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关键词： 间充质干细胞   急性移植物抗宿主病   免疫调节   成脂分化   成骨分化  

摘要： 目的:探讨PTX3和miR-25-3p对间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）生物学特性的影响。内容:1.培养鉴定人脐带来源MSC（human umbilical cord derived mesenchymal stem cell,hUC-MSC）和小鼠骨实质来源的MSC;炎症因子刺激hUC-MSC,发现PTX3表达水平升高,生物信息学分析PTX3的功能。2.构建过表达PTX3的慢病毒载体,转染并筛选稳定过表达PTX3的hUC-MSC3.体外实验探讨PTX3对hUC-MSC一般生物学特性的影响4.建立小鼠aGvHD模型,通过体内实验探究PTX3调控hUC-MSC治疗aGvHD的疗效5.体外实验探讨小鼠骨实质来源miR-25-3p对其成脂分化功能的影响方法:1.对体外分离培养的hUC-MSC和小鼠骨实质来源MSC,通过倒置显微镜、流式细胞术鉴定其细胞形态和细胞表型,油红O染色、碱性磷酸酶染色法和q-PCR检测MSC的诱导分化能力,q-PCR检测经炎症因子刺激后hUC-MSC中PTX3表达量,生物信息学分析PTX3发挥相关功能的可能途径。2.构建过表达PTX3的慢病毒载体并将其转染hUC-MSC,通过流式细胞术检测慢病毒载体的转染效率,q PCR和Western blot检测PTX3在m RNA和蛋白水平的表达情况,获得稳定过表达PTX3的hUC-MSC（hUC-MSC-PTX3）和对照载体的hUC-MSC（hUC-MSC-NC）。3.倒置显微镜观察hUC-MSC-PTX3和hUC-MSC-NC的细胞形态,流式细胞术检测细胞表型,油红O染色、碱性磷酸酶染色法和q PCR检测两组细胞的诱导分化能力;流式细胞术和CCK-8检测两组细胞的细胞周期和细胞的增殖能力。4.将hUC-MSC、hUC-MSC-PTX3、hUC-MSC-NC与小鼠脾脏来源的CD3+T细胞共培养,流式细胞术检测各组MSC细胞对T细胞增殖的影响,q PCR检测共培养各组T细胞炎症因子的表达;进一步分离小鼠骨髓单核细胞,加入hUC-MSC、hUC-MSC-PTX3、hUC-MSC-NC浓缩的培养上清,诱导M1型巨噬细胞,流式细胞术检测各组巨噬细胞比例,q PCR检测各组M1型巨噬细胞分化标志物的表达。5.建立小鼠aGvHD模型,尾静脉注射hUC-MSC、hUC-MSC-PTX3、hUC-MSC-NC并观察其疗效,通过记录小鼠的体重、生存率和临床表现的Cook评分评估各组小鼠一般生存状态;HE染色评价各组小鼠的肝、肺、小肠及肛周皮肤的病理学改变;免疫组化染色检测各组小鼠肝脏巨噬细胞和小肠中IL-17A和Foxp3的表达;流式细胞术检测各组小鼠腹腔巨噬细胞比例。结果:1.体外分离培养的MSC呈成纤维状贴壁生长,细胞高表达CD73、CD90、CD105,低表达或不表达CD14、CD34、CD45,具有成脂成骨的分化能力,符合MSC的判定标准,炎症因子刺激hUC-MSC后高表达PTX3,生物信息学分析发现PTX3可能影响hUC-MSC的免疫调节功能。2.成功构建过表达PTX3的慢病毒载体,流式细胞术检测结果显示,PTX3转染hUC-MSC的效率达95%以上,q PCR和Western blot结果证实,转染PTX3慢病毒载体的hUC-MSC在m RNA和蛋白水平高表达PTX3,获得稳定过表达PTX3的hUC-MSC（hUC-MSC-PTX3）和对照载体转染的hUC-MSC（hUC-MSC-NC）。***-MSC-PTX3和hUC-MSC-NC进行MSC生物学特性鉴定,结果表明,PTX3并未改变hUC-MSC的细胞形态和表型特征;诱导分化实验表明PTX3具有促进hUC-MSC成脂分化,抑制hUC-MSC成骨分化的作用;细胞周期和CCK-8检测结果显示,PTX3并不影响hUC-MSC的细胞周期和细胞的增殖能力。4.体外T细胞增殖实验结果表明,hUC-MSC-PTX3抑制T淋巴细胞增殖能力显著降低;体外M1型巨噬细胞分化的实验结果表明,hUC-MSC-PTX3可有效促进M1型巨噬细胞的分化。***-MSC-PTX3、hUC-MSC-NC和hUC-MSC治疗aGvHD小鼠的疗效观察,结果表明,hUC-MSC-PTX3组小鼠较hUC-MSC组与hUC-MSC-NC组的存活率显著降低;临床Cook评分结果显示,hUC-MSC-PTX3组较hUC-MSC组与hUC-MSC-NC组临床症状显著升高;H&E染色结果表明,与hUC-MSC组与hUC-MSC-NC组相比,hUC-MSC-PTX3组小鼠的肝、肺、小肠和皮肤组织病理损伤严重,炎性细胞浸润多;免疫组化结果显示,hUC-MSC-PTX3组M1型巨噬细胞比例显著增多,且高于hUC-MSC组与hUC-MSC

关键词： 细胞生物学   过氧化物酶体   线粒体   互作机制  

摘要： 过氧化物酶体和线粒体是功能密切相关的细胞器，二者均在脂质和活性氧代谢中发挥重要作用。近年来越来越多的研究发现过氧化物酶体与线粒体存在物理上的直接接触，并且过氧化物酶体与线粒体物理上的相互作用对这两种细胞器功能上的协作至关重要。然而，这两种细胞器如何相互作用还不是很清楚。因此，本研究聚焦于使用新型邻近标记系统PUP-IT研究调控过氧化物酶体-线粒体(Peroxisomes-Mitochondria，PerMit)互作的分子机制。　　本文利用过氧化物酶体膜蛋白PEX2，PEX10和PEX12将PUP-IT系统邻近标记酶定位到过氧化物酶体膜上，通过PUP-ITPEX2，PUP-ITPEx10和PUP-ITPEX12鉴定出线粒体融合蛋白MFN1、MFN2，进而探究了位于线粒体外膜的MFN1/2调控过氧化物酶体-线粒体互作的功能。在蛋白质层面，我们首先验证了MFN1/2和过氧化物酶体蛋白存在互作。在功能层面，我们发现MFN1/2过表达能够引起线粒体和过氧化物酶体特异性共聚集。在细胞定位层面，内源MFN1/2在过氧化物酶体-线粒体相互作用位点处富集。利用双分子荧光互补技术，我们进一步确认了MFN1/2促进过氧化物酶体-线粒体互作的功能。当内源MFN1/2在小分子化合物leflunomide诱导下表达显著增加时，细胞内同样能观察到更多过氧化物酶体-线粒体互作点。综上所述，线粒体定位的MFN1/2是重要的过氧化物酶体-线粒体互作调控因子之一。　　过氧化物酶体-线粒体互作必然也涉及到过氧化物酶体蛋白。因此，本文通过小规模过表达筛选，也探究了过氧化物酶体表面潜在的细胞器互作调控蛋白。我们发现过表达过氧化物酶体膜蛋白PEX11A也能够引起线粒体和过氧化物酶体共聚集，免疫共沉淀和邻近连接实验表明MFN1/2与PEX11A存在蛋白质问的相互作用。胞质表达的游离PEX11A能抑制MFN2过表达引起的细胞器共聚集现象。这一系列结果提示MFN2可能通过与PEX11A相互作用来桥接线粒体和过氧化物酶体。然而，在PEX11A敲除细胞中过表达MFN2仍旧可以引起过氧化物酶体和线粒体共聚集，该数据提示，哺乳细胞中可能存在多种调控线粒体和过氧化物酶体相互作用的机制。　　综上所述，本研究首次发现MFN1/2调控哺乳细胞中过氧化物酶体和线粒体两个细胞器间的相互作用，拓展了对过氧化物酶体和线粒体互作的认知，为进一步研究细胞器互作带来的代谢变化提供了基础。此外，PEX11A对过氧化物酶体和线粒体互作也有促进，但MFN1/2与PEX11A是否在同一通路中协同作用还需进一步深入研究。

关键词： Achievement   Biology   Community college   Hybrid   Online courses  

摘要： There is a consistent concern for students' success in undergraduate introductory cell biology as this foundational course may impact their persistence towards earning a degree in the health sciences. Institutions need to consider the delivery method of instruction and the potential impacts on student success and enrollment. For five years, the same instructor taught an undergraduate cellular and molecular biology course using two different teaching methods; hybrid in-person and asynchronous online. Both groups have the same learning outcomes and received the same summative assessments. This exploration provides detailed procedures of the two instructional design models and compares overall semester summative and formative student achievement using a one-way multivariate analysis of variance. Quantitative results indicated that online and hybrid courses slightly differ in summative academic achievement (favoring hybrid) and significantly in formative achievement (favoring online). An end-of-semester survey was also investigated for thematic elements. Survey analysis revealed an overall positive response to both formats and insight into activities and resources that students found crucial to their learning. Implications of this study provide recommendations and elements for course design and policy.

关键词： 功能化自组装多肽   牙髓再生   水凝胶支架   成牙本质分化  

摘要： 在组织再生的研究中,应根据不同组织的生物学特性来寻找符合组织再生的各种要素,尽可能的恢复原有组织的形态结构和功能。牙髓是由髓腔包围的软组织,牙髓组织工程中承载细胞的支架材料,必须具有良好的生物相容性、生物活性和可流动性,并且支架可简便地进入根管系统,为牙髓的再生创造良好的局部微环境。目的:RADA16-I是一种具有规则的二级构象的离子互补自组装多肽,可以自行组装成稳定而有序的纳米结构。Dentonin是细胞外基质磷酸糖蛋白的功能肽片段,含有RGD和SGDG基序,可促进人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)的黏附和增殖。本实验拟将RADA16-Ⅰ和Dentonin结合,设计一种新型的功能化自组装多肽RAD/Dentonin水凝胶支架,期望功能肽片段Dentonin的加入,能提高自组装多肽RADA16-Ⅰ的生物学功能,促进hDPSCs的黏附增殖、迁移,向成牙本质细胞方向分化以及矿化沉积。方法:***的分离和鉴定:实验采用酶消化法结合组织块培养法分离培养hDPSCs;通过免疫荧光染色确定细胞表面波形蛋白和角蛋白的表达,以确定hDPSCs来源;采用CCK-8检测hDPSCs的增殖能力;hDPSCs经成骨、成软骨和成脂诱导后,通过茜素红染色确定hDPSCs的成骨分化能力;阿尔新蓝染色验证hDPSCs的成软骨分化能力;油红O染色验证hDPSCs的成脂分化能力。2.多肽的合成与纯化:多肽通过固相合成法合成,应用质谱分析仪确定多肽的相对分子量,并通过高效液相色谱仪分离、纯化多肽。3.功能化自组装多肽RAD/Dentonin水凝胶支架的微观结构检测和表面形貌观察:运用圆二色光谱仪检测多肽溶液的二级结构光谱,并通过Dichro Web对多肽的二级结构进行定量;应用扫描电子显微镜检测水凝胶支架的表面形貌;并通过旋转流变仪检测水凝胶支架的机械力学性能。4.功能化自组装多肽RAD/Dentonin水凝胶支架对hDPSCs生物学行为的影响:采用CCK-8法确定hDPSCs在支架上的增殖能力;通过免疫荧光染色观察细胞骨架,以确定hDPSCs的黏附伸展情况;运用激光共聚焦显微镜的Z轴扫描,观察Calcein-AM荧光染色的hDPSCs在水凝胶支架中的迁移能力;并通过活/死细胞检测试剂确定细胞在支架上的活细胞和死细胞的比例,以确定支架的生物相容性。5.功能化自组装多肽RAD/Dentonin水凝胶支架对hDPSCs向成骨或成牙本质分化的影响:应用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色确定细胞早期成骨分化的能力,并通过ALP活性检测定量验证;运用实时荧光定量聚合酶链反应(realtime fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)实验,确定支架上hDPSCs的成骨、成牙本质分化相关基因,如runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)和ALP的表达水平;成骨诱导后,通过茜素红染色检测支架对hDPSCs矿化沉积能力的影响。结果:1.人牙髓干细胞的分离和鉴定:实验成功的分离出hDPSCs,hDPSCs呈现出典型的成纤维细胞样形态。免疫荧光染色显示hDPSCs表达波形蛋白,而不表达角蛋白,表明hDPSCs来源于间充质。多向分化诱导染色实验表明hDPSCs可以向成骨、成软骨以及成脂向分化,表明本实验所得hDPSCs具有多向分化潜能。2.功能化自组装多肽RAD/Dentonin水凝胶支架的微观结构和表面形貌:圆二色光谱检测发现多肽溶液呈现出典型的β-折叠结构光谱,Dichro Web定量分析二级结构,表明多肽溶液的二级结构以β-折叠为主。扫描电子显微镜可观察到干燥后的水凝胶形貌呈现出网状结构的纳米纤维。旋转流变仪检测显示1%(w/v)多肽水凝胶,在～0.01%的应变下维持在线性黏弹区,扫描频率为0.1-10 rad/s的过程中,多肽都维持在凝胶状,具有一定的机械强度。3.功能化自组装多肽RAD/Dentonin水凝胶支架对hDPSCs生物学行为的影响:免疫荧光染色表明hDPSCs在支架上可以充分地黏附和伸展;CCK-8法发现hDPSCs在支架上具有较好的增殖活力;细胞迁移实验表明hDPSCs能从支架的表面迁移至水凝胶内部生长;活/死细胞荧光检测表明支架具有良好的生物相容性。以上结果表明功能化自组装多肽RAD/Dentonin水凝胶支架在生物学功能上具有显著的优越性。4.功能化自组装多肽

关键词： CMTM6   结肠癌   EMT   增殖   迁移   侵袭  

摘要： 目的探讨趋化素样因子超家族6(CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing 6,CMTM6)基因的表达对HT29人结肠癌细胞增殖、迁移侵袭能力及对上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程的影响。方法使用Lipo-2000将荧光siRNA转入HT-29人结肠癌细胞内,使用倒置荧光显微镜观察带有荧光的细胞占比来评估转染效率,确定转染效率达80%以上。对实验进行分组:空白对照组、NC-si RNA组和CMTM6-si RNA转染组(CMTM6-1group,CMTM6-2 group,CMTM6-3 group)。空白对照组中加入等量PBS,NCsi RNA组加入Lip-2000和无意义序列的si RNA(即NC-si RNA),CMTM6-si RNA转染组(CMTM6-1 group,CMTM6-2 group,CMTM6-3 group)加入Lip-2000分别将三条人工合成的不同序列(CMTM6-1,CMTM6-2,CMTM6-3)转染至HT-29人结肠癌细胞中。利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测CMTM6 m RNA表达干扰情况并筛选最佳干扰CMTM6-si RNA,Western blot法验证CMTM6蛋白表达干扰情况,确定CMTM6表达被明显敲低,干扰有效。CCK8法检测沉默CMTM6基因表达后,细胞增殖能力的变化。划痕实验检测沉默CMTM6基因表达后,细胞迁移运动能力的变化。Transwell侵袭实验检测沉默CMTM6基因表达后,细胞侵袭能力的变化。q RT-PCR法检测EMT相关标志物E-cadherin(钙黏蛋白E)m RNA、N-cadherin(钙黏蛋白N)m RNA表达情况;Western blot法检测EMT相关标志物E-cadherin蛋白、N-cadherin蛋白的表达情况。结果qRT-PCR及Western blot结果显示三条转染序列对HT-29人结肠癌细胞均具有良好的干扰效果,其中干扰效果最佳的是CMTM6-2 group(P<0.001)。CCK8实验结果显示与control group及NC-si RNA group相比,CMTM6-2 group在24h、48h、72h对细胞增殖能力均具有显著抑制作用(P<0.05)。单层细胞划痕损伤修复实验结果表明,与control group及NC-si RNA group相比,CMTM6-2 group的细胞迁移能力明显被抑制(P<0.05)。Transwell体外侵袭实验结果表明,与control group及NC-si RNA group相比,CMTM6-2 group的细胞侵袭能力明显被抑制(P<0.001)。q RT-PCR及Western blot结果显示,N-cadherin m RNA和蛋白的表达量减少(P<0.001),E-cadherin m RNA和蛋白的表达量增加(P<0.001)。结论沉默CMTM6能够抑制HT-29人结肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力及EMT过程。图 19 幅;表 2 个;参 144 篇。

关键词： 藏绵羊   睾丸   骨形态发生蛋白   SMAD蛋白5   支持细胞  

摘要： 精子发生是一个由睾丸微环境调节的复杂而精细的过程,受到许多基因在多个层面(表观遗传、转录、转录后、翻译、翻译后等)的精密调控。睾丸微环境由SCs、LCs、血管、生长因子和细胞因子等组成。BMP4和BMP6是BMPs的成员,作为TGF-β信号通路的上游基因,能够促进细胞的DNA合成和细胞增殖。SMAD5是其下游信号介质,可以抑制细胞凋亡,三者在雄性动物生殖过程中起着关键作用。为了研究BMP4/6和SMAD5在藏绵羊(Ovis aries)睾丸发育和精子发生过程中的作用,本研究进行了以下实验:(1)以不同发育阶段(3月龄、1周岁和3周岁)的藏绵羊为研究对象,运用q RT-PCR、Western blot和免疫组织化学染色法从转录和翻译水平检测了BMP4、BMP6和SMAD5在藏绵羊睾丸不同发育阶段的表达和分布模式。(2)运用q RT-PCR检测了BMP4和BMP6mRNA在SCs和LCs中的表达情况。(3)对藏绵羊BMP4进行过表达和沉默,CCK-8检测SCs的增殖情况后对SCs中BMP4蛋白及下游基因SMAD5、通路受体蛋白BMPR1A和BMPR1B、连接蛋白Claudin11、Occludin和ZO1的mRNA和蛋白的表达情况,以及增殖凋亡相关基因GDNF、Caspase3、Bcl2和Bax,细胞周期相关基因Cyclin A2和CDK2 mRNA的表达情况进行检测,实验结果如下: 1.1周岁(性成熟期)和3周岁(成年)藏绵羊睾丸组织中BMP4和BMP6mRNA和蛋白的相对表达量极显著高于3月龄(性成熟前)(P<0.01),SMAD5mRNA的表达随年龄增长极显著降低(P<0.01),SMAD5蛋白的表达随年龄增长极显著升高(P<0.01)。免疫组织化学染色法结果显示BMP4、BMP6和SMAD5蛋白在不同发育阶段的SCs和LCs中表达。 ***4和BMP6 mRNA在SCs和LCs中都有较高表达,且在SCs的表达量高于LCs。 ***3.1(+)-BMP4能有效促进绵羊SCs中BMP4蛋白的表达,显著增加SMAD5、BMPR1A、BMPR1B、Claudin11、Occludin和ZO1 mRNA和蛋白的表达(P<0.05);si-BMP4能有效抑制绵羊SCs中BMP4蛋白的表达,显著降低SMAD5、BMPR1A、BMPR1B、Claudin11、Occludin和ZO1 mRNA和蛋白的表达(P<0.05)。 4.转染后用CCK-8检测SCs的增殖情况发现24 h无显著差异(P>0.05)。48 h和72 h后pc DNA3.1(+)-BMP4组细胞数量显著高于空载体组(P<0.05)。siBMP4组的细胞数量显著低于NC组(P<0.05)。过表达BMP4后,Bcl2、Cyclin A2和CDK2 mRNA的表达显著上调(P<0.05),Caspase3和Bax mRNA的表达显著下调(P<0.05),GDNF mRNA的表达上调。沉默BMP4后,Bcl2、Cyclin A2和CDK2 mRNA的表达显著下调(P<0.05),Caspase3和Bax mRNA的表达显著上调(P<0.05),GDNF mRNA的表达下调。这些结果表明过表达BMP4促进SCs细胞增殖,沉默BMP4抑制SCs细胞增殖。

关键词： 安罗替尼   胃癌   差异表达基因   转录组测序  

摘要： 目的探讨安罗替尼对胃癌细胞生物学特性的影响及其可能的分子机制。方法使用CCK-8法检测安罗替尼对胃癌细胞生长增殖能力的影响。使用划痕实验和Transwell实验检测安罗替尼对胃癌细胞迁移和侵袭能力影响。使用Hoechst 33342荧光染色法检测胃癌细胞的凋亡情况。使用TRIzol提取细胞总RNA,进行转录组测序。基因差异表达分析使用DESeq2程序包,通路分析和功能富集使用cluster Profiler包;使用Cytohubba插件的MCC算法寻找关键互作蛋白;使用r MATS软件进行可变剪切分析。结果安罗替尼可显著抑制胃癌细胞的生长增殖能力,且该抑制作用具有剂量和时间依赖性。Transwell和划痕实验结果显示安罗替尼抑制胃癌细胞的迁移和侵袭能力。凋亡荧光染色结果显示,经安罗替尼处理的胃癌细胞有更多具有染色荧光加强、核染色质浓缩特征的凋亡细胞。对安罗替尼处理后的胃癌细胞进行转录组分析,发现安罗替尼致1549个基因发生差异表达(275个上调,1274个下调)。GO分析结果显示,安罗替尼影响的生物学过程包括甾醇生物合成过程、胆固醇生物合成、二次醇生物合成等;安罗替尼影响的细胞组分包括核染色体动粒凝聚、微绒毛细胞顶端等。KEGG通路富集分析提示,安罗替尼影响细胞周期和花生四烯酸代谢、类固醇生物合成等通路。对经安罗替尼处理后的差异表达基因进行蛋白相互作用网络分析,结果显示CDC20、CCNB1、STK6、PTTG1、HMMR、KIF20A、CEP55、DLGAP5、PLK1和CKS2作用关系最密切;当基因发生可变剪切时可能会影响代谢途径、溶酶体等途径。在差异表达基因中,安罗替尼的靶基因PDGFRB表达水平下降,进一步分析显示,该基因表达与胃癌病理分期显著相关,而且该基因在胃癌中的高表达不利于胃癌患者预后。结论安罗替尼抑制胃癌细胞BGC-823的增殖、迁移及侵袭能力,促进细胞凋亡;安罗替尼可能通过调控相关基因的表达以及相关作用通路实现胃癌中的抗肿瘤作用。图13幅;表6个;参142篇。

关键词： 课程思政   细胞生物学   教学策略  

摘要： 思想政治教育是我国教育体系中的重要内容，有着引领学生思想观念、提升学生政治素养、培养优秀思想品质的作用。在我国的高等教育中，传统的思想政治教育方式已经无法满足时代的变化与需求，存在着枯燥、单一等问题。课程思政是一种将思政教育与专业课程相结合的教学理念，有利于形成协同发展、全面育人的新局面。以细胞生物学这一专业课程为例，首先阐述了课程思政的基本概念和实施意义，然后分析了思政课程与细胞生物学课程的特点，深度挖掘了细胞生物学教学内容中的思政元素，提出了课程思政与细胞生物学知识点融合教学的有效方法，为国家培养具有良好思想政治素养的优秀人才。