关键词：
慢性髓细胞白血病
DNA损伤检查点调节蛋白1
非同源末端连接修复
DNA双链断裂
摘要：
目的:伊马替尼（imatinib,IM）作为慢性髓细胞白血病（Chronic Myeloid Leukemia,CML）的一线治疗药物,在大部分患者中取得了良好的疗效,但仍有部分患者存在IM治疗无效的问题。研究发现,肿瘤的发生发展与DNA损伤修复关系密切。如在CML中,融合蛋白BCR-ABL的存在通过增加细胞内活性氧继而使DNA双链断裂（DNA double-strand breaks,DSBs）增加,细胞为应对过剩的DSBs,修复也随之增加。一般而言,肿瘤细胞存在修复缺陷,长此以往就加剧了基因组的不稳定性,可能导致耐药突变的发生、疾病进展甚至治疗后复发。因此,靶向不准确的DNA损伤修复为CML的治疗提供了新的思路。DNA损伤检查点蛋白1（mediator of DNA damage checkpoint 1,MDC1）,参与了DNA损伤早期响应以及随后细胞内修复信号转导。在多项实体瘤研究中均发现其异常高表达,靶向MDC1显示出良好的抗癌效果,而在CML中尚未见报道。鉴于MDC1可能作为肿瘤异常DNA损伤修复机制中重要的因子,且可能促进肿瘤发生发展,本研究拟首先检测MDC1在CML患者骨髓标本及细胞中的表达水平,再进一步探究靶向MDC1对CML细胞生物学效应的影响并初步探明相关机制。方法:1.探明MDC1在CML中的表达水平:利用RT-q PCR和Western blot分别检测CML细胞株和CML患者骨髓标本中MDC1的表达水平;利用慢病毒包装的sh RNA构建稳定敲低MDC1的CML细胞株,敲低效率通过RT-q PCR和Wes tern blot实验验证。2.敲低MDC1对CML的生物学效应影响和IM药敏性改变:通过克隆形成实验检测敲低MDC1后对CML细胞增殖能力的影响,利用流式细胞术（flow cytometry,FCM）对CML细胞凋亡率进行分析;同时敲低MDC1联合IM处理CML细胞,观察能否增强耐药细胞K562/G01对IM的敏感性;最后敲低MDC1与电离辐射（ionizing radiation,IR）联合处理,通过FCM检测细胞凋亡率。3.抗肿瘤效果与DNA损伤修复机制的关联:首先通过Western blot检测细胞经卡奇霉素（Calicheamicin-γ1,Cali）处理后MDC1的变化;然后通过免疫荧光实验（immunofluorescence assay,IF）检测γ-H2AX位点,及彗星实验检测DNA损伤尾距,观察敲低MDC1后细胞内损伤情况;Western blot实验检测γ-H2AX变化情况观察敲低MDC1后CML细胞的DNA修复能力变化;Co-IP及Western blot实验检测DSBs修复中,与MDC1互相作用的其它重要修复蛋白,同时验证MDC1活化是ATM激酶依赖性的;最后基于同源重组（Homologous recombination,HR）及非同源末端链接（non-homologous end joining,NHEJ）的两对报告质粒,通过建立报告细胞株,检测敲低MDC1后对不同修复途径的影响。结果:***1在CML患者骨髓标本（P＜0.05）和CML细胞系中均存在异常高表达（P＜0.01）;构建sh MDC1稳转株细胞敲低效果良好。2.在CML细胞中敲低MDC1后,细胞克隆数有一定程度的减少且集落明显变小,增殖受抑;细胞凋亡率明显增加。特别是在促进IM耐药的CML细胞的凋亡和提高药物敏感性中,效果尤其显著。3.敲低MDC1后细胞内DNA损伤明显增多,同时敲低组细胞处理损伤的能力下降,凋亡率显著提高;Co-IP实验说明MDC1在损伤早期与γ-H2AX、53BP1结合发挥功能;基于质粒报告实验显示敲低MDC1主要通过破坏细胞NHEJ修复途径,使细胞DNA损伤修复能力大大受损,最终导致细胞死亡。结论:综上所述,敲低MDC1主要通过抑制非同源末端连接修复途径,使CML细胞内损伤大量积累,导致细胞凋亡并提高IM耐药细胞对IM的敏感性。MDC1有望成为CML一个新的治疗靶点,同时证明了通过靶向不准确的DNA损伤修复以期达到抗肿瘤效果是可行的。
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