目山自然保护区人工种植羊角槭不同立地单株种子发育结实情况,并以10月采收的成熟种子为材料,研究种子不同部位(外种皮、内种皮、胚)甲醇提取液对种子萌发的抑制作用以及不同处理(剥除外种皮、激素浸种)对打破休眠促进萌发的影响。结果表明,羊角槭种胚发育不良且单株个体间存在差异,3年平均饱满种胚率仅7.81%～31.81%,种胚平均生活力52.22%,不同年份气候变化对羊角槭种子发育产生一定影响;甲醇提取液对白菜种子萌发影响的试验结果表明,羊角槭内、外种皮与种胚中均存在萌发抑制物质,外种皮与种胚的抑制作用更强;剥去外种皮进行低温沙藏能显著提高种子发芽率,配合以100mg·L-1 GA3或200mg·L-16-BA浸种12h可进一步提高羊角槭种子发芽率,达46.67%与43.33%,实现有生活力种子萌发率达80%以上,可推荐作为打破羊角槭种子休眠促进萌发技术在生产上应用。

关键词： 火龙果   品种区别   植物形态   生物学特性   果实品质  

摘要： 火龙果(Hypocereus undulates Britt.&Rose),是一种原产于墨西哥南部及中美洲诸国的太平洋沿岸地区的热带果树,具有较高的营养价值、药用价值以及观赏价值。但火龙果的种植生产作为目前比较新兴的产业,由于商业化栽培开展的时间较晚,因此在植物学和生物学特性、品种分类、良种育种、栽培管理技术、采后贮藏、产品加工等领域的研究较少,相对于其他热带果树而言,需要进一步深入的研究。因此,本试验选择9个不同品种品种的火龙果,对其植物学特性、生物学特性,物候期表现进行观察、比较和区别,以及果实品质比较和评价,期望达到了解不同品种品种的特性和区别的目的,为生产上制定栽培管理技术措施提供参考依据。试验结果表明： 1.观察的火龙果9个栽培品种以枝条边缘形状为第1级标准,可分为两大类,一类是量天尺品种群,枝条呈三棱形,并且枝条边缘有较明显的突起,呈齿状或波浪状；而另一类是蛇鞭柱品种群,枝条形状近似圆柱形,枝条边缘没有较明显的突起；在量天尺品种群中则需要借助其他器官及组织的外形特征,如刺座、花、果等才能对各个品种进行进一步区分。 2.来自不同品种群的红肉品系火龙果可以从成熟枝条的外形特征进行区分,如蛇鞭柱品种群中的黑龙,新枝为紫红色,是区分蛇鞭柱品种群和量天尺品种群中红肉品系火龙果的主要特征之一；此外,量天尺品种群中长红靠近地面的前4节枝为三棱形,而5、6节为四棱形,这一独特枝条特征识别长红火龙果的依据；而其他品种仅从成熟枝条外观则较难区分开。 3.红肉品系火龙果与白肉品系火龙果差别较大的是花与果实颜色的不同,红肉品系的火龙果的花蕾一般呈红色或花被片绿色,而边缘为红色,果实成熟后,红肉火龙果果皮上的苞片一般为暗红色,而长红、柬埔寨红肉、地龙的苞片上还有明显的斑线；白肉品系的火龙果花蕾一般为绿色,在花生长成熟后,花托、花萼依旧为绿色,果实成熟后白肉火龙果果皮上的苞片也为绿色,苞片中间无红色斑线。 4.不同品种火龙果在生物学特征上具有一定的差别,柬埔寨红肉、长龙以及黑龙由于攀援根较少,在支架上攀爬生长的能力较弱,而其他品种均能在支架上攀爬生长。不同品种枝条生长完成的时间为50±2d,成花所需的时间为20±3d,果实完全成熟所需时间为29±3d。 5.不同品种的物候期表现也有差异,黑龙较早完成抽枝,开花也较早,而其他品种营养生长、生殖生长开始的时间略晚于黑龙。与白肉型火龙果相比,红肉型火龙果进入花期较早,花期也较长。在红肉型火龙果中,黑龙的生殖生长阶段容易受到高温以及降雨的影响,且在9个品种中自花或异花授粉率都较低。在相同栽培管理方式下,某些红肉型火龙果品种,如长红、地龙,在现蕾批次和结果批次都多于白肉型火龙果,但在果实收获总数上又略少于白肉型火龙果。从成花率和坐果率来看,黑龙果的落花落果情况较严重,而其他品种均表现良好。 6.对不同品种火龙果风味进行对比后可知,云龙果实品质较好,果实较大较重,且果皮较薄,果实甜度较高,较易出汁,口感细腻,并且无酸味、无果腥味,是较好的鲜食品种。黑龙从外形上看果实个头较小且重量轻,果皮上又带有尖刺,果实风味也一般,因此不太适宜作为鲜食果品,而较适宜作为观赏品种或者嫁接砧木材料。

关键词： 纯钛   层层自组装   植物雌激素   葛根素   染料木素   大豆苷元  

摘要： [目的]　　随着种植义齿在临床上的广泛应用，如何促进种植体与骨之间的骨结合作用成为了研究的热点。通过对种植体进行表面处理，可增大种植体与骨的接触面积，形成利于骨结合的环境从而促进骨结合。层层自组装技术可以将一些带电荷的聚电解质及两性聚电解质引入到固体表面。有学者通过层层自组装技术成功的在纯钛表面构建了胶原透明质酸仿生涂层，体外细胞培养发现此种涂层对小鼠前骨细胞增殖和分化的促进作用较好。因此，我们拟通过层层自组装的方法在纯钛表面构建不同种类不同浓度的植物雌激素仿生涂层，以对涂层表面形态进行观察，并评价组装了不同种类不同浓度植物雌激素仿生涂层的纯钛片对小鼠前骨细胞增殖和分化的影响。　　[方法]　　1.使用金相砂纸逐级仔细打磨直径10mm、厚度1mm的圆形纯钛片，直至钛片表面光滑呈亮白色。用去离子水、无水乙醇、丙酮、去离子水依次超声清洗15分钟后，高温高压消毒。用冷却至室温的混合酸溶液（等体积的98％H2SO4与30％H2O2混合所得）对钛片进行酸蚀，1h后用大量的去离子水反复冲洗钛片至钛片表面呈中性，烘干后置于培养皿中，保鲜膜封住待用。　　2.采用层层自组装的方法制备出四种涂层组:不同浓度葛根素仿生涂层组（简称葛根素组），不同浓度染料木素仿生涂层组（简称染料木素组），不同浓度大豆苷元仿生涂层组（简称大豆苷元组）和不含植物雌激素的胶原透明质酸仿生涂层组（简称涂层组）;其中前三组根据含药浓度不同又各分为4小组:1×10-5mol/L组，1×10-6mol/L组，1×10-7 mol/L组和1×10-8 mol/L组;此外，本实验还设有未制备涂层的酸蚀钛片组（简称空白组）。　　3.使用场发射扫描电镜观察各涂层组及空白组的表面形貌。　　4.将小鼠前骨细胞分别接种在各涂层组及空白组培养24h、48h和72h后，采用CCK8法，检测各组在450nm波长时的吸光度值，以评价不同种类不同浓度植物雌激素涂层对小鼠前骨细胞增殖的影响。　　5.将小鼠前骨细胞分别接种在各涂层组及空白组培养96h后，裂解细胞，采用ALP试剂盒测定各组细胞的碱性磷酸酶活性，以评价不同种类不同浓度植物雌激素涂层对小鼠前骨细胞分化的影响。　　6.将小鼠前骨细胞分别接种在各涂层组及空白组培养96h后，提取RNA，采用实时荧光定量PCR法，检测不同种类不同浓度植物雌激素涂层钛片对小鼠前骨细胞的Colla1 mRNA，Runx2 mRNA及Akp-2 mRNA表达的影响。　　[结果]　　1.通过场发射扫描电镜对各组钛片表面形貌的观察可见，空白组表面的竖状纹理较明显，有一些直径微小的孔洞;涂层组的竖状纹理及孔洞不明显;各植物雌激素涂层组的竖状纹理不明显，部分孔洞中可见一些明显不同于涂层组形貌的小颗粒，推测为未溶解的植物雌激素颗粒，故推测各植物雌激素可以随胶原和透明质酸的组装也一并组装到钛片表面。　　2.各植物雌激素涂层组在24h，48h和72h时对小鼠前骨细胞促增殖的作用强于涂层组和空白组，且促增殖作用随着时间的增加也有所增强;其中葛根素组在24h时对细胞增殖的促进作用强于其他两组，大豆苷元组在72h时对细胞增殖的促进作用明显强于其他两组，各组药物在浓度为1×10-6mol/L时作用效果最好。　　3.各植物雌激素涂层组在96h时对小鼠前骨细胞促分化的作用均强于涂层组和空白组，其中各组药物在浓度为1×10-6mol/L时作用效果最好，但相同浓度时各组间作用效果差别不大。　　4.各植物雌激素涂层组在96h时对小鼠前骨细胞Colla1 mRNA，Runx2mRNA及Akp-2 mRNA表达的作用均强于涂层组，其中染料木素组对Colla1mRNA表达的作用强于其他两组，葛根素组对Akp-2 mRNA表达的作用强于其他两组。　　[结论]　　通过层层自组装技术，可在钛片表面成功构建植物雌激素仿生涂层。体外细胞培养的结果显示各植物雌激素涂层组对小鼠前骨细胞增殖、分化的作用均强于涂层组和空白组，且在浓度为1×10-6mol/L时作用效果较好。提示一定浓度的植物雌激素仿生涂层将会促进种植体的骨结合作用。

关键词： 脱细胞神经   Myroilysin酶法   Sondell化学法   牙髓前体细胞   STRO-1   S-100   生物相容性   降解速率   方向性生长   NGF   BDNF  

摘要： 周围神经损伤因可能造成机体感觉和运动功能的部分或全部丧失,从而严重影响机体的功能行使和生活质量,其修复再生一直备受关注。利用组织工程学的原理和方法制备人工神经以修复周围神经缺损是这一研究领域的热点。本课题正是基于此欲构建一种新型的组织工程化神经移植物并对其生物学性能进行评价,为获得可桥接周围神经缺损并可促进周围神经再生以及功能恢复的生物性神经移植物做一临床前研究。 第一部分Myroilysin脱细胞异种神经支架的制备与结构观察 目的：制备一种新型脱细胞异种神经支架并对其进行结构观察。 方法：获取新西兰大白兔坐骨神经后,分别利用经典是Sondell化学法和新型Myroilysin酶对其进行脱细胞处理,大体观察并制作组织切片经HE染色、Masson染色后光学显微镜下观察脱细胞神经支架的脱细胞效果、所保留神经基底膜结构以及胶原结构,制作电镜标本通过扫描电镜观察不同方法制备的神经支架的表面物理性状。 结果：经Sondell化学法处理的神经直径基本无变化或稍小于天然神经,但经Myroilysin酶法处理的神经有膨胀现象并且更为透明。组织学观察,Myroilysin脱细胞神经获得了与经典Sondell化学法一致的结果,细胞、轴突、髓鞘结构消失,神经基底膜呈波浪状,胶原纤维排列均匀有序。扫描电镜结果显示Myroilysin酶法比化学法获得的神经支架结构呈现更为明显的纵形沟壑状。 结论：Myroilysin酶法作为一种新型的脱细胞神经支架制备方法,与sondell具有类似的脱细胞效果,并且利用该方法制备的神经支架同样保留有均匀一致的基底膜结构。但Myroilysin脱细胞神经支架更为明显的纵形沟壑状结构可能对种子细胞的生长有“地形诱导”作用,是值得考虑的一种神经支架材料。 第二部分人牙髓前体细胞的培养以及与神经组织细胞相关的蛋白表达 目的：培养牙髓前体细胞并初步鉴定,探讨其作为组织工程化神经移植物种子细胞的可行性。 方法：获取临床就诊的15-18岁患者中因正畸需要拔除并且牙根尚未完全发育完成的第三恒磨牙牙髓组织。按照Gronthos酶消化法进行原代培养,获得牙髓细胞,并进行传代,对其第三代细胞进行免疫荧光染色,鉴定间充质干细胞标记STRO-1和周围神经雪旺细胞标记S-100。 结果：获得了能够高度增殖的细胞,免疫荧光结果显示所培养的细胞中存在STRO-1阳性的细胞,同时也存在S-100阳性的细胞。 结论：本研究所获得的细胞中存在牙髓前体细胞,并且存在与某些神经细胞功能相似的细胞,将S-100阳性的牙髓前体细胞作为周围神经组织工程的种子细胞以获得更具神经营养功能的神经移植物具有一定的可行性。 第三部分Myroilysin脱细胞异种神经支架的生物学性能 目的：评价Myroilysin脱细胞异种神经支架的生物学性能,探讨牙髓前体细胞与该神经支架的生物适合性,为将来构建用于临床使用的新型人工神经提供理论依据。 方法：制备脱细胞神经支架浸提液,与牙髓前体细胞共培养,通过CCK-8细胞增殖试验评价该支架的细胞相容性；将脱细胞异种神经支架植入Wistar大鼠皮下,术后分别在1周和4周取材,制作组织切片镜下观察支架与周围组织的反应以评价其组织相容性。利用Ⅰ型胶原酶酶解天然神经和Myroilysin脱细胞神经,比较二者的胶原稳定性,从而评价其降解情况。将人牙髓前体细胞植入Myroilysin脱细胞神经支架,通过EdU试验,观察细胞在支架上生长的排列模式。将牙髓前体细胞与Myroilysin脱细胞神经浸提液共培养,通过实时荧光PCR相对定量分析支架浸提液对牙髓前体细胞表达神经营养因子NGF和BDNF在mRNA水平的影响。 结果：牙髓前体细胞与Myroilysin脱细胞神经浸提液共培养4天至6天后,其增殖活性高于其单独培养,表现出良好的细胞相容性；该支架材料植入大鼠背部皮下后,虽在植入早期出现急性炎症,但随即呈现组织修复过程,未出现不良反应,具有良好的组织相容性。Myroilysin脱细胞异种神经支架的降解速率与天然神经基本一致。Myroilysin脱细胞异种神经支架可使牙髓前体细胞粘附其上并呈现较为明显的方向性生长方式。牙髓前体细胞与Myroilysin脱细胞异种神经支架浸提液共培养后,神经营养因子NGF和BDNF在mRNA水平出现了上调。 结论：Myroilysin脱细胞异种神经支架具有良好的生物相容性和体外降解速率,其多孔的纵形沟壑状结构可发挥“地形诱导”作用,同时其保留较好的周围神经细胞外基质成分具有一定的生物学诱导,可使牙髓前体细胞粘附其上并呈现较为明显的方向性生长,并可促进牙髓前体细胞对神经营养因子NGF和BDNF的表达。牙髓前体细胞与Myroilysin脱细胞异

关键词： Epiphytes   Matrix analysis   Microclimate   Orchidaceae   Paramo   Treeline  

摘要： Do epiphytes drop out above the treeline because of climatic reasons or due to lack of appropriate substrate? We set out to address this question by studying various key aspects of their biology at a natural treeline on a tropical mountain top in Panama: species composition of assemblages, host preferences, population structure and dynamics, individual growth and reproductive investment. Lack of relevant climate data caused us to monitor microclimatic conditions in tree crowns for 12 months. At our study site we found 15 epiphyte species, mostly ferns, although in terms of abundance orchids were highly dominant. Compared to lowland vegetation of similar stature, the epiphyte assemblages were less species-rich and abundances lower. Some species may only be present at this treeline because of continuous immigration from lower elevations (i.e. represent sink populations). Many species, however, were rather abundant with many reproductive individuals, arguably forming viable local populations. The results of a detailed demographic study with the orchid Pachyphyllum hispidulum over three years also support this notion, being comparable to studies from lowland habitats. Our descriptive study does not allow unambiguous conclusions on mechanisms, but our findings suggest that lack of suitable substrate (=trees) rather than climatic reasons are responsible for the disappearance of epiphytes immediately above the treeline. This notion needs rigorous verification by experimental physiological studies. (C) 2014 Elsevier GmbH. All rights reserved.