教学课程资源库 更多>>

关键词： 间充质干细胞   细胞球   三维培养   生物学特性   诱导分化  

摘要： 第一部分两种方法提取人脐带间充质干细胞在不同培养维度的生物学特性比较目的:比较二维(two-dimensional,2D)、三维(three-dimensional,3D)培养条件下酶消化法与组织块贴壁法获取的人脐带间充质干细胞(human-umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)生物学特性。方法:采用Ⅰ型胶原酶消化法与组织块贴壁提取分离hUC-MSCs,观察记录并扩增培养至P3代后分组2D、3D培养;扫描电镜观察细胞球表征;死活染色检测细胞球存活状况;Alamar Blue检测细胞增殖能力并绘制增殖曲线;流式细胞术检测免疫表型CD34、CD44、CD45、CD90、CD105的表达;IF、Western blot检测多能性转录因子Sox2、Nanog、Oct4的表达。结果:倒置显微镜下观察酶消化法提取在第3天可见细胞贴壁开始生长,组织块贴壁法第7天后可见细胞从组织块边缘爬出。扫描电镜观察到两种方法提取的细胞球中细胞的紧密连接,死活染色见细胞球培养3天后生存状态良好,球体中心少量细胞死亡。增殖曲线显示在2D培养下消化法提取细胞对数生长期在4-6天,贴壁法细胞对数生长期在2-3天;在3D培养下两组增殖均较为缓慢。流式结果显示2D培养下酶消化提取细胞强表达CD44(99.83±0.06%)、CD90(99.50±0.46%)、CD105(89.03±0.12%),不表达CD34、CD45;组织块贴壁法提取细胞同样强表达CD44(99.87±0.06%)、CD90(98.70±0.17%)、CD105(71.04±0.64%),不表达CD34、CD45。2D培养下CD105的表达酶消化法高于组织块贴壁法(P<0.001),CD44、CD90表达无差异。3D培养下酶消化提取细胞强表达CD44(98.73±0.38%)、CD90(94.50±0.36%),低表达CD105(16.37±0.63%),不表达CD34、CD45;贴壁法提取细胞同样强表达CD44(97.73±0.76%)、CD90(84.23±0.56%),低表达CD105(6.66±1.63%),不表达CD34、CD45。3D培养下CD90、CD105的表达酶消化法均高于组织块贴壁法(P<0.01),CD44的表达无差异。IF与Western blot结果显示在2D培养下多能性转录因子Sox2、Nanog、Oct4的表达酶消化法提取细胞均高于贴壁法(P<0.01);在3D培养下Sox2的表达,贴壁法提取细胞高于酶消化法(P<0.01),Nanog、Oct4的表达两种方法间无差异。结论:酶消化法比组织块贴壁法获取原代hUC-MSCs所需时间更短,但在扩增培养阶段贴壁法获取细胞所需的倍增时间更短。无论在2D还是3D培养条件下,酶消化法提取细胞表达更高的免疫表型。2D培养下酶消化法比组织块贴壁法表达更高的多能性转录因子Sox2,Nanog,Oct4水平,但3D培养下这种趋势得以逆转。第二部分培养维度转换对人间充质干细胞生物学特性及诱导分化的影响目的:比较人源间充质干细胞在2D、3D培养以及维度转换操作后2D转2D(2-2D)、2D转3D(2-3D)、3D转2D(3-2D)、3D转3D(3-3D)的生物学特性及成骨、成脂诱导分化功能指标。方法:采用Ⅰ型胶原酶消化法提取hUC-MSCs,扩增至P3代后以2D、3D培养,培养5天再经过维度转换为2-2D、2-3D、3-2D、3-3D。IF、Western Blot、RTqPCR检测多能性转录因子Sox2、Nanog、Oct4表达,流式细胞仪检测维度转换后免疫表型CD34、CD44、CD90、CD105、HLA-DR表达。在2D、3D培养方式下诱导hUC-MSCs成骨分化14天,经诱导成骨后的细胞维度转换为2-2D、2-3D、3-2D、3-3D继续培养3天。茜素红s染色观察钙化基质沉积,RT-qPCR检测成骨相关标志基因Runx2、BMP2、OC。采用Ⅰ型胶原酶消化法提取人脂肪间充质干细胞(human adipose derived mesenchymal stem cells,hAD-MSCs),扩增至P3代后以2D、3D培养成脂诱导分化14天,经诱导成脂后的细胞维度转换为2-2D、2-3D、3-2D、3-3D继续培养3天。油红O染色观察脂滴积累,RT-qPCR检测成脂相关标志基因PPARγ、FABP4、LPL。结果:3D培养下hUC-MSCs多能性转录因子Sox2,Nanog,Oct4的表达均高于2D培养(P<0.05)。维度转换后三个多能性转录因子水平2-3D组均高于2-2D组(P<0.001);2-3D组均高于3-3D组(P<0.001);3-2D组均高于2-2D组(P<0.0

关键词： 肝细胞癌   VANGL1   迁移   侵袭  

摘要： 研究背景肝癌作为预后较差的消化道恶性肿瘤之一,近年来其发病率和死亡率在全球范围内常年处于高位,我国更是肝癌大国,占世界肝癌死亡病例的一半以上。肝癌发病隐匿,大部分患者就诊时已为晚期,晚期肝癌患者预后不佳,其五年生存率仅有10%左右。因此,探索肝癌的发生发展机制及寻求有效的治疗靶点具有重要的临床意义。较多的研究已证实Wnt/β-catenin信号通路在肝癌的发展过程中起到非常重要的作用,近些年Wnt/平面细胞极性(Planar Cell Polarity,PCP)信号通路与肿瘤的发生关系也备受关注。VANGL1作为PCP通路中的核心蛋白被发现在多种肿瘤中异常表达且影响肿瘤的生物学行为,然而,VANGL1在肝癌中的表达及功能未见详尽报道。本研究考察了VANGL1在肝癌细胞及组织中的表达情况,并明确了VANGL1在肝癌中的生物学功能及可能机制,为肝癌的发生机制及治疗靶点的挖掘提供思路和依据。研究方法1.挖掘癌症基因组图谱(TCGA)数据库中肝癌组织和正常人肝组织组中VANGL1转录水平。应用q RT-PCR方法在10对新鲜肝癌组织及相对应的癌旁组织中验证VANGL1的m RNA表达水平。通过q RT-PCR方法考察VANGL1在肝癌细胞和正常人肝细胞中的表达水平。使用免疫组织化学染色方法考察VANGL1在肝癌组织中的蛋白表达水平。分析VANGL1的表达与肝癌临床病理特征和预后的关系。2.选择VANGL1相对低表达的肝癌细胞(Huh-7),通过过表达质粒转染过表达VANGL1,选择VANGL1相对高表达的肝癌细胞(SNU-449),通过小干扰质粒敲减VANGL1,q RT-PCR和Western Blot验证转染效率。通过CCK8、创伤愈合,Transwell和流式细胞仪等方法分别考察VANGL1过表达和敲低后对肝癌细胞的生物学功能的影响。3.在VANGL1稳定过表达和敲减的肝癌细胞中,通过q RT-PCR和Western Blot检测上皮间质样转化(EMT)相关分子的m RNA和蛋白表达,分析VANGL1影响肝癌生物学行为可能的分子机制。研究结果1、TCGA数据库分析结果表明,与正常人肝组织相比,VANGL1在肝癌组织中表达升高(P<0.05),且高表达VANGL1的患者表现为中位总生存时间(OS)的缩短。在10对肝癌组织中,VANGL1的m RNA的表达也显著高于癌旁组织(P<0.05)。相对于正常肝细胞LO2,VANGL1的表达在肝癌细胞(Huh-7、SNU-449、7721、HLE、Hep-3B、7404)中高表达(P<0.05)。2、在肝癌细胞(Huh-7)中过表达VANGL1不影响肝癌细胞的增殖和凋亡,但可促进肝癌细胞的侵袭和迁移能力。在肝癌细胞(SNU-449)中敲减VANGL1同样不影响肝癌细胞的增殖和凋亡,但能够抑制肝癌细胞的侵袭和迁移能力。3、在肝癌细胞(Huh-7)中过表达VANGL1后,EMT相关分子N-cadherin表达下调,E-cadherin、Slug和Vimentin表达上调;在肝癌细胞(SNU-449)中敲减VANGL1后,EMT相关分子N-cadherin表达上调,E-cadherin、Slug和Vimentin表达下调。研究结论1、VANGL1在肝癌组织和肝癌细胞中高表达,且和肝癌患者预后不良相关。2、肝癌细胞中上调或下调VANGL1,不影响肝癌细胞增殖和凋亡,但可影响肝癌细胞的侵袭和迁移能力。3、VANGL1影响肝癌侵袭和迁移可能和EMT有关。

关键词： 胃癌   幽门螺杆菌   CagA   miR-155-5p   SP1   SMAD2  

摘要： 背景:胃癌作为一种恶性肿瘤,据我国最新发布的数据显示,其死亡率和发病率均处于第三位,处于我国较高水平,并造成了极大的疾病负担。幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)作为胃癌一级致癌物,细胞毒素相关蛋白A(cytotoxin-associated gene A,CagA)是Hp的主要毒力因子之一,有研究表明CagA(+)Hp菌株较阴性菌株具有更强的致病力。miRNA可通过影响下游m RNA分子的表达而参与胃癌的发生发展过程,是非常敏感和特异的循环生物标记物;且作为治疗药物具有很大的应用前景与潜力。CagA可通过干扰miRNA分子的表达发挥癌症的促进作用;本研究构建CagA真核质粒及CagA原核质粒,通过GEO数据库及q RT-PCR方法确定与CagA和胃癌均相关的miRNA分子,探讨CagA通过miRNA发挥致癌作用的机制,以期为CagA所致胃癌的治疗提供一定的线索。目的:1.构建CagA真核表达质粒与原核表达质粒。2.探讨真核质粒及原核质粒表达的CagA对胃癌细胞生物学功能的影响。3.初步阐明CagA通过miR-155-5p调控胃癌细胞AGS生物学功能的分子机制。方法:1.于NCBI数据库查找CagA基因,并将CagA基因序列连接至真核表达载体pc DNA3.1(+);结合文献中CagA有效片段,将CagA基因序列连接至原核表达载体pet26b(+)。采用PCR、酶切、Sanger测序法及Western Blot鉴定重组质粒。2.探究CagA对胃癌细胞生物学功能的影响。体外培养人胃癌细胞AGS、HGC-27和人正常胃黏膜上皮细胞GES-1,使用CagA真核质粒(pc DNA-CagA)转染细胞,筛选并确定转染效率最高的细胞系AGS进行后续研究;通过CCK-8实验、划痕实验、Transwell实验分别检测转染pc DNA-CagA后对胃癌细胞AGS增殖、迁移和侵袭力的影响;CCK8实验法进一步探索原核质粒表达的CagA重组蛋白对AGS细胞增殖能力影响并检测CagA重组蛋白影响AGS细胞增殖能力的最佳作用浓度。3.初步阐明CagA引起胃癌细胞生物学功能改变的分子机制。(1)从GEO(Gene Expression Omnibus)数据库及文献中初步筛选出与幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染所致胃癌相关的miRNA分子,首先在GES-1和pc DNA-CagA转染效率最高的AGS细胞中通过q RT-PCR方法检测相关miRNA的表达水平,选择与文献报道一致的miRNA作为候选miRNA;然后在pc DNA-CagA转染的胃癌细胞AGS中通过q RT-PCR方法进一步筛选,确定表达量受CagA影响最大的miRNA;接着使用CagA原核重组蛋白进一步验证;(2)然后通过miRNA模拟物(mimics)和抑制剂(inhibitor)构建目标miRNA过表达和敲低胃癌细胞模型,通过CCK-8实验、划痕实验、Transwell实验方法分别检测目标miRNA过表达和敲低后对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭力的影响。(3)功能回复实验:分别将pc DNA-CagA+miRNA mimics/inhibitor NC、pc DNA-CagA+miRNA mimics/inhibitor及pc DNA-NC+miRNA mimics/inhibitor共转染于胃癌细胞,借助CCK-8实验、Transwell实验探索该miRNA对胃癌细胞的生物学功能是否受到CagA的调控。(4)(1)miRDB、miRTarbase和Target Scan预测并结合文献确定该miRNA的可能的靶基因,(2)通过q RT-PCR实验分析靶基因在过表达/敲低目标miRNA后的变化情况,确定相关靶基因;(3)通过RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA Binding Protein Immunopriciptitation,RIP)实验探究该miRNA与目的蛋白之间是否具有直接作用关系;(4)Western Blot实验探究靶蛋白表达在转染pc DNA-CagA、过表达和敲低目标miRNA、以及同时转染pc DNACagA+miRNA mimics/inhibitor NC、pc DNA-CagA+miRNA mimics/inhibitor及pc DNANC+miRNA mimics/inhibitor后的变化,设计回复实验证明该miRNA对于靶蛋白的调控作用是否受到CagA的影响,从而证明CagA与miRNA及下游靶标三者之间的关系。结果:***真核质粒及CagA原核质粒的验证两种质粒经DNA琼脂糖凝胶电泳及Sanger测序,结果证明CagA基因序列已成功转入相应载体,质粒构建成功;Western Blot实验表明连接的CagA基因

关键词： 子痫前期   滋养细胞   侵袭迁移   生物学功能   PDIA3P1   异常表达  

摘要： 研究背景　　子痫前期（preeclampsia,PE）是一种多系统多脏器受累疾病，特发于妊娠期妇女，主要临床表现为妊娠20周后新发生的高血压及蛋白尿。子痫前期的全球发病率为3%～5%，是导致孕产妇及围产儿死亡的重要原因之一。虽然子痫前期的发病机理至今仍未完全清楚，但已经形成了胎盘浅着床学说、免疫学说、遗传学说等多种学说。在以上这些学说中，最被广泛认可的是以子宫螺旋动脉重铸障碍为核心的胎盘浅着床两阶段学说。该学说认为具备正常生物学功能表型的绒毛外滋养细胞（EVT）对于子宫螺旋动脉重铸这一过程的顺利完成必不可少。　　大量研究表明，异常表达的长链非编码RNA（longnon-codingRNA，lncRNA）可以借助调节滋养细胞的生物学功能影响PE的发生发展。假基因是lncRNA的一个亚类，由编码蛋白质的基因产生，但不具备产生蛋白质的能力，越来越多的研究证实假基因作为一种特殊类型的lncRNA，对各种生物学功能及过程亦具有调控作用，并参与肿瘤等多种疾病的发生发展。　　假基因PDIA3P1即属于这一特殊类型lncRNA，它的全称为蛋白质二硫键异构酶家族A成员3假基因1，位于1q21.1（1号染色体长臂第2区1带的第1亚带），全长为2099bp。PDIA3P1在肝癌及神经胶质瘤中发挥的作用已经被研究者所证实，然而其对滋养细胞功能的调控作用，对子宫螺旋动脉重铸的影响以及在子痫前期发病机制中发挥的作用仍不清楚。因此，深入探索并阐明其相关调节方式及机制，将有助于子痫前期的防治并使子痫前期患者从中受益。　　研究方法　　1.选择24对子痫前期胎盘组织和正常妊娠胎盘组织标本，运用qRT-PCR方法检测长链非编码RNAPDIA3P1的表达水平。　　***-PCR方法检测滋养细胞系（HTR-8/SVneo、JEG3、JAR）及脐静脉内皮细胞（HUVEC）中PDIA3P1的基础表达水平。　　3.选择PDIA3P1低表达及高表达的滋养细胞系（HTR-8/SVneo及JAR），分别敲降及过表达PDIA3P1，CCK8法及EDU实验检测滋养细胞的增殖能力，流式细胞技术检测细胞周期，Transwell实验检测滋养细胞的侵袭及迁移能力。　　4.在HUVEC细胞中敲降及过表达PDIA3P1，血管形成实验检测PDIA3P1对血管形成能力的影响。　　5.将敲降PDIA3P1的滋养细胞（HTR-8/SVneo）进行二代转录组测序获得一系列潜在的下游基因，在敲减PDIA3P1的滋养细胞（HTR-8/SVneo及JAR）中验证测序结果，分析获得PDIA3P1的潜在下游靶基因SFRP1。检测敲减PDIA3P1后滋养细胞（HTR-8/SVneo及JAR）中SFRP1及β-catenin蛋白的表达情况。　　***-PCR方法检测胎盘组织中SFRP1mRNA的表达水平，蛋白免疫印记及免疫组化实验检测胎盘组织中SFRP1的蛋白表达水平。　　7.在滋养细胞中敲降SFRP1，CCK8法、EDU实验及克隆形成实验检测滋养细胞的增殖能力变化，Transwell实验检测滋养细胞迁移能力变化;在滋养细胞中同时敲降PDIA3P1及SFRP1，检测细胞增殖及迁移能力的变化。　　8.免疫荧光原位杂交（FISH）及核质分离实验确定PDIA3P1在滋养细胞中分布情况，RNA-pulldown及RNA免疫共沉淀实验确认与PDIA3P1相结合的蛋白，蛋白免疫印迹方法检测过表达PDIA3P1后滋养细胞（HTR-8/SVneo及JAR）中snail、E-cadherin及N-cadherin蛋白水平变化。　　9.体外裸鼠基质胶塞实验检测PDIA3P1对HUVEC细胞血管形成能力的影响。　　研究结果　　***-PCR方法对24对胎盘组织标本进行定量检测发现，与正常孕妇胎盘组织相比，子痫前期孕妇胎盘组织中PDIA3P1显著低表达。　　2.在滋养细胞系（HTR-8/SVneo及JAR）中敲减PDIA3P1，能够显著抑制滋养细胞的增殖、侵袭迁移能力，使细胞阻滞于G0/G1期。反之，过表达PDIA3P1则促进滋养细胞的增殖、侵袭迁移能力，使细胞周期由G0/G1期向S期过渡。在HUVEC细胞中敲减PDIA3P1，可明显地抑制HUVEC细胞的血管形成能力。相反，过表达PDIA3P1则能显著增强HUVEC细胞的血管形成能力。　　3.在滋养细胞（HTR-8/SVneo）中敲低PDIA3P1后进行二代转录组测序，测序结果分析显示差异变化的基因涉及包括细胞增值，迁移及细胞凋亡等在内的多个生物学过程。在敲低PDIA3P1的滋养细胞系（HTR-8/SVneo及JAR）中，qRT-PCR方法验证潜在靶基因的表达，结果发现SFRP1升高最明显。Westernblotting实验结果显示，在滋养细胞（HTR-8/SVneo及JAR）中

关键词： 胃癌原代细胞   肼曲嗪   p16  

摘要： 目的:分离、纯化、培养胃癌原代细胞,探索非核苷类DNA甲基转移酶抑制剂肼曲嗪（Hydralazine）对胃癌原代细胞p16基因表达及其生物学特性的影响。方法:利用胰酶消化法、无血清培养基培养、差速贴壁法培养纯化胃癌原代细胞,细胞免疫化学法鉴定胃癌原代细胞,细胞毒性试验（cell counting kit-8,cck8）明确肼曲嗪对胃癌细胞的增殖抑制效率,根据不同浓度肼曲嗪对胃癌原代细胞的平均抑制率计算半数抑制浓度（half inhibitory concentration,IC50）,利用细胞划痕试验来评估肼曲嗪对胃癌原代细胞迁移能力的影响,Real Time-PCR、Western Blot法验证肼曲嗪对胃癌p16基因m RNA、蛋白质表达的影响。结果:1、成功分离培养人胃癌原代细胞3例,病理报告显示中分化腺癌为两例,低分化腺癌为一例。胃癌原代细胞形态多样,光镜下显示为圆形,多边形,短梭形,大小不等。细胞免疫化学法检测胃癌细胞癌胚抗原（Carcinoembryonic Antigen,CEA）、增殖标志物ki-67、广谱角质蛋白（Broad-spectrum Keratin,AE1/3）均呈阳性表达。2、设置cck8加药浓度为0、3、10、30、100、300unol/l,每组5个复孔,继续孵育48小时,每孔加入10ulcck8试剂,根据酶标仪测定的OD值,计算各浓度组抑制率,我们可以得出IC50=227.9u M,根据IC50,我们设置后续试验肼曲嗪浓度梯度为0、50、100、200u M。3、根据上述IC50,设置浓度梯度进行后续试验,细胞划痕试验显示肼曲嗪对胃癌细胞的迁移能力起抑制作用,而Real Time-PCR、Western Blot结果显示P16基因m RNA、蛋白质表达增加。结论:肼曲嗪通过去甲基化使p16基因表达增加,并以此抑制胃癌原代细胞的增殖、迁移。

关键词： 结肠癌   长链非编RNA   Wnt/β-catenin通路   铁死亡   干细胞特性  

摘要： 目的:探讨lncRNA LINC01606对结肠癌细胞生物学功能的作用及机制研究。方法:1)采用在线TCGA数据库Driver DBv3分析LINC01606在结肠癌中的表达情况,并分析其在结肠癌中的表达水平及与预后之间的关系。采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）进一步检测LINC01606在83对结肠癌组织和癌旁组织中的表达水平,结合临床病理资料分析LINC01606与结肠癌的临床病理特征的关系,并采用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC曲线）分析其临床诊断价值。使用qRT-PCR检测LINC01606在5个结肠癌细胞系及正常结肠上皮细胞系中的表达水平。2)采用慢病毒构建LINC01606干扰和过表达载体并建立LINC01606干扰和过表达及相应对照载体的稳定细胞株。通过荧光显微镜观察慢病毒载体感染后荧光细胞比例和qRT-PCR检测LINC01606表达水平验证感染效率。干扰和过表达LINC01606后,采用CCK-8实验、Transwell迁移和侵袭实验、平板克隆形成实验、裸鼠皮下成瘤实验检测LINC01606对结肠癌细胞的增殖、侵袭、迁移和生长的影响。3)采用qRT-PCR检测球细胞与贴壁细胞LINC01606的表达水平。用流式细胞仪分选出CD44+CD133+和CD44-CD133-细胞,qRT-PCR检测CD44+CD133+和CD44-CD133-细胞LINC01606的表达水平。干扰和过表达LINC01606后,采用成球实验检测LINC01606对结肠癌细胞体外成球能力的影响;使用流式细胞仪分析LINC01606对CD44+CD133+和CD44-CD133-细胞比例的影响;使用qRT-PCR检测LINC01606对干性标志物CD44、CD133、Nanog、Sox2、Epcam和Lgr5表达水平的影响;CCK-8实验和细胞流式实验检测LINC01606对结肠癌经典化疗药物5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil,5-Fu）敏感性。4)使用铁死亡诱导剂或者抑制剂处理细胞后,采用透射电子显微镜（Transmission electron microscope,TEM）观察细胞形态学变化及CCK-8检测细胞活性变化;干扰和过表达LINC01606并使用铁死亡诱导剂处理细胞后,观察细胞形态学、细胞活性、细胞内Fe2+及总铁、线粒体超氧化物、脂质活性氧（reactive oxygen species,ROS）以及线粒体膜电位的变化情况。5)采用荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）实验检测LINC01606在SW480和HT29细胞中表达分布情况。生物学信息分析miR-423-5p可能与LINC01606和SCD1及Wnt3a结合;荧光素酶实验检测LINC01606、SCD1和Wnt3a与miR-423-5p的结合情况;采用RNA Pull down和Ago2-RIP实验检测miR-423-5p与LINC01606和SCD1的直接结合关系;干扰和过表达LINC01606或miR-423-5p后检测SCD1及LINC01606的表达水平。6)干扰和过表达LINC01606或miR-423-5p后检测Wnt信号分子:Wnt3a、β-catenin、EP300、TCF7、LEF1和c-Myc表达水平;采用Topflash/Fopflash实验检测LINC01606与Wnt/β-catenin信号之间的关系;使用Wnt信号抑制剂C59和激活剂BML-284及联合干扰和过表LINC01606处理细胞后,检测LINC01606、SCD1及Wnt信号分子的表达水平。7)采用LINC01606启动子DNA pull down实验筛选出与Wnt信号相关的转录因子TFE3;在TCGA数据库及83对结肠癌组织中分析TFE3在结肠癌中的表达水平;过表达TFE3后检测LINC01606的表达水平。使用Jasper数据库预测TFE3与LINC01606启动子的结合位点,并根据结合位点构建野生型和突变型荧光素酶载体,荧光素酶实验验证TFE3与LINC01606启动子区域的结合关系。通过ENCODE数据库和Chi P-seq实验分析TFE3在LINC01606启动子区域的富集信号值。8)联合使用铁死亡诱导剂、Wnt信号抑制剂和激动剂、过表达LINC01606处理细胞后,检测细胞内Fe2+、总铁离子、线粒体超氧化物、脂质ROS的浓度以及线粒体膜电位的变化情况。使用铁死亡诱导剂处理CD44+CD133+和CD44-CD133-细胞后检测细胞内Fe2+、总铁离子、线粒体超氧化

关键词： 头颈部恶性肿瘤   鼻咽癌   鳞状细胞癌   Notch1   细胞生物学功能  

摘要： [目 的]研究编码蛋白质DNA缺口受体1(Notch1)在鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma,NPC)组织中的表达情况,探讨当下调Notch1基因表达后对人鼻咽癌5-8F细胞系的增殖、侵袭、迁移、凋亡等细胞学功能的影响,探索Notch1基因在高转移性鼻咽癌发生发展过程中的作用。[方 法]按照纳入和排除标准将2020年11月-2021年12月在云南省肿瘤医院耳鼻喉头颈外科接受鼻咽镜下取材确诊为鼻咽癌的30例患者纳入。收取鼻咽癌组织标本及癌旁正常组织标本30对。采用实时定量聚合酶链反应(qPCR)检测鼻咽癌组织及癌旁正常组织中的Notch1基因的表达,进行相关统计学分析。构建敲低Notch1基因表达的质粒,并将其与空载体质粒分别转染至人鼻咽癌细胞系5-8F细胞内,实验分为三组,分别为:空白对照组(Blank)、空载体阴性对照组(NC)、实验组(Notch1-shRNA)。转染完成后采用实时荧光酶链聚合链反应(qPCR)检测各组细胞中Notch1的表达量,验证其转染效率,Notch1表达量下降大于50%以上表明转染成功。接着采用MTT 比色法对细胞相应计数,并通过细胞克隆试验,检测这三组细胞的生长与增殖能力;细胞迁移实验(划痕实验)检测这三组细胞的迁移能力;Transwell小室侵袭实验则用来检测这三组细胞的侵袭性；流式细胞学实验检测敲低Notch1基因后对5-8F细胞凋亡的影响。统计学方法:选择独立样本t检验以及x2检验对于所收集的各个实验数据进行相应统计学处理。在进行统计推断之前应对数据进行相应的正态性和方差齐性检验,两两比较采用独立样本t检验,三组比较采用x2检验,以p<0.05表示差异具有统计学意义。[结 果]1.利用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR),研究发现相对于癌旁正常组织,鼻咽癌组织中的Notch1的△CT值更高,癌细胞组中Notch1的相对表达量明显上调,[(1.5740±1.6093)VS(0.5176±0.4075),p<0.05],差异具有统计学意义。2.利用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR),测定不同头颈部鳞癌细胞株与正常组织细胞株NP69,选取其中Notch1表达量最高的头颈部鳞状细胞癌细胞株。研究显示Notch1表达量在鼻咽癌5-8F细胞系内的表达量最高(M=3.44654),因此选取5-8F细胞株作为后续研究所用。3.构建敲低Notch1基因表达的质粒,并转染至5-8F细胞株后,利用qPCR测定Notch1的表达量,与Blank组相比,Notch1-shRNA组内5-8F细胞中的Notch1的△CT 明显更低,[(0.6538±0.0186)VS(1.0100±0.1795),P<0.05],二者之间的差异具有统计学意义,表明Notch1低表达质粒转染成功。4.蛋白印迹实验显示,若以Blank组的灰度值为基数,则NC组Notch1-shRNA组分别为Blank组的0.7716倍和0.2468倍,均降低,而Notch1-shRNA组的Notch1 基因表达量仅为正常组的 1/5,[(1.0000±0.0000)VS(0.2468±0.0000),P<0.05],差异有统计学意义,提示shRNA转染后直接干扰了 Notch1的蛋白翻译,明显降低其表达,以影响下游基因表达网络。5.细胞计数实验显示,相对于Blank组,NC组细胞生长能力无明显下降,[(0.6869±0.4497)VS(0.6461±0.4191),P=0.481],差异无统计学意义;然而在Notch1-shRNA组中,5-8F细胞生长能力显著下降,[(0.6869±0.4497)VS(0.4926±0.3380),P<0.05],表示差异具有统计学意义。6.细胞克隆实验结果显示,10天后比较Blank组与NC组,5-8F细胞的克隆能力无明显区别,[(406.3333±9.5044)VS(338.3333±50.2925),P>0.05],差异无统计学意义,而在Notch1-shRNA组中可明显观察到细胞克隆数减少[(406.3333±9.5044)VS(274.0000±8.1854),P<0.05],差异有统计学意义,表明Notch1低表达的5-8F细胞克隆能力明显被抑制。7.划痕实验来检测细胞的迁移能力,实验结果显示,48小时后相对于Blank组,NC组空白面积显示增大趋势,说明NC组的迁移率降低,但差异无统计学意义[(8.1571±0.4506)VS(7.3291±0.5031),P>0.05],然而对于 Notch1-shRNA组,空白面积明显增大,说明Notch1-shRNA组的迁移率更低了,[(8.1571±0.4506)VS(4.8197 ± 0.4131),P<0.05],差异有统计学意义,表明 N

关键词： miR-155-5p   三阴性乳腺癌   增殖   转移   凋亡  

摘要： 目的三阴性乳腺癌是一种具有高度异质性,发病趋于年轻化,且严重威胁全球女性生命健康的恶性肿瘤,目前大量相关研究发现微小RNA与三阴性乳腺癌的发生发展密切相关。本研究利用TCGA数据库筛选出目的miR-155-5p,借助Cancer MIRNome数据库分析miR-155-5p作为乳腺癌诊断标志物的潜在可能性,并使用UALCAN数据库分析miR-155在不同乳腺癌亚型中的表达情况;同时采用qRT-PCR技术检测了miR-155-5p在正常乳腺上皮细胞(MCF-10A)、非TNBC细胞MCF-7(Luminal)和TNBC细胞(MDA-MB-231和SUM-159)中的表达情况,以明确miR-155-5p在不同乳腺癌细胞中的表达情况,并确定以TNBC细胞作为研究对象;进一步探讨了低/高表达miR-155-5p表达水平对三阴性乳腺癌细胞MDAMB-231和SUM-159在增殖、转移及凋亡方面的影响,旨在阐明miR-155-5p在三阴性乳腺癌细胞中生物学特性的作用,以期为其作为三阴性乳腺癌诊断、治疗及预后方面的靶点及生物学标志物提供更多实验依据。方法***-155-5p在乳腺癌中的表达情况及诊断潜能分析利用TCGA数据库筛选出目的miR-155-5p,借助Cancer MIRNome数据库分析miR-155-5p指标在乳腺癌诊断及预后方面的潜在价值;并使用UALCAN数据库分析了miR-155在不同乳腺癌亚型中的表达情况;同时利用qRT-PCR技术检测了miR-155-5p在正常乳腺上皮细胞(MCF-10A)、非TNBC细胞MCF-7(Luminal)和TNBC细胞(MDA-MB-231和SUM-159)中的表达情况。2.体外实验探讨miR-155-5p对三阴性乳腺癌细胞增殖、转移及凋亡的影响通过脂质体转染miR-155-5p inhibitor(低水平miR-155-5p)、miR-155-5p mimics(高水平miR-155-5p)及对应的阴性对照(NC inhibitor和NC mimics)至TNBC细胞系MDA-MB-231和SUM-159,采用qRT-PCR技术检测各组细胞转染后miR-155-5p的表达水平;利用CCK-8实验、平板克隆形成实验、伤口愈合实验检测低表达和过表达miR-155-5p对TNBC细胞增殖、集落形成以及迁移的影响;利用qRT-PCR技术和WB实验检测低表达和过表达miR-155-5p对TNBC细胞EMT进程及凋亡相关基因在mRNA和蛋白水平上的表达情况。结果***-155-5p在乳腺癌中表达上调且具有较好的诊断潜力根据TCGA和Cancer MIRNome数据库分析结果显示,miR-155-5p在乳腺癌组织中的表达水平明显高于正常癌旁组织,故后续实验以miR-155-5p作为研究对象;qRT-PCR技术检测乳腺癌细胞中miR-155-5p的表达情况发现,以正常乳腺上皮细胞MCF-10A作为对照,miR-155-5p在乳腺癌细胞中表达量显著上调,尤其在TNBC细胞(MDA-MB-231和SUM-159)中(P<0.001)。同时与非TNBC细胞MCF-7(Luminal)相比,TNBC细胞中miR-155-5p的表达量显著增加(P<0.001),与UALCAN数据库分析miR-155在不同乳腺癌亚型(Luminal、HER-2 Positive、TNBC)中的表达情况结果一致,故后续实验以TNBC细胞作为研究对象;此外,Cancer MIRNome数据库分析结果还发现,miR-155-5p具有较好的乳腺癌诊断价值(AUC为0.84),有望成为诊断乳腺癌生物学标志物的潜在可能。2.高水平miR-155-5p能够增强TNBC细胞增殖、转移及抗凋亡的能力相较于阴性对照组来说,转染miR-155-5p inhibitor组的TNBC细胞(MDAMB-231和SUM-159)中miR-155-5p的表达量均明显减少(P<0.05),而转染miR-155-5p mimics组的TNBC细胞中miR-155-5p的表达水平均显著增加(P<0.001),以上结果表明,低表达和过表达miR-155-5p的转染效率较好,细胞成功转染。CCK-8实验结果表明过表达miR-155-5p的MDA-MB-231和SUM-159细胞存活率相较于阴性对照组细胞而言明显有所提高(P<0.05);相反,与阴性对照组细胞相比,低表达miR-155-5p的两株TNBC细胞存活率明显下降。同时,平板克隆形成实验结果显示了过表达miR-155-5p后的两种TNBC细胞的细胞克隆数均明显增加(P<0.01),而低表达miR-155-5p后的两种TNBC细胞的细胞克隆数均明显减少(P<0.01),表明高表达miR-155-5p的TNBC

关键词： LncRNA   CASC2   胆管癌   NF-κB   ERK1/2  

摘要： 目的:基于课题组前期胆管癌组织标本LncRNA高通量测序研究成果,在体外培养胆管癌细胞系,探索LncRNA CASC2对胆管癌细胞增殖能力、迁移与侵袭能力及细胞有丝分裂周期的影响;探索LncRNA CASC2与NF-κB、ERK1/2通路在胆管癌发生与发展中的作用机制,初步验证LncRNA CASC2在胆管癌中的调控模式,为胆管癌临床早期诊断标志物、分子靶向治疗药物的开发、预后随访与监测提供理论基础。方法:1.体外培养胆管癌细胞系HUH-28、RBE,通过q RT-PCR技术检测CASC2在胆管癌细胞系中的表达;2.通过脂质体lipofectamine2000转染si-CASC2靶向敲减胆管癌细胞中CASC2的表达量,并通过生物显微镜观察对照组转染FAM-si-NC(羧基荧光素标记的阴性对照组si RNA)后的绿色荧光初步判断转染效果,之后通过q RT-PCR验证敲减效果;3.采用CCK-8实验研究CASC2敲减后对胆管癌细胞增殖的影响;4.采用细胞划痕实验及Transwell实验研究敲减CASC2对胆管癌细胞迁移的影响;5.采用Transwell实验研究敲减CASC2对胆管癌细胞侵袭的影响;6.采用FACS细胞流式实验研究敲减CASC2对胆管癌细胞有丝分裂周期的影响;7.通过Western blot检测敲减CASC2对核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路中细胞外信号调节激酶1/2(extracellular-regulated kinase 1/2,ERK1/2)蛋白表达的影响。结果:***-PCR实验结果显示,与正常胆管细胞相比,CASC2在胆管癌细胞Hu H-28和RBE细胞系均高表达(p<0.05),与我们前期在胆管癌组织中的检测结果相一致;2.荧光显微观察显示,HUH-28及RBE细胞系si-CASC2转染效率可达80%以上,q RT-PCR结果显示,转染si-CASC2后HUH-28及RBE中CASC2表达量与对照组中相比明显降低(p<0.01);***-8结果显示,敲减CASC2后,胆管癌细胞HUH-28、RBE的增殖活性低于对照组(p<0.05),即敲减CASC2后的胆管癌细胞增殖活力会降低;4.细胞划痕实验及Transwell实验结果显示,当CASC2被敲减后迁移速率明显低于对照组(p<0.01),说明CASC2的敲减可以显著降低胆管细胞的迁移能力;***侵袭实验结果显示,敲减CASC2后,穿透基质胶的胆管癌细胞数量较对照组明显下降,说明敲减CASC2可以明显降低胆管癌细胞的侵袭能力,其中对HUH-28细胞系的抑制能力最为显著(p<0.01);***细胞流式实验显示,与对照组相比,敲减CASC2后,胆管癌细胞G1期细胞数量明显增多,而S期细胞数量显著降低(p<0.01),说明敲减CASC2可以抑制胆管癌细胞的有丝分裂;*** blot实验结果显示,敲减CASC2后,NF-κB与ERK1/2蛋白表达较对照组明显降低(p<0.01),说明敲减CASC2可以明显抑制CASC2/NF-κB、CASC2/ERK1/2信号通路的激活。结论:*** CASC2可以通过影响胆管癌细胞增殖、迁移、侵袭能力及细胞有丝分裂G0/G1期发挥促癌作用;*** CASC2在胆管癌中发挥作用的机制与NF-κB、ERK1/2信号通路的激活具有相关性;