关键词:
可卡因成瘾
多巴胺转运体
重组腺相关病毒载体
基因敲进
立体定向
快速移动效应
奖赏效应
可卡因成瘾
多巴胺转运体
重组腺相关病毒
立体定向
纹状体
伏隔核
快速移动效应
奖赏效应
可卡因成瘾
多巴胺转运体
立体定向
重组腺相关病毒
纹状体
嗅结节
腹侧中脑
快速移动效应
奖赏效应
摘要:
第一部分鉴定利用重组腺相关病毒载体将野生型多巴胺转运体导入可卡因非敏感性基因敲进小鼠目标脑区的可行性与有效性
目的:鉴定可卡因对实验用可卡因非敏感性基因敲进小鼠(cocaine-insensitive dopamine transporter knock-in mice, DAT-CI mice)行为学效应的稳定性,检验重新导入的野生型多巴胺转运体(dopamine transporter, DAT)在DAT-CI小鼠目标脑区内的表达与功能。
方法:选取DAT-CI小鼠10只,野生型(wild-type, WT) C57BL/6J小鼠10只,体重20-30g,分别作为DAT-CI组与WT对照组,建立可卡因条件性位置偏爱模型,该模型可同时评估可卡因所致的快速移动(hyperlocomotion)及奖赏(reward)效应。条件性位置偏爱实验(conditioned place preference, CPP)包括3个阶段:训练前位置偏爱测试1天;可卡因/生理盐水训练阶段8天:训练后位置偏爱测试1天。训练前位置偏爱测试实验箱由不同的视觉及触觉线索(cue)区分为中间隔间及2个双侧隔间共3个彼此相通的区域,将小鼠从中间隔间放入,任其在实验箱中自由活动30min,Anymaze视频追踪系统自动记录实验动物在3个区域的停留时间及移动距离,位置偏爱值用小鼠在伴药区和非伴药区停留时间的差值表示,伴药区由自行设计的软件计算决定,使每组小鼠给药前的位置偏爱值之和趋近于零以减小组内数据离散率。药物训练阶段共8天,伴药箱和非伴药箱分别用训练前测试对应的线索布置,实验箱三个隔间彼此相通且在视觉触觉上完全相同。偶数天给予4组小鼠腹腔注射可卡因201ng/kg,奇数天给予4组小鼠腹腔注射相同体积生理盐水,Anymaze视频追踪系统自动记录实验动物30min内的移动距离,作为评价运动刺激的指标。训练后位置偏爱测试同训练前。CPP分数取实验动物在伴药区停留的时间(conditioned stimulus,CS+)减去非伴药区停留时间(unconditioned stimulus,CS-)的差值,药物训练前与训练后CPP分数的比较用来评价可卡因的奖赏效应。选取DAT-CI小鼠6只,采用脑立体定位技术在一侧纹状体注射野生型多巴胺转运体重组腺相关病毒载体(recombinant adeno-associated virus containing wild-type dopamine transporter, rAAV-DATwt),术后恢复4周后,处死其中3只小鼠并以4%多聚甲醛灌注内固定,制作新鲜脑组织冰冻切片,用免疫组化DAB法显影AAV-DAT,叭的表达范围。取另外3只小鼠利用快扫描循环伏安法(fast scanning cyclic voltammetry, FSCV)测定双侧纹状体内多巴胺的释放与再摄取。采用SPSS19.0统计软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用双因素方差分析,组内比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
结果:与WT组相比,20mg/kg可卡因在DAT-CI组没有呈现出快速移动效应及条件性位置偏爱效应。FSCV测试显示,给予可卡因后,DAT-CI小鼠中注射rAAV-DATwt的一侧脑区与对侧脑区相比,出现明显的多巴胺释放峰值且多巴胺消退速度减慢。免疫组化反应显示,注射rAAV-DATwt的脑区呈现深棕色显影,立体定位注射位置准确。
结论:将rAAV-DATwt导入DAT-CI小鼠后,可在目标脑区成功表达野生型DAT,并重现可卡因诱导的细胞外多巴胺浓度的升高。该实验模型稳定有效,可进一步应用于可卡因诱导行为学效应的研究。
第二部分可卡因非敏感性多巴胺转运体基因敲进小鼠背侧纹状体合并外侧伏隔核立体定向注射野生型多巴胺转运体重组腺病毒载体重建可卡因诱导的快速移动效应
目的:确定与可卡因诱导的快速移动及奖赏效应相关的特定脑区。
方法:选取可卡因非敏感性多巴胺转运体基因敲进小鼠(cocaine-insensitive dopamine transporter knock-in mice,DAT-CI mice:)30只,野生型(wild-type,WT)C57BL/6J小鼠10只,体重20-30g。DAT-CI小鼠随机分成3组:背侧纹状体合并外侧伏隔核组(ICPU组)、内侧伏隔核组(mNAC组)、DAT-CI组,加野生型小鼠对照WT组,共4组,每组10只。1CPU组及mNAC组采用脑立体定向技术分别向DAT-CI小鼠双侧背侧纹状体合并外侧伏隔核及内侧伏隔核靶点坐标注射野生型多巴胺转运体重组腺相关病毒载体(rAAV-DATwt),DAT-CI组及WT组不进行任何注