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关键词： 抗菌肽   Merecidin   肺癌   A549细胞   mTOR   MAPK1  

摘要： 目的研究Merecidin通过MAPK/ERK依赖的m TOR信号通路对非小细胞型肺癌A549细胞的增殖、迁移、侵袭、凋亡和周期生物学功能的影响。方法1.采用液相色谱-质谱联用检测Merecidin作用A549细胞后的磷酸化肽段,分析得到差异磷酸化蛋白和蛋白之间的互作关系,并鉴定以上差异较明显的蛋白磷酸化水平。2.采用Real-time PCR和Western-blot实验验证MAPK1敲低细胞株和MAPK1过表达细胞株的MAPK1的表达水平。3.采用CCK-8实验检测Merecidin和m TOR通路抑制剂Rapamycin作用于A549细胞空白组(Control)、MAPK1敲低组(KD)、MAPK1过表达组(OE)三组细胞细胞增殖情况。4.采用平板集落形成实验检测单独使用Merecidin和同时使用Rapamycin作用于A549细胞空白组(Control)、MAPK1敲低组(KD)、MAPK1过表达组(OE)细胞的集落形成情况。5.采用细胞划痕实验检测单独使用Merecidin和同时使用Rapamycin作用于A549细胞空白组(Control)、MAPK1敲低组(KD)、MAPK1过表达组(OE)细胞的迁移情况。6.采用Transwell实验检测单独使用Merecidin和同时使用Rapamycin作用于A549细胞空白组(Control)、MAPK1敲低组(KD)、MAPK1过表达组(OE)细胞的侵袭情况。7.采用流式细胞术检测单独使用Merecidin和同时使用Rapamycin作用于A549细胞空白组(Control)、MAPK1敲低组(KD)、MAPK1过表达组(OE)细胞的凋亡情况。8.采用流式细胞术检测单独使用Merecidin和同时使用Rapamycin作用于A549细胞空白组(Control)、MAPK1敲低组(KD)、MAPK1过表达组(OE)细胞的周期情况。9.采用Western-blot实验检测单独使用Merecidin和同时使用Rapamycin作用于A549细胞空白组(Control)、MAPK1敲低组(KD)、MAPK1过表达组(OE)细胞后MAPK/ERK依赖的m TOR信号通路的上下游蛋白表达水平变化。结果1.蛋白组学分析结果表明,使用Merecidin处理A549细胞后,m TOR、AKT1S1、EIF4EBP1、MAPK1等磷酸化蛋白表达下调,与上述蛋白涉及的信号通路主要有m TOR和MAPK/ERK等信号通路。***-time PCR和Western-blot实验结果表明肺癌A549细胞MAPK1敲低细胞株的MAPK1敲低效果良好,MAPK1过表达细胞株中MAPK1稳定过表达,可用于后续实验。***-8实验结果表明,Merecidin作用于三组细胞24h后,随着Merecidin浓度增加,三组细胞抑制率逐渐增加(P<0.05)。与空白组(Control)相比,MAPK1敲低组(KD)细胞抑制率明显增加,MAPK1过表达组(OE)细胞抑制率降低(P<0.05)。其中空白组(Control)、MAPK1敲低组(KD)、MAPK1过表达组(OE)细胞的IC50分别为11.08μmol/L、7.85μmol/L、15.56μmol/L。Rapamycin作用于三组细胞,细胞抑制率也存在浓度依赖性(P<0.05),与空白组(Control)相比,MAPK1敲低组(KD)细胞抑制率明显增加,MAPK1过表达组(OE)细胞抑制率降低(P<0.05),空白组(Control)、MAPK1敲低组(KD)、MAPK1过表达组(OE)细胞的IC50分别为17.72nmol/L、9.68nmol/L、30.86nmol/L。4.平板集落形成实验结果表明,未处理时与空白组(Control)细胞相比较,MAPK1敲低组(KD)细胞的集落形成数量减少,而MAPK1过表达组(OE)细胞的集落形成数量增加。Merecidin作用于三组细胞24h后,与相应细胞未处理组相比,细胞的集落形成数量均减少(P<0.05)。与单独加入Merecidin组相比,同时使用Rapamycin后,细胞集落形成数量减少,有统计学意义(P<0.05)。5.细胞划痕实验结果表明,未处理时与空白组(Control)细胞相比,MAPK1敲低组(KD)细胞的迁移率降低,而MAPK1过表达组(OE)细胞的迁移率升高。Merecidin作用于三组细胞24h后,与相应细胞未处理组相比,细胞的迁移率降低(P<0.05)。与单独加入Merecidin组相比,同时使用Rapamycin后,细胞的迁移率降低,有统计学意义(P<0.05)。***实验结果表明,未处理时与空白组(Control)细胞相比,MAPK1敲低组(KD)细胞的侵

关键词： 鼻咽癌   SARI   上皮间质转化   侵袭转移   机制  

摘要： 目的:1.探讨SARI(suppressor of AP-1,regulated by IFN)在鼻咽癌组织中的表达情况,分析SARI表达水平与鼻咽癌患者生存预后以及临床病理特征之间的相关性。2.明确SARI基因表达水平改变对鼻咽癌细胞生物学功能的影响。3.研究SARI表达改变对鼻咽癌细胞表型、上皮间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)相关分子标志物的影响,并探讨可能机制。方法:1.通过免疫组化技术检测SARI蛋白在鼻咽癌组织中的表达情况,分析SARI的表达水平与鼻咽癌临床病理特征的相关性以及在鼻咽癌预后评估中价值。2.构建SARI基因过表达和敲减慢病毒载体,将SARI过表达和敲减慢病毒分别感染鼻咽癌细胞CNE-2和SUNE-1,利用嘌呤霉素筛选稳转株,通过实时荧光定量PCR技术(Real Time-PCR,RT-PCR)和Western Blot检测SARI过表达和敲减效果。通过CCK-8生长曲线和平板克隆实验分析SARI表达改变对鼻咽癌细胞生长增殖的影响。划痕实验和Transwell小室实验研究SARI对鼻咽癌细胞侵袭转移能力的影响。3.观察过表达及敲减SARI对鼻咽癌细胞形态上的影响,Western Blot检测CNE-2和SUNE-1细胞中EMT相关分子标志物、侵袭相关蛋白TIMP1、TIMP2的改变情况,以及PI3K/AKT/GSK-3β信号通路蛋白分子的表达变化。结果:1.免疫组化结果显示,48.84%(63/129)鼻咽癌患者中SARI阳性表达,SARI主要表达于鼻咽癌细胞核中,SARI表达水平与鼻咽癌患者复发情况,临床分期呈负相关(P<0.05)。Kaplan-Meier生存曲线显示SARI高表达者预后较好(P=0.006)。SARI可作为鼻咽癌预后分析的一项良好指标。2.q RT-PCR结果显示,SARI m RNA在CNE-2细胞中相对表达水平最低,在SUNE-1细胞中表达水平相对较高,因此,将SARI过表达和敲减慢病毒分别感染CNE-2和SUNE-1细胞。经q RT-PCR和Western Blot验证,获得稳定过表达和敲减SARI的鼻咽癌细胞株。细胞功能学实验结果显示,SARI高表达抑制CNE-2的增殖和侵袭转移能力,相反敲减SARI,则促进SUNE-1的增殖侵袭和转移等恶性生物学行为。3.过表达SARI的CNE-2细胞形态上变圆,呈现上皮样细胞特性,且E-cadherin表达量显著增高,而N-cadherin和Vimentin表达量明显低于对照组。而敲减SARI的SUNE-1细胞形态上变为长梭形,呈现间质样细胞特性,同时细胞中E-cadherin表达量显著降低,而N-cadherin和Vimentin则高于对照组。同样,TIMP1和TIMP2蛋白在SARI高表达的CNE-2细胞中表达下降,而在SARI下调SUNE-1细胞中表达升高。通路蛋白结果显示,高表达SARI的CNE-2细胞中PI3K、AKT、GSK-3β表达量均下调,而敲减SARI的SUNE-1细胞中PI3K、AKT、GSK-3β蛋白表达水平上调。结论:***阳性表达的患者生存情况较好,SARI可以作为鼻咽癌患者预后独立的风险因素。***高表达能抑制鼻咽癌细胞CNE-2的增殖侵袭和转移能力,而SARI敲减可促进鼻咽癌细胞SUNE-1的侵袭转移等恶性生物学行为。***可以调控鼻咽癌细胞的EMT相关改变;SARI可能通过调控PI3K/AKT/GSK-3β信号通路参与鼻咽癌细胞侵袭转移进程。

关键词： 肺腺癌   lncRNA LRRC77P   细胞增殖   细胞迁移   细胞侵袭  

摘要： 背景:肺癌是目前全球性的健康问题之一,中国近年来,肺癌的发病率、死亡率都处于持续增长的状态,是对我国人民健康及生命安全威胁最大的恶性肿瘤之一,给社会也带来了极大的经济负担。肺癌的病理分型主要分为2大类,分为小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。其中,非小细胞肺癌最为常见,发病率占到所有肺癌类型的80%以上。因此,寻找快速的诊断方法以及早期的有效治疗,可给予临床诊疗带来极大获益。近些年来,长链非编码RNA(long-chain non-coding RNA,lncRNA)成为研究的一大热点。越来越多的研究结果表明,lncRNA参与基因的转录、染色质修饰等,在机体的多种生命活动、疾病的进展等均起到重要的调控作用。因此肺癌的分子学机制的研究,或许可给予临床诊疗提供一定的帮助。目的:观察lncRNALRRC77P在肺腺癌组织及癌旁组织、肺腺癌细胞系及正常肺泡上皮细胞中的表达差异,观察过表达lncRNA LRRC77P对肺腺癌增殖、细胞周期、迁移和侵袭行为的影响,通过生物信息学分析lncRNALRRC77P在肺腺癌细胞中的作用机制,为肺腺癌的生物靶向治疗提供一定实验依据。方法:实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测lncRNALRRC77P在67例肺腺癌组织及癌旁组织、5种肺腺癌细胞系(H1299、H1975、H1650、HCC827、A549)及正常肺泡上皮细胞(HPAEpiC)中的表达。利用阴性对照慢病毒和载有lncRNA LRRC77P序列的慢病毒分别感染lncRNA LRRC77P表达最少的肺腺癌细胞,命名为对照组和实验组。MTT法检测高表达lncRNALRRC77P对肺腺癌细胞增殖能力的影响。流式细胞术检测高表达lncRNA LRRC77P对肺腺癌细胞周期的影响。细胞划痕实验检测高表达lncRNA LRRC77P对肺腺癌细胞迁移能力的影响。Transwell小室侵袭实验检测高表达lncRNA LRRC77P对肺腺癌细胞侵袭能力的影响。生物信息学预测lncRNA LRRC77P可互补结合的靶miRNA及靶miRNA可互补结合的靶基因。qRT-PCR和Western blotting检测高表达lncRNA LRRC77P对靶miRNA和靶基因表达的影响。采用小干扰RNA(siRNA)干扰靶miRNA的表达。MTT法检测低表达靶miRNA对肺腺癌细胞增殖能力的影响。流式细胞术检测低表达靶miRNA对肺腺癌细胞周期的影响。细胞划痕实验检测低表达靶miRNA对肺腺癌细胞迁移能力的影响。Transwell小室侵袭实验检测低表达靶miRNA对肺腺癌细胞侵袭能力的影响。采用过表达质粒上调靶基因的表达。MTT法检测高表达靶基因对肺腺癌细胞增殖能力的影响。流式细胞术检测高表达靶基因对肺腺癌细胞周期的影响。细胞划痕实验检测高表达靶基因对肺腺癌细胞迁移能力的影响。Transwell小室侵袭实验检测高表达靶基因对肺腺癌细胞侵袭能力的影响。双荧光素酶报告基因验证LRRC77P互补结合靶miRNA及靶miRNA互补结合靶基因。结果:与癌旁组织相比,lncRNALRRC77P在肺腺癌组织中的表达明显降低。与正常肺泡上皮细胞(HPAEpiC)相比,lncRNA LRRC77P在5种肺腺癌细胞系(H1299、H1975、H1650、HCC827、A549)中的表达明显降低,lncRNALRRC77P在H1299细胞中的表达最少。高表达lncRNALRRC77P可显著抑制H1299细胞的增殖、细胞周期、迁移和侵袭能力。生物信息学预测lncRNA LRRC77P可互补结合 miR-182-5p,miR-182-5p 可互补结合原钙黏蛋白 10(Protocadherin 10,PCDH10)。高表达lncRNA LRRC77P可显著抑制H1299细胞中miR-182-5p的表达,促进PCDH10在mRNA和蛋白水平的表达。低表达miR-182-5p可显著抑制H1299细胞的增殖、细胞周期、迁移和侵袭能力。高表达PCDH10可显著抑制H1299细胞的增殖、细胞周期、迁移和侵袭能力。双荧光素酶报告基因证明LRRC77P可互补结合miR-182-5p,miR-182-5p可互补结合PCDH10。结论:lncRNA LRRC77P在肺腺癌组织和肺腺癌细胞系中低表达,高表达lncRNA LRRC77P可显著抑制肺腺癌H1299细胞的增殖、细胞周期、迁移和侵袭能力,其作用机制是lncRNA LRRC77P通过抑制miR-182-5p的表达,间接促进PCDH10基因的表达实现。

关键词： SUFU   乳腺癌   HIPPO   YAP   细胞生长  

摘要： 目的:目前乳腺癌仍是全球女性发病率最高的癌症,其发生发展与HIPPO通路密切相关,但乳腺癌中HIPPO通路的调控机制有待于深入研究。LATS1作为HIPPO通路中核心成员通过磷酸化YAP/TAZ,抑制下游靶基因转录进而发挥抑癌作用。Suppressor of fused homolog(SUFU)是Hedgehog(Hh)通路的重要组成部分,通过参与细胞内多种信号通路的调控进而控制肿瘤的发展进程。已报道SUFU在体外抑制乳腺癌细胞生长,但其作用机制不详。本研究通过探讨SUFU调控HIPPO通路的分子机制,阐明SUFU调控乳腺癌生长的作用机理,从而揭示了乳腺癌中HIPPO通路调控的新机制,为深入研究HIPPO通路在乳腺癌进展中的作用提供新的依据。方法:1.分析TCGA公共数据库中乳腺癌患者基因表达谱,比较低表达SUFU和高表达SUFU的乳腺癌患者生存率间差异。2.慢病毒构建稳定敲低、稳定过表达SUFU的乳腺癌细胞株。包括:HCC1954、MDA-MB-231、MCF-7、T47D、SK-BR-3,免疫印迹验证其敲低、过表达效率。***-8检测乳腺癌细胞敲低、过表达SUFU后生长活力的变化。4.建立荷瘤小鼠模型:裸鼠皮下接种对照组及敲低SUFU组MDA-MB-231细胞,观察并记录肿瘤生长情况。H&E染色、免疫组化实验检测敲低SUFU对肿瘤生长及相关蛋白表达的影响。5.转录组测序技术对稳定敲低SUFU和对照组HCC1954细胞以及稳定过表达SUFU和对照组SK-BR-3细胞进行全基因组测序,分别比较两组的信号通路和基因表达差异,并采用免疫印迹实验加以验证。6.蛋白免疫印迹检测SUFU及HIPPO通路相关蛋白表达。***荧光素酶报告基因实验检测SUFU对YAP转录活性影响。8.免疫荧光、核质分离实验检测SUFU对YAP出入核影响。9.免疫共沉淀检测SUFU与HIPPO通路关键组分蛋白的相互作用。10.免疫荧光检测SUFU与LATS1共定位。11.分子克隆实验构建SUFU野生型和区段缺失突变体质粒。结果:***与乳腺癌患者生存率相关分析根据TCGA公共数据库生物信息学结果显示,SUFU表达高低与乳腺癌患者生存率高低有关,SUFU低表达乳腺癌患者的生存率低于高表达的乳腺癌患者(p=0.0329),且在5年生存期时差异最显著。2.细胞模型构建通过对乳腺癌细胞中SUFU蛋白表达水平的检测,构建HCC1954、MDA-MB-231、MCF-7、T47D敲低SUFU以及MDA-MB-231、HCC1954、MCF-7、SK-BR-3过表达SUFU的乳腺癌细胞模型,免疫印迹验证细胞中SUFU敲低、过表达效率。***影响乳腺癌细胞的生长活力3.1过表达SUFU,抑制MDA-MB-231、HCC1954、MCF-7、SK-BR-3细胞生长活力。3.2敲低SUFU,促进MDA-MB-231、HCC1954、MCF-7细胞生长活力。4.体内实验检测SUFU对肿瘤生长影响裸鼠荷瘤模型显示:敲低SUFU显著促进肿瘤生长,经H&E染色、IHC检测,敲低SUFU显著上调Ki67表达。***抑制乳腺癌细胞生长活力的分子机制5.1 RNA seq表达谱测序结果显示SUFU与HIPPO通路密切相关,且敲低SUFU显著上调YAP下游基因AXL、ACSL4,过表达SUFU后显著下调YAP下游基因AXL、ACSL4,并通过免疫印迹实验得到验证。5.2敲低SUFU促进乳腺癌细胞YAP转录活性,过表达SUFU后抑制YAP转录活性。5.3敲低SUFU促进乳腺癌细胞YAP表达,促进YAP入核,过表达SUFU后抑制乳腺癌细胞YAP表达,抑制YAP入核。5.4敲低SUFU下调乳腺癌细胞P-LATS1/LATS1的比值,过表达SUFU后上调乳腺癌细胞P-LATS1/LATS1的比值。5.5敲低LATS1促进乳腺癌细胞AXL和ACSL4的表达,过表达SUFU后抑制AXL和ACSL4的表达,但在敲低LATS1细胞中再过表达SUFU后,SUFU不能抑制AXL和ACSL4的上调。5.6 SUFU与LATS1存在内源及外源的相互作用HEK293T细胞中过表达V5-SUFU、Myc-LATS1,免疫共沉淀结果显示SUFU与LATS1存在外源相互作用。在HCC1806细胞中检测到SUFU与LATS1存在内源相互作用。5.7 SUFU与LATS1共定位于细胞质MDA-MB-231和MCF-7细胞中外源过表达Flag-SUFU,Myc-LATS1,激光共聚焦结果显示SUFU与LATS1共定位于细胞质。5.8缺失174-385氨基酸区段,SUFU不能与LATS1相互作用,不能调控YAP出入核及下游靶基因转录。5.9 SUFU对乳腺癌细胞生长活力的调控依赖于YAP。结论

关键词： 激肽释放酶14   肺腺癌   细胞增殖  

摘要： [目的]本研究旨在探讨KLK14在宣威女性肺腺癌组织中的表达,验证其对肺腺癌细胞生物学功能的影响,预测其在肺腺癌中发挥生物学功能的可能机制。[方法]1、本研究收集经手术切除的宣威非吸烟女性肺腺癌病人肿瘤组织和配对正常肺组织35对,并利用免疫组化技术检测KLK14蛋白水平的表达,比较两组间蛋白表达差异。2、采用Western Blot技术检测并比较人肺腺癌细胞系A549、XWLC-05、H1299、H1734、H838、H1650、H1975、H2126、H23 和 H358 中 KLK14 蛋白表达水平,根据KLK14蛋白表达情况选取合适的两株细胞作为工具细胞。3、利用CRISPR/Cas9技术构建KLK14基因敲除细胞株,并通过慢病毒转染构建KLK14稳定过表达细胞株。4、采用CCK-8实验、Transwell侵袭和迁移实验、划痕实验、流式细胞学技术在细胞水平研究KLK14对肺腺癌细胞增殖能力、侵袭能力、迁移能力、细胞周期及凋亡的影响。5、对KLK14过表达细胞株进行转录组测序,筛选差异表达基因进行GO富集分析及KEGG信号通路富集分析,预测KLK14发挥生物学功能的可能机制。[结果]1、KLK14在宣威女性肺腺癌组织中的阳性率为31.4%(9/35),在配对正常肺组织中的阳性率为5.7%(2/35),差异具有统计学意义(P<0.05)。进一步的KLK14蛋白表达细胞定位显示KLK14蛋白弥漫性分布于宣威女性肺腺癌细胞的胞质和核周围区域。2、KLK14在肺腺癌细胞系中均有不同程度的表达,在H1299细胞中的表达水平最高,在A549细胞中的表达水平最低。3、设计的三条sgRNA均与载体质粒连接成功,CRISPR-Cas9敲除载体及KLK14过表达载体均通过慢病毒成功转染H1299细胞和A549细胞,Weastern blot检测KLK14蛋白水平的表达,H1299和A549敲除组KLK14表达水平均低于对照组,H1299和A549过表达组KLK14表达水平均低于对照组,KLK14基因敲除及过表达细胞株构建成功。4、KLK14过表达组较对照组细胞增殖能力明显增强(P<0.05);KLK14敲除组较对照组细胞增殖能力明显减弱;KLK14过表达组及敲除组较对照组细胞侵袭能力无明显变化(P>0.05);KLK14过表达组及敲除组较对照组细胞横向及纵向迁移能力均无明显变化((P>0.05));KLK14过表达组较对照组细胞S期比例增加,G1/G0期比例减少,KLK14敲除组较对照组细胞G1/G0期比例增加S期比例减少(P<0.05);KLK14过表达组较对照组早凋及晚凋细胞比例减少,KLK14敲除组较对照组早凋及晚凋细胞比例增多(P<0.05)。5、通过转录组测序筛选得到1186个差异表达基因,GO富集分析结果显示,差异表达基因主要富集在循环系统过程、花生四烯酸分泌、调节趋化作用、免疫反应的负调控等与肿瘤微环境相关的生物学过程。KEGG通路富集分析结果显示,差异表达基因显著富集在神经活性配体-受体信号通路和钙信号通路。[结论]KLK14在宣威非吸烟女性肺腺癌组织中异常表达,能够促进肺腺癌细胞增殖和进入分裂期,并抑制其凋亡;KLK14可能通过神经活性受体-配体信号通路和钙信号通路参与肿瘤微环境的调控,是其影响肺腺癌细胞恶性生物学行为的可能机制。

关键词： 胶质瘤   免疫球蛋白   靶向治疗   转移   增殖  

摘要： 胶质瘤是最常见和最具侵袭性的原发性中枢神经系统肿瘤,5年病死率和复发率较高,手术切除联合放、化疗的传统疗法和近年来以小分子化合物类药物、抗体药物为主的靶向治疗及免疫治疗均无法使患者生存期得到有效延长,亟需开发新的特异性的治疗靶点。已有研究证实上皮来源的肿瘤细胞通过分泌大量免疫球蛋白促进肿瘤细胞的增殖和转移,但肿瘤来源免疫球蛋白在胶质瘤中的作用尚无报道。本研究分析了胶质瘤来源免疫球蛋白对胶质瘤细胞的作用,探索了其中的分子机制,并通过裸鼠皮下荷瘤模型探讨了将IgG作为胶质瘤治疗靶点的可能性,拟揭示免疫球蛋白潜在的致病机制,为胶质瘤的治疗提供新的思路,目前获得了以下创新性发现。 为了探索免疫球蛋白在胶质瘤患者肿瘤组织中的表达及与患者预后之间的关系,本研究在GEPIA数据库中检索后发现胶质瘤组织在转录本水平表达IgG、IgM、IgA及Igκ、Igλ,进一步分析CGGA数据库发现年龄大、IDH未突变、1p/19q未缺失、WHO分级高、复发及预后不良的患者免疫球蛋白表达水平更高。为明确免疫球蛋白的表达,本研究通过免疫组织化学及免疫荧光的方法,在来源于胶质瘤患者的肿瘤组织及人胶质瘤细胞系U87、U251中检测到了IgG、IgM蛋白的表达。此外,通过蛋白质免疫印迹实验证实了U87及U251可表达IgG、IgM,且表达形式主要为分泌形式。 在确定胶质瘤肿瘤组织及细胞系中表达免疫球蛋白重链及轻链,且表达水平高与患者预后不良相关后,本研究进一步探讨胶质瘤来源免疫球蛋白对胶质瘤细胞增殖及迁移等生物学功能的影响。分别在U87、U251细胞系中通过小干扰RNA(si RNA)敲低IgG或CRISPR-Cas9敲除IgG,通过Western Blot检测培养上清中的IgG验证敲减或敲除效果。CCK-8、克隆形成及Ki-67流式细胞术结果显示IgG水平降低则抑制细胞的增殖能力;伤口愈合实验及Transwell实验结果表明IgG水平降低会抑制胶质瘤细胞的迁移能力。以上结果提示胶质瘤来源的免疫球蛋白促进胶质瘤细胞的增殖及迁移。 在明确了免疫球蛋白在胶质瘤中的表达及其所发挥的促肿瘤生物学功能之后,为探索免疫球蛋白促肿瘤的作用机制,本研究通过RNA-seq转录组分析以富集相关信号通路,应用Western Blot检测IgG水平下调之后通路中蛋白及其活化水平的变化。结果提示敲除IgG可通过HGF/SF-Met通路或FAK/Src通路来下调MAPK通路、PI3K/Akt通路中增殖、迁移相关蛋白的磷酸化水平。此外,本研究利用裸鼠皮下荷瘤模型证实了IgG水平降低对胶质瘤生长的抑制,并且对与细胞增殖、迁移相关蛋白的活化水平检测后发现其磷酸化水平受到了明显抑制。 综上所述,本课题发现胶质瘤的肿瘤组织及细胞系均可表达免疫球蛋白,表达水平高预示患者的预后不良。胶质瘤来源的IgG通过促进肿瘤细胞增殖和迁移参与胶质瘤发生发展的病理学过程,具体的分子机制可能是肿瘤细胞分泌的IgG与细胞表面的受体结合,激活HGF/SF-Met通路或FAK/Src通路,随后启动PI3K/Akt和ERK等相关通路的激活,导致肿瘤细胞增殖及迁移。本项目立足于胶质瘤细胞来源IgG发挥的促肿瘤作用,探讨了其中的分子机制和可能的应用转化,这为靶向肿瘤微环境中的IgG在胶质瘤免疫治疗中提供了新思路。

关键词： 结直肠癌   CPS1基因   细胞生物学功能   CyclinD1   细胞增殖  

摘要： 【目的】　　通过探讨CPS1基因在CRC组织中的表达情况及其与临床病理指标之间的关系，并在CRC细胞中敲低CPS1基因探讨其对CRC生物学功能的影响，以期为寻找CRC早期诊断或预后评估的生物标志物提供相关的实验基础及理论依据。　　【方法】　　1.选择33例正常人大肠粘膜组织、43例CRC组织、43例CRC癌旁组织、及28例大肠腺瘤组织并使用qRT-PCR的实验方法检测各组组织中CPS1mRNA的表达水平。　　2.将CPS1siRNA转染至SW480细胞株，用CCK8实验方法检测CPS1基因对CRC细胞增殖的影响;用流式细胞术实验方法检测CPS1基因对CRC细胞周期的影响;用流式细胞术实验方法检测CPS1基因对CRC细胞凋亡的影响;用Transwell的实验方法检测CPS1基因对CRC细胞迁移的影响;用Westernblot的实验方法检测CyclinD1蛋白的表达水平。　　【结果】　　***1mRNA在各组大肠组织中表达情况及与CRC患者临床病理指标的关系　　qRT-PCR结果显示：CRC组CPS1mRNA的表达最高，分别与CRC癌旁组及正常对照组相比较，差异均有统计学意义（P＜0.01，P＜0.01）;CRC组CPS1mRNA的表达水平高于大肠腺瘤组，但差异无统计学意义（P＞0.05）;大肠腺瘤组织中CPS1mRNA表达高于CRC癌旁组和正常对照组，差异均有统计学意义（P＜0.001，P＜0.001）;CRC癌旁组CPS1mRNA表达高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。　　收集研究对象的临床病理数据，应用Fisher检验进行相关性分析。结果显示：CPS1mRNA的表达量在不同的年龄、性别、肿瘤大小、分化程度、分期、是否有淋巴结转移及远处转移等方面，差异均无统计学意义（Pgt;0.05）。　　***1基因对SW480细胞生物学功能的影响　　转染CPS1siRNA至SW480细胞，与对照NCsiRNA组比较，结果显示：CPS1siRNA组细胞增殖率显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05);CPS1siRNA组细胞周期被明显阻滞于G0/G1期，差异有显著统计学意义(P＜0.001);CPS1siRNA组细胞凋亡率明显下降，迁移显著增加，差异均有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。　　***1基因对细胞周期蛋白CyclinD1的作用　　转染CPS1siRNA至SW480细胞，与对照NCsiRNA组相比较，Westernblot结果显示：CPS1siRNA转染组CyclinD1的蛋白的表达水平下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。　　【结论】　　CPS1基因在CRC组织中表达上调，能促进CRC细胞增殖及迁移，抑制CRC细胞凋亡，通过上调CRC细胞CyclinD1基因，促进细胞周期进程。CPS1基因可能与CRC发生、发展有关。

关键词： 银屑病   角质形成细胞   NRF2   角蛋白   干扰素-γ  

摘要： 背景和目的银屑病是一种常见的免疫介导性皮肤病,以皮肤出现鳞屑、红斑为主要特征,以炎症细胞浸润、角质细胞异常增殖和细胞因子异常分泌为主要病理表现。角质细胞是表皮的主要成分,人永生化角质细胞系HaCaT细胞是研究银屑病体外实验的常用细胞株,角质形成细胞的过度增殖是银屑病病变的关键标志。核因子红细胞2相关因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,NRF2）是细胞对氧化应激适应性反应的中心调节因子。在生理条件下,NRF2与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白（Kelch-like epichlorohydrin associated proteins,Keap1）相连,并被细胞质中的蛋白酶体降解。当细胞受到内外界刺激时,NRF2从Keap1中释放并转移至细胞核中与抗氧化反应元件（Antioxidant response element,ARE）结合,从而激活下游基因的转录。角蛋白（Keratins,KRT）是上皮细胞骨架的主要成分,负责维持角质形成细胞结构的稳定性和完整性。研究表明,NRF2在皮肤癌、鱼鳞病和银屑病等皮肤病的角质形成细胞中高表达,且IFN-γ、IL-17A和IL-22等T细胞来源的细胞因子能通过诱导NRF2的表达来调控角质形成细胞增殖相关的KRT6、KRT16和KRT17的表达。文献资料显示,多种细胞因子与银屑病的发生发展相关,如IL-17、IL-22、IL-23、TNF-α和IFN-γ等,其中IFN-γ起核心调节作用。但这些细胞因子调控角质形成细胞增殖和角蛋白表达的机制及与NRF2和NRF2下游分子表达的相关性,目前均未阐明。本研究通过HaCaT细胞培养,观察了TNF-α、IFN-γ、IL-17A和IL-6等炎症因子对NRF2及下游分子P63表达的影响,同时,对比分析了IFN-γ和NRF2感染对HaCaT细胞增殖和膜分子表达等生物学特性的影响。通过制作银屑病小鼠模型,观察NRF2激动剂和抑制剂对皮肤炎症及外周免疫器官T细胞亚群的影响,旨在进一步阐明NRF2在银屑病皮肤炎症中的作用机制,为改善银屑病临床治疗手段提供新的实验依据。方法***2在银屑病皮损部位的表达:通过基因表达综合（Gene Expression Omnibus,GEO）数据库中GSE41662和GSE34248数据集分别得到了24和14例银屑病病人皮损部位与非皮损部位m RNA表达水平资料,分析了NRF2在银屑病病人皮损处的表达;在C57BL/6小鼠剃毛背部连续5 d涂抹咪喹莫特（Imiquimod,IMQ）以建立银屑病小鼠模型,收集小鼠背部皮肤,通过q RT-PCR、WB和免疫组化检测小鼠背部皮损处NRF2的表达。2.银屑病相关炎症因子对HaCaT细胞NRF2表达的影响:分别用TNF-α、IFN-γ、IL-17A和IL-6等炎症因子预处理HaCaT细胞,q RT-PCR和WB分别检测NRF2和P63在m RNA和蛋白水平的表达。***-γ对HaCaT细胞ARE依赖基因、抗原提呈能力及角蛋白表达的影响:用0、10、30、50 ng/m L IFN-γ预处理HaCaT细胞（IFN-γ-HaCaT）24 h后,q RT-PCR检测NQO1、HO-1、GCLC、G6PD、HLA-DRA、HLA-DRB、ICAM-1、PDL-1及KRT1、KRT6和KRT17的m RNA表达,WB检测KRT1、KRT6和KRT17蛋白水平表达。4.过表达NRF2的HaCaT细胞稳转株的构建及鉴定:过表达NRF2慢病毒感染HaCaT细胞（LV-NRF2）,通过荧光显微镜观察、流式细胞术鉴定荧光强度,q RT-PCR和WB分别检测NRF2在m RNA和蛋白水平的表达。***-NRF2对HaCaT细胞ARE依赖基因、抗原提呈能力及角蛋白表达的影响:经嘌呤霉素筛选的慢病毒感染HaCaT细胞稳转株,q RT-PCR检测NQO1、HO-1、GCLC、G6PD、HLA-DRA、HLA-DRB、ICAM-1、PDL-1及KRT1、KRT6和KRT17的表达,WB检测KRT1、KRT6和KRT17蛋白水平表达。***-NRF2和IFN-γ预处理对HaCaT细胞增殖的影响:将两种处理的细胞分别贴壁培养24 h后,通过CCK-8和Ed U检测细胞的增殖情况。***-γ对LV-NRF2感染的HaCaT细胞NRF2、P63及KRT1、KRT6和KRT17表达的影响:将30 ng/m L IFN-γ刺激LV-NRF2细胞24 h后,通过q RT-PCR检测NRF2、P63及KRT1、KRT6、KRT17的表达。***2激动剂t BHQ和抑制剂ML385对银屑病小鼠皮肤炎症的影响:将C57BL/6小鼠随机分为以下四组:Control组、I

关键词： 蜂毒素   胶质瘤   F2RL1   生物学功能  

摘要： 一、研究目的1.观察蜂毒素对胶质瘤细胞增殖、细胞周期、凋亡、侵袭及迁移的影响。2.探索F2RL1在蜂毒素抑制胶质瘤细胞生物学功能中的作用机制。二、研究方法1.体外培养人胶质瘤细胞U251,检测蜂毒素对细胞增殖、细胞周期、凋亡、侵袭及迁移的影响,并检测蜂毒素对相关目的基因及蛋白表达的影响。2.构建慢病毒干扰F2RL1的胶质瘤细胞,观察蜂毒素联合慢病毒干扰F2RL1对胶质瘤细胞生物学功能的影响。三、研究结果1.蜂毒素处理组胶质瘤细胞增殖活性降低、凋亡增加、侵袭及迁移数量减少,与空白对照组相比具有统计学差异。蜂毒素对胶质瘤细胞周期、侵袭及迁移等相关分子基因及蛋白水平的表达具有显著抑制作用。2.相对于对照慢病毒+PBS组,F2RL1干扰慢病毒+PBS组、对照慢病毒+蜂毒素组及F2RL1干扰慢病毒+蜂毒素组的细胞增殖降低、凋亡增加、侵袭及迁移数量减少,且F2RL1干扰慢病毒+蜂毒素组对胶质瘤的抑制作用更强。四、研究结论1.证实蜂毒素对胶质瘤细胞U251的生物学功能如增殖、侵袭及迁移有明确的抑制作用。2.蜂毒素通过下调基因F2RL1抑制胶质瘤细胞U251的增殖、侵袭及迁移等生物学功能。

关键词： 急性髓系白血病   ADP核糖基化因子6   基因敲除   增殖  

摘要： 背景和目的:急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是一种异质性极高的恶性血液肿瘤,有分化受阻和髓系前体克隆扩增失控等特征。AML的5年相对存活率仅为27.4%,其中40%～50%的患者中都有愈后复发现象。约10%的AML患者带有MLL融合基因,其中MLL-AF9融合类型白血病出现的比例高达34%。目前,MLL-AF9诱导的AML仍无靶向药物,常规化疗和骨髓移植后极易出现复发,很少有患者能够完全治愈。靶向治疗一直以来是AML研究的热点和方向,然而我们对AML的发病机制和潜在的治疗靶点仍知之甚少,因此阐明AML的发病机制和发现新的药物靶点对未来AML的诊疗具有重要意义。ARF6是ADP核糖基化因子（ADP-ribosylation factor,ARF）家族的成员之一,分子量约为20k D,定位于质膜、胞浆和内体膜上。研究发现,ARF6调节多种细胞功能,如肌动蛋白细胞骨架重塑、胞外分泌、胞膜循环、细胞分裂、膜脂代谢、微囊转运和释放等。ARF6被证实在肿瘤的增殖、迁移和侵袭过程中具有重要功能。课题组前期发现ARF6具有促进慢性髓系白血病细胞增殖和降低其对化疗药物敏感性的生物学功能,为了明确ARF6在AML中是否也具有相似的生物学效应,本研究以Arf6敲除的小鼠的AML细胞和Arf6敲低的人THP-1细胞为研究对象,运用分子生物学和细胞生物学等方法,阐明ARF6在MLL-AF9型AML（以下简称MA-AML）中的生物学功能,最终为靶向AML的药物开发和临床治疗提供新的思路和候选靶点。方法:1.通过流式细胞分析技术,分别提取Vav-icre-Lox P基因敲除系统诱导敲除Arf6的Vav-i Cre+Arf6loxp/loxp实验组小鼠和野生型（wild type,WT）对照组小鼠的骨髓脾脏细胞,检测体内敲除Arf6基因对小鼠骨髓和脾脏中造血干/祖细胞（HSPCs）的功能影响,初步评价ARF6在小鼠造血系统中的功能。2.包被MLL-AF9逆转录病毒,荧光显微镜观察并检测转染效率,用于细胞侵染小鼠CD117+细胞,构建MLL-AF9诱导的小鼠急性髓系前白血病细胞系（MA-pre-LC）,简称MA细胞系。3.用细胞侵染和流式分选法构建两类细胞系:（1）小鼠MA细胞系,包括敲除Arf6的实验组MA-Vav-icre+-pre-LC细胞系,以及对照组MA-WT-pre-LC细胞系;（2）人急性单核白血病THP-1细胞系（带有MLL-AF9融合基因）,包括用短发夹RNA（sh RNA）慢病毒诱导的敲低Arf6的实验组ARF6-sh RNA细胞系,以及对照组NC-sh RNA细胞系;流式分选技术筛选表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP+）细胞,用q PCR方法鉴定细胞系,检测实验组Arf6基因敲除情况。4.通过一系列细胞功能性实验,如增殖实验、克隆形成实验、细胞周期检测、细胞迁移实验、凋亡耐药实验和吉姆萨染色实验,明确ARF6在MLL-AF9诱导的AML细胞中的功能。5.通过Western blot、PCR和q PCR等分子生物学方法检测相关基因、蛋白激酶B（protein kinase B,AKT）和细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）的蛋白表达水平,探究ARF6参与的信号通路或调控的基因表达。结果:1.流式细胞术分析结果显示:造血细胞特异性敲除Arf6基因可能影响了脾脏中HSPCs向骨髓的迁移;与WT小鼠相比,Arf6敲除小鼠骨髓中T细胞所占比例明显升高,脾脏中B细胞百分数有所下降。***-AF9病毒包被的荧光显微镜检测结果显示:细胞绿色荧光强度较高,GFP+效率达80%以上。3.流式细胞术分选细胞系结果显示:（1）小鼠MA细胞系纯度100%。（2）THP-1细胞系纯度99%。q PCR结果显示,实验组Arf6基因表达明显被抑制。4.细胞功能实验:（1）细胞体外生长曲线显示:与对照组相比,MA-Vav-icre+-pre-LC细胞数量明显降低,仅为对照组MA-WT-pre-LC的38.5%;敲低Arf6的THP-1细胞ARF6-sh RNA数量也明显减少,是对照组NC-sh RNA的66.7%。（2）细胞克隆形成结果显示:Arf6基因的敲除降低了MA细胞的克隆形成能力,实验组MA-Vav-icre+-pre-LC的一代克隆数明显降低,是对照组MA-WT-pre-LC的52.6%,MA-Vav-icre+-pre-LC组二代克隆数仅为对照组MA-WT-pre-LC的45%;同样敲低Arf6基因也降低了THP-1细胞的克隆形成能力,ARF6-sh RNA组的一代克隆数是对照组NC-sh RNA的71.4%,