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关键词： 子宫内膜癌   ETS1   生物学功能   上皮-间质转化  

摘要： 子宫内膜癌(Endometrial carcinoma,EC)是女性常见的恶性生殖道肿瘤之一。本课题组前期构建子宫内膜癌细胞与间充质干细胞接触共培养模型,模拟肿瘤微环境中多细胞共同作用模式,经过转录组测序分析发现,在共培养后的内膜癌细胞中,ETS1(ETS proto-oncogene 1,transcription factor,ETS1)基因的表达明显升高。研究发现,在子宫内膜癌中ETS1呈过表达,并且与淋巴结转移、肌层浸润有关联,提示预后不良[1-4],但其在EC中的作用机制目前尚未明确。因此本研究通过过表达和沉默ETS1基因,探索ETS1表达水平变化对子宫内膜癌HEC-1-A生物学功能的影响,以及能否调节上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)及基质金属蛋白酶 9(Matrix metalloproteinase 9,MMP9)的表达。第一部分构建过表达和沉默ETS1基因的慢病毒载体并稳定感染HEC-1-A细胞系目 的:通过慢病毒载体介导基因过表达和RNA干扰技术,分别构建稳定过表达(over expression)和沉默(knockdown)ETS1基因的子宫内膜癌HEC-1-A细胞模型。方法:1、构建并包装过表达ETS1基因的慢病毒重组质粒及其阴性对照质粒,分别感染HEC-1-A细胞,感染过表达ETS1重组慢病毒的细胞作为ETS1-OE组,感染其阴性对照质粒的细胞作为OE-NC组。2、构建并包装沉默ETS1基因的慢病毒重组质粒及其阴性对照质粒,分别感染HEC-1-A细胞,感染沉默ETS1重组慢病毒的细胞作为ETS1-KD组,感染其阴性对照质粒的细胞作为KD-NC组。3、通过qRT-PCR验证各组细胞ETS1 mRNA表达情况以确认感染效率,并用药物筛选稳定过表达ETS1和沉默ETS1表达的HEC-1-A细胞。结 果:1、感染慢病毒72小时后,qRT-PCR结果显示,ETS1-OE组细胞的ETS1 mRNA相对表达量(55.46±0.97)相比其阴性对照组(1.00±0.11)显著上调(P<0.05)。ETS1-KD 组细胞 ETS1 mRNA 相对表达量(0.11±0.01)比其阴性对照组(1.00±0.04)显著下调(P<0.05)。2、药物筛选14天后各组细胞荧光表达率均在90%以上,获得稳定感染的HEC-1-A细胞系。结 论:分别成功构建了稳定的过表达和沉默ETS1基因的子宫内膜癌HEC-1-A细胞模型。第二部分过表达和沉默ETS1基因对HEC-1-A细胞生物学功能的影响目 的:探索ETS1表达水平变化对HEC-1-A细胞的增殖、迁移、侵袭的影响,以及对细胞EMT是否有调节作用。方法:1、通过CCK-8法和EdU法协同检测空细胞组(未感染慢病毒的HEC-1-A 细胞,作为 Blank 组)、ETS1-OE 组、OE-NC 组、ETS1-KD 组、KD-NC组细胞的增殖能力。划痕实验检测各组细胞的迁移能力。Transwell实验检测各组细胞的迁移、侵袭能力。2、通过qRT-PCR检测各组细胞中ETS1、EMT相关分子标志物E-cadherin 和 Vimentin 的 mRNA 表达情况。3、通过Western blot检测各组细胞中ETS1、E-cadherin、Vimentin及MMP9的蛋白表达情况。结 果:1、CCK-8检测结果显示:ETS1-OE组在1～4天每天的OD值均高于Blank组、OE-NC组,对应的细胞增殖率分别为194.5%、164.5%、155.0%、120.9%,P均<0.05。ETS1-KD组每天的OD值均低于Blank组、KD-NC组,对应的细胞抑制率分别为19.2%、26.9%、37.2%、47.9%,P均<0.05,差异均有统计学意义。2、EdU检测结果显示:ETS1-OE组EdU荧光阳性的细胞比率为96.1%±0.03,高于 Blank 组(80.8%±0.02)及 OE-NC 组(80.8%±0.07),P<0.05。ETS1-KD组EdU荧光阳性的细胞比率为46.7%±0.03,明显低于Blank组(80.8%±0.02)及 KD-NC 组(83.3%±0.03),P<0.05。3、划痕实验结果提示:ETS1-OE组在72h的细胞划痕愈合率为61.1%±0.01,高于 Blank 组(50.1%±0.02)和 OE-NC 组(41.3%±0.04),P<0.05。ETS1-KD组在72h的细胞划痕愈合率为23.2%±0.02,低于Blank组(51.4%±0.04)和 KD-NC 组(43.6%±0.12),P<0.05。4、Transwell迁移实验结果提示:ETS1-OE组的迁移细胞数量为272.33±6.66,高于

关键词： Notch通路   绵羊   滋养层细胞   胚胎附植  

摘要： 胚胎附植是动物囊胚滋养层细胞与母体子宫内膜上皮细胞逐步建立组织和生理上的联系的过程,在此过程中,滋养层细胞由附植完成前的胚胎滋养层细胞,发育成附植后的胎盘滋养层细胞。Notch通路可在发育过程中调控细胞命运,是组织和胚胎发育的重要通路之一。Notch信号通过相邻细胞之间的配体-受体相互作用激活,促进Notch受体的γ-分泌酶依赖性切割,并将Notch胞内结构域（NICD）释放到细胞核中,与转录因子CSL结合,激活该通路,从而调节细胞的分化、侵袭等过程。Notch通路可通过调节绵羊滋养层细胞的生物学作用从而调节绵羊胚胎附植的过程。目的:研究Notch通路激活剂JAG-1和抑制剂DAPT对绵羊滋养层细胞增殖、凋亡与周期、迁移侵袭的影响;方法:（1）采用组织块培养法、胰酶消化法和胰酶+组织块法分离原代滋养层细胞,通过胰酶差时消化法对细胞进行纯化,观察滋养层细胞的形态学特点和生长特性,利用免疫细胞化学法对滋养层细胞的特异性表达角蛋白7（cytokeratin7,CK7）进行鉴定,通过RT-PCR对绵羊滋养层细胞标志基因干扰素-τ进行检测,同时使用孕酮（P4）、雌二醇（E2）和干扰素-τ（IFN-τ）处理滋养层细胞,实时荧光定量PCR（q RT-PCR）检测胚胎附植相关基因的转录水平;（2）体外培养绵羊滋养层细胞,将滋养层细胞分为Notch通路激活组、Notch通路抑制、空白对照组,采用CCK8法检测JAG-1和DAPT对细胞增殖活力的影响;采用q RT-PCR检测各组细胞中Notch1和配体Jagged-1、靶基因Hes1、VEGF和细胞周期相关基因CCNA2、CCNB1、Cyclin D1的转录水平,WB法检测Notch1及凋亡相关蛋白Caspase-9、Bcl-2、Bax、Cyt c的蛋白表达水平;（3）细胞划痕试验检测各组细胞的迁移,q RT-PCR检测各组细胞中侵袭相关基因MMP-2、MMP-9的转录水平,采用ELISA和q RT-PCR分别检测Notch通路对前列腺素E2（PGE2）和前列腺素F2α(PGF2α)分泌和前列腺素合成酶表达的影响。结果:（1）结果显示,与其它方法相比,利用胰酶+组织块法细胞生长周期较短,观察细胞均呈上皮样生长。滋养层细胞鉴定CK7染色阳性结果大于95%。RT-PCR检测到分离的绵羊滋养层细胞可正常表达干扰素-τ（IFN-τ）。此外,通过P4、E2和IFN-τ处理后,胚胎附植相关基因ISG15、CXCL10、RSAD2、CTSL、SPP1和MUC1在滋养层细胞中的表达水平均显著上调。证实该细胞可体现出胚胎附植过程中母体胎盘滋养层的主要特性,为后续试验提供滋养层细胞基础。（2）Notch通路抑制剂DAPT显著抑制滋养层细胞的增殖并具有时间和剂量依赖性,而JAG-1对滋养层细胞的增殖无显著影响。与对照组相比,激活组Jagged-1、Hes1、VEGF表达水平极显著上调（P<0.01）,而抑制组Notch1、Jagged-1、Hes1、VEGF表达水平显著下降（P<0.05）;激活组和抑制组CCNA2和CCNB1在转录水平上显著降低,而Cyclin D1,激活组表达水平显著升高,抑制组显著降低。与对照组相比,Notch1蛋白激活组显著降低,抑制组显著升高;细胞凋亡相关蛋白,（3）抑制组抑制凋亡蛋白Bcl-2表达减少（P<0.05）,促凋亡蛋白Bax、Caspase9、Cyt c表达增加（P<0.05）,激活组凋亡相关蛋白表达与之相反。表明Notch通路影响绵羊滋养层细胞的增殖和凋亡能力。（4）激活组与对照组相比其细胞迁移率显著升高,抑制组显著降低。q RT-PCR结果显示,与对照组相比,激活组MMP-2、MMP-9表达水平极显著上调（P<0.01）,而抑制组MMP-9显著升高（P<0.05）,MMP-2无显著差异（P>0.05）。ELISA结果显示,与对照组相比,激活组PGE2显著升高,抑制组PGF2α显著降低,抑制组PGE2和激活组PGE2无显著差异（P>0.05）。与对照组相比,抑制组PTGS1和PGFS的基因表达显著降低（P>0.05）,PTGS1和PTGES显著升高（P>0.05）;激活组结果与之相反。表明Notch通路影响绵羊滋养层细胞的迁移侵袭能力。结论:本研究通过胰酶+组织块培养法结合胰酶差时消化法成功分离和纯化绵羊原代滋养层细胞;并通过Notch通路激活剂JAG-1和抑制剂DAPT处理绵羊滋养层细胞,Notch1表达升高对滋养层细胞增殖无显著影响,可减少细胞凋亡,对细胞迁移侵袭能力有促进作用;Notch1表达降低可抑制滋养层细胞增殖,促进细胞凋亡,滋养层细胞的体外迁移侵袭能力降低。表明Notch通路对绵羊滋养层细胞基本功能的调控作用,为进一步研究Notch通路对绵羊胚胎附植的影响奠定了基

关键词： 白血病   生物信息学分析   TCP1单体   CCT细胞   NB4细胞  

摘要： 目的：TCP1与AML的疾病发生发展过程和预后密切相关。本研究运用生信分析方法探究TCP1在AML中的表达及其意义，进一步构建TCP1单体或复合体蛋白探究对NB4细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响，同时分析TCP1在NB4细胞上对微管蛋白抑制剂（长春新碱、紫杉醇）药物敏感性的影响。　　方法：　　1.在Perl和R语言环境，运用K-M和Cox法对GEO数据集进行TCP1生存相关性分析，使用COX回归模型进行独立预后分析，并且利用t检验进行差异性基因分析和KEGG、GO功能富集分析。联合GTEx和TCGA数据库使用GSEA软件对TCP1进行KEGG功能富集分析，使用STRING数据库运用Cytoscape软件对TCP1进行PPi蛋白互作网络分析。　　2.通过在TCP1不同的位点嵌入EGFP，去阻遏或者不阻遏其形成CCT复合物，制备TCP1单体或复合体质粒表达载体，使用慢病毒包装转染NB4细胞，获得TCP1单体或复合体蛋白表达稳转细胞。用CCK-8法和克隆形成检测细胞的增殖，AnnexinV–FITC/PI染色法检测细胞的凋亡，用PI单染法染色法检测细胞的细胞周期变化。　　3.用不同浓度长春新碱（Vincristine）和紫杉醇（Paclitaxel）（0、0.1、0.2、0.4、1.0、2.0、1.0、2.0umol/L）分别处理表达TCP1单体或复合体的NB4细胞，CCK-8法检测细胞的增殖，用AnnexinV–FITC/PI染色法检测加药后细胞的凋亡情况。　　结果:　　1.在数据集GSE37642-GPL96（417例）中，TCP1高表达组AML患者5年总生存率（OS）均低于TCP1低表达AML患者（20.3％vs33.1%），12年内生存也有统计学差异(P＜0.001)。在AML-M2（116例）、AML-M3（103例）中，TCP1高表达组5年OS均低于TCP1低表达组（16.2%vs34.1%，29.2%vs72.1%），并且12年内生存也有统计学差异（P=0.033，P＜0.001）。　　***1表达水平与AML患者预后呈负相关（HR=1.692，P＜0.001），COX回归识别TCP1是AML的独立预后因素（P=0.002）。TCP1表达受多种因素影响：TCP1在老年AML患者（＞65岁）显著高表达（P=0.019）。根据ELN危险分层，TCP1在高危组表达水平均显著高于中危组和低危组AMl患者（P＜0.01）。而中危组AML患者TCP1表达水平显著高于低危组AML患者（P＜0.001）。　　***1通过KEGG、GO功能富集于细胞因子与受体的相互作用、细胞周期和多条蛋白质的合成与代谢通路，PPis显示与TCP1关系紧密的有微管调节蛋白TUBBI，TUBA4A。　　4.荧光显微镜及western-blot鉴定TCP1-DT（EGFP-TCP1单体亚基蛋白）、TCP1-CCT（TCP1-EGFP-TCP1复合体融合蛋白）在NB4细胞成功表达。与NB4/CON细胞相比，CCK8结果显示，NB4/TCP1-DT细胞增殖能力受到抑制(P＜0.01)，而NB4/TCP1-CCT细胞促进增殖(P＜0.01);克隆形成实验结果显示，NB4/TCP1-DT细胞克隆形成的能力受到明显抑制(P=0.0003),NB4/TCP1-CCT细胞克隆形成能力增强（P=0.0004）;流式检测凋亡结果显示，NB4/TCP1-DT细胞的凋亡率升高（P=0.006），NB4/TCP1-CCT细胞无显著差异;流式检测细胞周期结果显示，NB4/TCP1-DT细胞S期细胞比例降低（P=0.0001），G2期细胞比例有明显升高（P=0.0009），表达EGFP-TCP1单体可使NB4细胞阻滞在G2期。　　5.长春新碱处理细胞48h后，与NB4/CON细胞相比，NB4/TCP1-DT细胞增殖受抑制显著（P＜0.001），凋亡更明显（P=0.0028），而NB4/TCP1-CCT细胞增殖受抑制程度更小（P＜0.001），凋亡明显受抑（P=0.0015）;而紫杉醇处理细胞48h后，NB4/TCP1-DT细胞对增殖抑制作用更显著（P＜0.001），凋亡无明显差异（P=0.576），而NB4/TCP1-CCT细胞增殖受抑制程度更小（P＜0.001），凋亡受到抑制（P=0.016）。　　结论：　　***1在AML中存在高表达，与预后负相关，可作为AML独立的预后因素，在AML患者中的表达水平受年龄、FAB分型、ELN危险分层多种因素影响;TCP1主要参与细胞因子与受体的相互作用、细胞周期和多条蛋白质的合成与代谢通路，并与微管蛋白有密切联系。　　***1很可能是以CCT复合物形式调控NB4细胞促进增殖，发挥抗凋亡能力，而游离的TCP1单体亚基蛋白会抑制细胞增殖

关键词： Rpn10   肺腺癌   预后   生物学功能  

摘要： 肺癌是发病率最高的肿瘤之一,也是癌症死亡的主要原因。在我国肺癌相关死亡人数在所有疾病中位居第三,仅次于卒中和缺血性心脏病。随着控烟运动以及胸部CT筛查的普及,肺癌的疾病谱发生了极大的改变,肺腺癌已经超过肺鳞癌成为肺癌的主要病理类型。肺腺癌恶性程度高预后差,早期诊断是改善预后的重要途径;EGFR高突变率是我国肺腺癌流行病学的重要特征,靶向治疗极大改善了肺腺癌预后,然而靶向耐药一直限制着肺腺癌预后的进一步改善。深入研究肺腺癌对EGFR-TKI耐药的机制,寻找肺腺癌早期诊断和EGFR-TKI耐药的生物标志物是亟待解决的问题。 Rpn10,是蛋白酶体的重要亚基,参与蛋白酶体的组装,在细胞生长发育中发挥重要功能。既往研究发现Rpn10除了作为蛋白酶体亚基发挥功能外,在数种恶性肿瘤中高表达,对相关肿瘤的发生发展及耐药起正向调控作用,然而在肺腺癌尚中无关于Rpn10的研究。本研究拟分析Rpn10在肺腺癌中的表达及对预后的影响,探索其对肺腺癌细胞生物功能及靶向耐药的调控作用,并阐明相关机制,为肺腺癌诊断和耐药监测寻找新的生物标志物,并为肺腺癌的治疗尤其是克服靶向治疗耐药问题寻找新思路。 在本研究第二章节中通过利用网路生信分析工具,我们发现Rpn10在肺腺癌中以扩增突变为主,Rpn10在肺腺癌组织中高表达,是肺腺癌的不良预后因素。收集我院94例患者的病理标本及临床基本信息,通过IHC技术检测Rpn10的蛋白表达,发现Rpn10在癌组织中高表达,且中晚期肺癌中高表达Rpn10的患者更多,Rpn10是肺腺癌的不良预后因素;我们还利用IHC方法检测了部分患者EGFR的蛋白水平,发现尽管没有统计学意义,但EGFR高表达的患者中,高表达Rpn10的患者比例更多。此外,我们收集26例肺腺癌患者和50例正常人的血清,通过ELISA检测血清Rpn10的蛋白水平,发现Rpn10在肺腺癌患者血清中高表达,Rpn10有望成为肺腺癌早期诊断的生物标志物。 第三章的研究中,我们通过慢病毒转染技术建立了Rpn10敲降或过表达的稳定细胞系。通过在稳转株细胞中行CCK-8实验及裸鼠荷瘤实验,我们证实Rpn10能够在体内体外促进肺腺癌细胞的增殖;通过流式细胞技术检测细胞周期分布,发现Rpn10能够调控肺腺癌细胞的周期进程,进一步调控细胞的增殖;在稳转株中行平板克隆实验结果显示Rpn10能提升肺腺癌的体外克隆形成能力;利用流式细胞技术检测细胞凋亡,结果显示敲降Rpn10肺腺癌细胞凋亡增加,而过表达Rpn10可以略微减少肺腺癌的细胞凋亡,证明Rpn10增强肺腺癌抵抗细胞凋亡的能力。通过RT-q PCR技术检测Rpn10对肺腺癌EMT标志物的影响,发现Rpn10促进肺腺癌的EMT转化;利用细胞划痕实验及Transwell侵袭实验发现消减Rpn10后肺腺癌侵袭迁移能力减弱;Rpn10可以通过促进肺腺癌EMT转化增强肺腺癌细胞的侵袭迁移能力。 在第四章中我们利用流式细胞技术检测Gefitinb引起的细胞凋亡,发现过表达Rpn10后Gefitinb引起的肺腺癌细胞凋亡明显减少,Rpn10能够增强肺腺癌抵抗Gefitinb导致的细胞凋亡。 本研究的第五章,我们通过RNA测序锁定Rpn10在肺腺癌中调控EGFR的表达,并利用RT-q PCR证实Rpn10调控EGFR的m RNA表达水平。通过WB实验证实Rpn10调控EGFR的蛋白表达;利用CHX抑制蛋白合成,我们发现消减Rpn10仍导致EGFR蛋白下调,提示Rpn10除了通过调控EGFR的m RNA调控EGFR的蛋白水平,还可能调控EGFR的降解;并进一步通过IP实验证实Rpn10不与EGFR结合,排除了Rpn10直接结合EGFR调控其降解的可能;利用MG132抑制蛋白酶体活性并不能挽救消减Rpn10引起的EGFR下调,提示Rpn10不是通过蛋白酶体调控EGFR降解;最后我们抑制溶酶体活性后再行WB实验检测EGFR蛋白变化,显示抑制溶酶体活性能够挽救Rpn10导致的EGFR下调,Rpn10通过溶酶体调控EGFR的蛋白稳态,进一步正向调控肺腺癌的发生发展及耐药。 本研究在临床层面发现Rpn10在肺腺癌组织及血清中高表达,Rpn10有望成为辅助肺腺癌诊断的生物标志物。在分子细胞及动物实验层面:Rpn10可以通过调控肺腺癌的EMT转化影响肺腺癌的转移;Rpn10能够调EGFR的m RNA表达影响EGFR的合成,并通过溶酶体途径的调控减少EGFR的降解,维持肺腺癌中EGFR的高蛋白水平,增强肺腺癌增殖及抗凋亡的能力,促进肺腺癌的靶向耐药,为肺腺癌的治疗提供了新的理论依据和治疗思路。

关键词： 胃癌   GSC   侵袭   迁移   上皮-间质转化  

摘要： 胃癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一,虽然近年来胃癌的癌症发病率和死亡率呈下降趋势,但是疾病负担仍然较重。探索胃癌的发病机制,寻找有效的胃癌诊断和治疗靶点对改善胃癌患者预后具有重要的意义。Goosecoid(GSC)是胚胎发育过程中参与细胞极化和迁移的同源异型框(Homeobox)转录因子,具有高度稳定性,是良好的候选生物标志物。本研究中,我们通过分析胃癌RNA-Seq数据发现GSC在胃癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织,且GSC高表达的胃癌患者预后较差。这些发现提示GSC有可能作为原癌基因促进胃癌的发生和发展,然而目前关于GSC在胃癌发生发展中的分子机制尚不清楚,探讨其具体的作用机制,为胃癌的诊疗提供一定的研究方向。第一部分GSC在胃癌组织中的表达目的:研究GSC在胃癌组织中的表达及其对患者生存的影响。方法:1.通过TNMplot数据库和Ualcan数据库分析胃癌组织中GSC的表达水平。2.通过Ualcan数据库评估胃癌组织中GSC的表达与肿瘤分期的关系。3.通过Kaplan-Meier Plotter数据库分析胃癌组织中GSC的表达对患者生存的影响。4.收集手术切除的胃癌组织样本,通过免疫组织化学方法检测GSC在胃癌组织中的表达情况。5.通过TIMER数据库评估胃癌组织中GSC表达与免疫细胞浸润的相关性。结果:***数据库和Ualcan数据库的RNA-Seq data分析结果显示,与正常胃黏膜组织样本相比,GSC在胃癌组织中表达升高,结果具有统计学意义(P=6.86e-27,P=2.78e-9)。***数据库分析显示,GSC在进展期胃癌(StageⅡ、StageⅢ)和晚期胃癌(StageⅣ)中的表达显著高于早期胃癌(StageⅠ),结果具有统计学意义(P<0.05)。***-Meier Plotter数据库分析结果显示胃癌组织中GSC高表达是胃癌患者预后不良的危险因素(HR>1),GSC高表达组的胃癌患者总体生存期、无进展生存期及进展后生存期较GSC低表达组的患者明显缩短(P=0.00042,P=0.043,P=2.4e-6)。4.我们收集8例胃癌组织及相应正常胃粘膜组织,免疫组织化学染色(Immunochemistry,IHC)结果显示GSC在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织。***数据库分析结果显示胃癌中巨噬细胞的浸润水平与胃癌组织中GSC的表达呈正相关关系(COR=0.209,P=5.03e-5)。进一步分析显示,胃癌组织中肿瘤相关巨噬细胞的特异性标志物CCL2和CD68的表达水平与GSC的表达呈正相关关系(COR=0.153,P=1.79e-3;COR=0.174,P=3.71e-4);M1型巨噬细胞特异性标志物INOS(NOS2)与GSC的表达呈负相关关系(COR=-0.132,P=7.21e-3),M2型巨噬细胞特异性标志物,包括CD163、CD206(MRC1)、IL-10、TGF-β的表达与GSC的表达呈显著正相关关系(COR=0.114,P=2e-2;COR=0.113,P=2.11e-2;COR=0.108,P=2.84e-2;COR=0.211,P=1.48e-5)。小结:我们通过TNMplot数据库和Ualcan数据库分析,发现GSC基因在胃癌组织中表达升高。Ualcan数据库分析显示,GSC在中晚期的胃癌组织中高表达。Kaplan-Meier Plotter数据库分析显示,GSC高表达的胃癌患者总体生存期、无进展生存期及进展后生存期较GSC低表达的患者明显缩短。TIMER数据库分析结果显示,胃癌组织中GSC的表达与具有M2表型的肿瘤相关巨噬细胞浸润呈正相关关系。第二部分GSC对胃癌细胞生物学功能的影响目的:研究GSC基因对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法:1.通过Western blot和免疫荧光分析技术,检测GSC在胃癌细胞系的表达和亚细胞定位。2.在人胃癌细胞株BGC-823、SGC-7901和MGC-803中,利用lipo2000转染GSC-si RNA或者GSC质粒构建瞬时敲低或者过表达GSC的胃癌细胞株,Western blot分析GSC的敲低和过表达效率。3.利用MTS实验和平板克隆形成实验检测瞬时敲低GSC对胃癌细胞增殖和克隆形成能力的影响。4.采用Transwell、划痕愈合实验和Migrate侵袭实验检测瞬时敲低GSC对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响。5.应用MTS实验和平板克隆形成实验检测过表达GSC对胃癌细胞增殖和克隆形成能力的影响。6.采用Transwell、划痕愈合实验和Migrate侵袭实验检测过表达GSC对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响。7.利用慢病毒侵染和嘌呤霉素筛选的方法,构建稳定低表达GSC的胃癌细胞株BGC-823和S

关键词： 低强度脉冲超声   骨再生   血管生成-成骨耦合   外泌体   高通量测序  

摘要： 目的:低强度脉冲超声波(low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS)是一种在骨再生领域广泛应用的物理学疗法。本组前期实验对LIPUS作用下多孔钛合金支架材料上成骨细胞的生物学行为展开了体内外研究,发现在兔颌骨缺损模型中,LIPUS可以促进新骨形成及血管生成,然而这种作用的机制还没有完全阐明。血管生成-成骨耦合指骨折愈合过程中骨再生和血管生成之间密切的空间和时间联系,在维持骨代谢平衡中起关键作用,其机制主要和成骨细胞、内皮细胞及其前体之间的直接细胞间通讯以及其产生的各种自分泌和旁分泌因子相关。外泌体是细胞分泌的直径在30-150nm之间的细胞外双层脂质囊泡,内含非编码RNA、蛋白质、DNA等多种内含物,可以通过传递靶向miRNA在血管生成-成骨耦合过程中发挥作用。因此,本研究将LIPUS作用下小鼠胚胎成骨前体细胞(mouse embryo osteoblast precursor cells,MC3T3-E1)分泌的外泌体和人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)共培养,通过检验内皮细胞的生物学效应,研究LIPUS能否通过影响MC3T3-E1细胞的外泌体在成骨细胞和内皮细胞的细胞间通讯中发挥作用。为进一步探究其机制,应用lllumina-Seq技术对Lipus组及Control组的外泌体进行small RNA测序,对测序结果进行生物信息学分析,为下一步的体内外机制研究奠定基础。研究方法:1、将MC3T3-E1细胞接种到多孔钛合金支架材料上,加载LIPUS和假辐照,4、7天后收集细胞上清,超高速离心法分离外泌体。透射电镜鉴定外泌体形态,纳米粒子追踪技术鉴定外泌体粒径分布及浓度,免疫印迹法鉴定外泌体标志蛋白。2、将Dil细胞膜红色荧光染料预染的外泌体和HUVEC细胞共培养,共聚焦显微镜下观察外泌体摄取情况。用CCK8法,Transwell小室法,成管实验分别检测Lipus组和Control组外泌体对HUVEC细胞增殖、迁移、管形成能力的影响。3、应用lllumina-Seq技术对Lipus组及Control组的外泌体进行small RNA测序,筛选差异性表达miRNA,进行靶基因预测和富集性分析。结果:1、透射电镜下观察到30-150nm茶托样双层囊泡,NTA检验样本粒径分布在30-200nm间,表面表达HSP70、TSG101等标志性分子,证明在Lipus组和Control组上清中都成功提取了外泌体。2、Lipus组和Control组外泌体均能被HUVEC细胞摄取。Lipus组外泌体在共培养24、48、72小时后均可以促进HUVEC细胞增殖(P<0.05),Control组外泌体在共培养24、72小时后促进HUVEC细胞增殖(P<0.05),但两种外泌体之间没有显著差异(P>0.05)。两种外泌体均可促进HUVEC细胞迁移及成血管,Lipus组外泌体表现出更好的效应(P<0.05)。3、测序结果筛选出LIPUS作用下的MC3T3-E1细胞外泌体中miR-124-5p、miR-128-3p、miR-28c表达上调(P<0.01),miR-5100、miR-3474表达下调(P<0.01),生物信息学分析得出差异性miRNA靶基因富集程度最高的是Wnt信号通路和丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路。结论:LIPUS可以影响MC3T3-E1细胞外泌体中的miRNA表达,差异性表达的miR-124-5p、miR-128-3p、miR-28c、miR-5100和miR-3474可能通过调控MAPK、Wnt等信号通路对和外泌体共培养的HUVEC细胞生物学功能产生影响。

关键词： 角膜缘干细胞   分离培养   生物学特性   干细胞治疗  

摘要： 我国拥有非常丰富的畜禽遗传资源,能够长久且有效的保存畜禽遗传资源,对其进行开发和利用不但可以维护生物多样性,还能增强国家生态安全和农业安全的重要战略资源储备。干细胞具有无限自我更新能力,将畜禽干细胞作为遗传资源的载体进行保存的做法已获得广泛认同。本实验建立了北京油鸡角膜缘干细胞和北京鸭角膜缘干细胞体外分离培养体系,对其生物学特性进行了鉴定。建立了小鼠角膜碱烧伤模型,探讨干细胞移植对于角膜碱烧伤的治疗效果。 1.分别以北京油鸡10胚龄胚胎和北京鸭14胚龄胚胎为实验材料,采用中性蛋白酶Ⅱ联合胰酶法消化分离北京油鸡和北京鸭胚胎角膜缘干细胞(Limbal stem cells,LSCs),在体外可培养至26代和24代。 2.北京油鸡和北京鸭LSCs通过免疫荧光鉴定细胞表面特异性标志物ABCG2、P63和CK19均表达阳性。分别提取北京油鸡和北京鸭LSCs细胞总RNA,通过RT-PCR检测特异性标志物基因P63(TPRG1L)、CK19(KRT19)、ABCG2均表达阳性,证明所分离的细胞为LSCs。 3.分别取P5、P10和P20代北京油鸡和北京鸭LSCs,绘制生长曲线,根据曲线计算群体倍增时间。生长曲线均为“S”型,随着代次的增加,细胞增殖能力下降,群体倍增时间增加。 4.在无血清培养基中培养划痕后的北京油鸡和北京鸭LSCs至0 h、6 h、12 h、18 h、24 h时在显微镜下拍照观察。北京油鸡和北京鸭LSCs划痕面积随时间变化逐渐变小,表明LSCs具有迁移能力。 5.对北京油鸡和北京鸭LSCs进行成骨诱导,诱导后出现钙结节,茜素红染色呈阳性,RT-PCR鉴定成骨细胞特异性标志物基因OPN和Col-1表达阳性。对北京油鸡和北京鸭LSCs进行成软骨诱导,阿利新蓝染色呈阳性,RT-PCR鉴定成软骨细胞特异性标志物基因SOX9和Col-2表达阳性。对北京油鸡和北京鸭LSCs进行成脂诱导,油红O染色呈阳性,可见红色脂滴,RT-PCR鉴定脂肪细胞特异性标志物基因LPL和PPAR-γ表达阳性。 6.建立NaOH溶液碱烧伤小鼠角膜的模型,损伤后立即结膜下注射0.1 m L含1x10～6个北京油鸡或北京鸭LSCs的细胞悬液。造模后第1天、3天、5天、7天、10天和14天通过HE染色切片观察角膜上皮组织细胞层、炎症细胞和新生血管生成情况,并检测血清中炎症因子TNF-α和IL-6含量。根据HE染色切片观察及血清学分析,治疗组与损伤组具有显著性的差异。 综上所述,本实验成功建立了北京油鸡角膜缘干细胞和北京鸭角膜缘干细胞体外分离培养体系,进行了生物学特性鉴定,并将培养的细胞用于角膜碱烧伤模型的治疗,角膜损伤得到了一定程度的恢复。为畜禽遗传资源的保存和利用提供了理论和实践基础,为干细胞疗法的推动做出了贡献。

关键词： NAT10   CDC6   DNA复制   前列腺癌   去势抵抗性前列腺癌(CRPC)  

摘要： 前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一。雄激素剥夺疗法(ADT)是前列腺癌患者的标准治疗方法,因为雄激素受体(AR)在前列腺的正常生长和发育以及前列腺癌中起着至关重要的作用。尽管有ADT,大多数肿瘤仍发展到一种侵袭性状态,称为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。有研究表明,AR和CDC6之间的相互作用参与了 DNA复制的启动,而非甾体抗雄激素药物Casodex可以解除AR和CDC6之间的相互作用,从而抑制DNA复制。DNA复制应激被认为是肿瘤形成的影响因素,因此,CRPC的发生与DNA复制机制可能有密切的关系。N-乙酰转移酶10(NAT10)是一种具有乙酰转移酶的核仁蛋白,参与组蛋白乙酰化、RNA胞苷乙酰如tRNA、18S rRNA、mRNA的乙酰化,以及细胞微管物的乙酰化,调节合成以及核结构和染色质结构、核仁转录活性、以及蛋白翻译多种活动。NAT10在多种癌症中呈现高表达状态。新近的研究表明,NAT10可以促进细胞周期进程,而NAT10基因的抑制和敲除则通过延长S期导致细胞周期停滞,提示NAT10可能参与肿瘤细胞DNA的复制合成。同时,NAT10特异性抑制剂Remodelin可以降低NAT10及其下游靶蛋白的表达,通过促进细胞凋亡、衰老、逆转上皮-间充质转化(EMT)和缺氧条件发挥抗癌作用。本研究以体外培养的AR阳性LNCaP、VCaP及AR阴性PC-3、DU145前列腺癌细胞系作为对象,研究NAT10表达对前列腺癌细胞生长、增殖、迁移、成瘤性的影响,分析NAT10与DNA复制的关系与机制,并探讨Remodelin对抑制CRPC的可能作用,主要研究方法和结果如下:1.抑制NAT10活性降低前列腺癌细胞的生物学活性:采用MTS细胞增殖实验、划痕实验、Transwell实验对体外培养的前列腺癌细胞进行研究。研究结果显示,无论通过Remodelin抑制NAT10活性还是通过shRNA干扰NAT10的表达,均可抑制细胞的体外生长、迁移与侵袭能力。Remodelin的作用具有时间和剂量依赖性;运用前列腺癌细胞进行的裸鼠成瘤实验结果显示,Remodelin低剂量组(2 mg/kg)与高剂量组(20 mg/kg)与对照组相比成瘤速度均有所降低,表明抑制NAT10活性降低肿瘤细胞在裸鼠体内的生长速度。TUNEL实验表明Remodelin在前列腺癌细胞无凋亡诱导作用。***10参与对DNA复制位点活化的调控:通过免疫荧光染色发现,抑制NAT10的活性会削弱DNA复制能力,减少DNA复制位点的激活。运用iPOND及CHIP的方法证明了 NAT10参与DNA的复制起始阶段,并且分布于复制位点的近端。CDC6是启动DNA复制所必需的蛋白,在复制的早期阶段起到调节作用。我们通过免疫荧光染色进行观察,发现抑制NAT10活性时,CDC6表达下调;相反,过表达NAT10时CDC6表达也随之上调。随后进一步运用Co-IP实验证明了 NAT10与CDC6存在直接的相互作用。提示NAT10通过与CDC6相互作用来调控复制前复合物的形成。此外,抑制NAT10的活性下调前列腺癌细胞中AR及PSA的表达水平。3.雄激素受体与NAT10在前列腺癌细胞中表达相关:免疫荧光和蛋白质印迹分析显示,对前列腺癌细胞进行体外雄激素处理或AR抵抗处理,AR阳性的前列腺癌细胞NAT10表达上调,而AR阴性的前列腺癌细胞NAT10未表现出明显变化。4.抑制NAT10降低体外诱导去势抵抗性前列腺癌细胞的活性:细胞增殖实验显示,Remodelin对ADT、DHT、恩杂鲁胺处理的细胞增殖活性均具有抑制作用。蛋白质印迹分析显示,恩杂鲁胺耐受及恩杂鲁胺抵抗的前列腺癌细胞NAT10表达上调,而抑制NAT10活性仍然可以降低恩杂鲁胺耐受或抵抗性前列腺癌细胞的增殖活性。***10与DNA复制因子之间的关系:TCGA数据库分析显示,NAT10与细胞增殖、DNA复制相关蛋白MKI67、CDC6以及MCM7的表达、前列腺癌细胞的增殖和分化、Gleason分级、淋巴结转移有关,提示NAT10表达可能通过促进细胞增殖而影响前列腺癌的演进。结论:研究表明,NAT10抑制剂Remodelin能有效抑制AR阳性和AR阴性前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。其作用机制可能涉及NAT10、CDC6相互作用直接参与DNA复制的起始调节。NAT10的表达受AR调节剂的影响,可能参与CRPC的发生,而Remodelin仍然可以有效地抑制去势抵抗性前列腺癌细胞的生长,表明NAT10是治疗CRPC的潜在靶点。

关键词： 鼻咽癌   WDHD1   增殖   凋亡   放射敏感性  

摘要： 目的和意义:鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)是原发于鼻咽部的一类具有高度侵袭性和转移性的恶性肿瘤,在我国华南地区高发。由于对电离辐射高度敏感,鼻咽癌首选放射治疗。不同个体对于放疗敏感性存在较大的差异,使得放疗抵抗成为鼻咽癌治疗失败的主要原因。因此,探索鼻咽癌放射抗性的分子机制对于提高鼻咽癌放射治疗效果乃至改善鼻咽癌患者预后至关重要。近年来,研究发现WD重复与HMG盒DNA结合蛋白1(WD repeat and HMG-box DNA binding protein 1,WDHD1)在多种肿瘤中表达上调,且其表达上调与肿瘤的发生、发展及预后有关,但在鼻咽癌中尚未见有报道。本文主要探讨WDHD1在鼻咽癌细胞中的表达对其生物学特性及放疗敏感性的影响。 方法:1、设计合成针对WDHD1基因的三条沉默序列及过表达序列,包装慢病毒,分别感染鼻咽癌细胞系CNE1和C666-1,建立稳定转染的细胞模型。2、经实时定量逆转录聚合酶链反应(quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,q RT-PCR)实验,验证沉默及过表达效率,并筛选出稳定细胞系,并用于后续实验。3、应用CCK8法测定WDHD1沉默及过表达对鼻咽癌细胞增殖能力的影响。4、应用细胞划痕实验、Transwell迁移实验和Transwell侵袭实验研究WDHD1沉默及过表达对鼻咽癌细胞迁移和侵袭能力的影响。5、应用流式细胞术Annexin VAF488/7-AAD双染料法、蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)检测凋亡蛋白Bax和Bcl-2的表达,评价WDHD1沉默及过表达对鼻咽癌细胞凋亡的影响。6、采用平板细胞克隆形成实验和CCK8法观察WDHD1沉默及过表达对不同放射剂量射线照射后细胞增殖的影响。 结果:1、成功构建含WDHD1基因沉默及过表达的慢病毒载体以及相应的阴性对照,感染鼻咽癌细胞系CNE1和C666-1,分别作为WDHD1沉默实验组(sh WDHD1)和阴性对照组(sh NC)、WDHD1过表达实验组(OE-WDHD1)和阴性对照组(OE-NC),未处理的细胞则作为空白对照组。2、q RT-PCR的结果显示CNE1和C666-1细胞沉默及过表达WDHD1的稳转细胞株均建立成功。3、CCK8实验结果显示,沉默WDHD1后,CNE1细胞48h后的细胞增殖能力显著降低,而C666-1细胞在24h后增殖率开始明显下降。相比之下,过表达WDHD1 48h后,CNE1和C666-1细胞的增殖能力均增加(P<0.05)。4、划痕实验结果显示,CNE1、CNE1/sh NC、CNE1/sh WDHD1、CNE1/OE-NC和CNE1/OE-WDHD1细胞在12h向划痕区域中央的相对迁移率分别为(32.640±5.205)%、(32.476±4.123)%、(10.634±2.825)%、(22.550±4.283)%和(41.163±8.298)%;C666-1、C666-1/sh NC、C666-1/sh WDHD1、C666-1/OE-NC和C666-1/OE-WDHD1细胞在12h向划痕区域中央的相对迁移率分别为(23.635±3.756)%、(20.267±5.679)%、(12.480±4.950)%、(20.974±1.901)%和(35.925±5.820)%。Transwell迁移和Transwell侵袭实验结果提示,WDHD1沉默的鼻咽癌细胞与其空载对照组和空白对照组相比,其穿膜细胞数明显下降,其侵袭和迁移能力明显受到抑制;WDHD1过表达的鼻咽癌细胞与其空载对照组和空白对照组相比,其穿膜细胞数明显增多,说明迁移与侵袭能力明显增强,差异均有统计学意义(P<0.05)。5、CNE1、CNE1/sh NC、CNE1/sh WDHD1、CNE1/OE-NC和CNE1/OE-WDHD1细胞的总凋亡率分别为(3.66±0.31)%、(4.43±0.25)%、(17.81±0.9)%、(4.52±0.26)%和(1.88±0.13)%;C666-1、C666-1/sh NC、C666-1/sh WDHD1、C666-1/OE-NC和C666-1/OE-WDHD1细胞的总凋亡率分别为(4.52±0.24)%、(3.75±0.23)%、(10.30±0.15)%、(4.51±0.28)%和(2.68±0.20)%。与各自对照组相比,差别有统计学意义。WB结果提示WDHD1沉默导致CNE1和C666-1细胞凋亡促进蛋白Bax的表达量增加,凋亡抑制蛋白Bcl2的表达量降低;而WDHD1过表达后,Bax的表达量降低,Bcl2的表达量增加。6、克隆形成实验单击多靶模型拟合的

关键词： CUL4A   食管鳞癌   表达   侵袭迁移增殖  

摘要： 目的初步探究CUL4A与食管鳞癌患者临床病理资料的相关性,随后通过si RNA转染技术降低CUL4A蛋白表达水平后分析其对TE-1细胞生物学特性的影响。方法1.收集符合标准的组织样本,采用实时荧光定量PCR以及免疫组织化学方法研究了116例原发性食管鳞状细胞癌(ESCC)组织标本中CUL4A的表达情况,并探讨其临床相关性和预后价值。2.通过siRNA介导的基因沉默技术转染TE-1细胞使得CUL4A表达下调,并运用免疫印迹法检测CUL4A蛋白表达水平,最后使用划痕实验、CCK-8、Transwell实验进一步评估其对TE-1细胞的迁移、增殖、侵袭的能力影响。结果***4A mRNA表达水平于正常食管组织、癌旁组织与食管鳞癌组织呈增高趋势,结果有明显差异(P<0.05)。此外,通过对比分析患者临床资料发现,CUL4A mRNA及其相应蛋白的表达与ESCC患者的性别、年龄、临床分期、分化程度、有无淋巴结转移无统计学差异,与肿瘤浸润深度和远端转移显著相关并有统计学差异(P<0.05)。CUL4A蛋白阳性表达的患者对比阴性表达患者预后更差(P<0.05)。2.体外实验发现,通过脂质体转染CUL4A-siRNA进入食管鳞癌TE-1细胞,经由Western blot实验提示转染CUL4A-si RNA后CUL4A蛋白表达明显减少(P<0.05)。划痕实验48小时后最终迁移距离CUL4A-si RNA组(116.4±9.1μm)相比于对照si-RNA组(201.7±21.2μm)和空白对照组(226.3±23.7μm)明显降低(P<0.05);Transwell实验结果提示CUL4A-si RNA组侵袭迁移个数(61±6.81)相较于对照si-RNA组侵袭迁移个数(143±11.36)和空白对照组(162±10.47)减少(P<0.05);CCK-8实验可见CUL4A-si RNA组增殖能力较另两组有明显减弱(P<0.05)。结论***4A表达水平与食管鳞癌患者临床病理资料密切相关且对预后评估有参考价值。2.体外实验表明,CUL4A表达下调可见食管鳞癌TE-1细胞增殖、侵袭、迁移受到抑制。***4A有作为食管鳞癌诊断肿瘤标志物、预后评估可用标志物的巨大潜力,并且有望成为食管鳞癌抗癌治疗靶点。