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关键词： 21岁高龄猪   成纤维细胞   细胞生物学特性   体细胞核移植  

摘要： 从多莉羊诞生至今体细胞核移植(Somatic Cell Nuclear Transfer)技术已走过27年的历史,因其能将体细胞重编程为全能状态而备受关注。濒死老年动物成纤维细胞和新生动物成纤维细胞有何不同?两类细胞重编程效率如何?使用极度衰老的动物成纤维细胞能否成功克隆出后代?因此,本研究将探索随着个体年龄的增长,个体衰老与细胞表型、细胞增殖、细胞衰老、细胞凋亡、胚胎发育等有无必然联系,并为体细胞核移植技术在濒危动物遗传资源保护及“复活”中的应用奠定理论依据。本研究使用21岁高龄公猪为主要研究对象,3日龄、2岁龄的滇南小耳猪为对照。通过观察细胞表型、绘制生长曲线、检测细胞衰老和凋亡,并进行核移植胚胎体外培养和胚胎移植体内实验,多方面评估衰老个体细胞与新生个体细胞的差异。三种细胞的生长曲线呈典型的S型,21岁高龄猪耳成纤维细胞生长最快、数量最多、活性最好,与2岁龄、3日龄猪耳成纤维细胞数量相比差异显著,3日龄猪成纤维细胞增殖最慢且与2岁龄猪耳成纤维细胞相比差异显著。3日龄猪耳成纤维细胞衰老率(24.1%±11.8%)显著高于21岁高龄猪耳成纤维细胞衰老率(15.5%±8.1%,p<0.05),并高于2岁龄猪(17.8%±10.3%)但二者间无显著性差异(p>0.05)。21岁高龄猪耳成纤维细胞凋亡率(5.3%±0.4%)显著低于3日龄猪(6.2%±0.7%)和2岁龄猪(7.4%±2.5%,p<0.05)。凋亡水平最高发生在2岁龄猪耳成纤维细胞。3日龄猪耳成纤维细胞构建的1027个克隆胚胎卵裂率为74.6%±11.3%,囊胚率为22.4%±7.8%。21岁高龄猪耳成纤维细胞构建克隆胚胎999个,卵裂率为70.2%±15.2%,囊胚率为21.1%±9.3%,两组细胞卵裂率和囊胚率均无显著性差异(p>0.05)。21岁高龄猪耳成纤维细胞克隆胚胎囊胚细胞数(42.1±21.0)显著高于3日龄猪(32.8±11.6,p<0.05),表明21岁高龄猪耳成纤维细胞克隆囊胚质量好于3日龄新生猪。两组克隆胚胎随机均等分配合并移植进入7头代孕母猪体内,其中3头妊娠、获得克隆仔猪12头。经过DNA微卫星分析鉴定,3日龄猪耳成纤维细胞克隆猪4头,21岁高龄猪耳成纤维细胞克隆猪8头。21岁高龄、3日龄猪及其各自克隆后代耳成纤维细胞端粒酶活性水平无显著性差异。本研究通过建立21岁高龄猪和3日龄、2岁龄猪耳成纤维细胞系,对比三种细胞生长状况、衰老和凋亡,并进行核移植研究。发现21岁高龄猪细胞在生长状况、衰老、凋亡等并不比新生3日龄猪细胞差。在核移植胚胎体外发育方面也没有显著性差异,但通过胚胎移植成功获得了更多的21岁高龄猪耳成纤维细胞克隆后代,表明使用21岁高龄猪成纤维细胞可以通过体细胞核移植技术将其再度“复活”,为体细胞核移植技术在濒危动物遗传资源保护中的应用奠定基础。

关键词： GDM   血管功能障碍   PDGFRβ   PI3K/Akt通路  

摘要： 目的:妊娠期糖尿病(Gestational Diabetes Mellitus,GDM)是指妊娠过程中发生的不同程度的糖代谢异常,但血糖尚未达到显性糖尿病的水平。妊娠期间的血糖增高,密切影响着妊娠过程,其中GDM孕妇血管内皮功能障碍可能是母婴不良结局的潜在原因,但目前其具体的发病机制暂不明确。本研究采用对GDM患者胎盘组织进行高通量测序,后应用生物信息学分析GDM中的差异表达基因,并通过实验进行验证,对其发挥作用的机制进行探索。方法:通过对GDM患者胎盘组织进行高通量转录组测序,然后进行生物信息学分析,寻找GDM中与血管功能障碍相关的差异表达基因,进一步扩大样本量在胎盘组织中进行差异基因表达情况的验证。然后,在体外培养了人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC),并将它们分为三组:对照组、高糖组和高糖转染组。CCK8法检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡情况;划痕法检测细胞迁移能力;小管形成实验检测细胞成管能力;再探索其与PI3K/Akt的关系。结果:通过对GDM胎盘组织的转录组测序,共筛选出213个差异表达基因,上调的有120个,下调的有93个,经过我们对文献的查询选择与血管内皮功能相关的PDGFRβ作为关键基因进行下一步分析。在临床样本胎盘组织中验证发现,PDGFRβ的m RNA与蛋白表达水平在GDM孕妇中远高于正常孕妇(P<0.05),胎盘组织免疫荧光双染发现PDGFRβ在胎盘上在血管上和血管周围分布。在细胞高糖模型中验证了PDGFRβ的m RNA表达水平升高,PDGFRβ蛋白表达水平升高(P<0.05)。在高糖HUVEC模型中敲低PDGFRβ后,细胞活力有所恢复,迁移能力恢复,凋亡情况有所减少,成管能力降低(P<0.05)。同时phos-PI3K/PI3K水平与phos-Akt/Akt水平均降低(P<0.05)。结论:PDGFRβ的表达水平在GDM孕妇的胎盘中升高,其在胎盘中于血管上和血管周围分布。在高糖HUVEC模型中m RNA升高,蛋白表达升高,敲低PDGFRβ后,可以恢复细胞活力和迁移能力,改善凋亡情况,降低成管能力,使PI3K/Akt的活性降低。PDGFRβ可能参与了GDM中血管功能障碍的过程。

关键词： 核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2(NOD2)   受体相互作用丝氨酸/苏氨酸激酶2(RIPK2)   肺癌   组学   IL6-JAK-STAT3  

摘要： 目的: 慢性炎症在肿瘤发生中发挥重要作用,已有研究显示模式识别受体NOD2及其下游信号分子RIPK2在肺癌中发生了基因突变和表达变化,我们前期研究也显示NOD2-RIPK2通路对肺癌发生发展有正向调节作用,但其分子机制尚不清楚。本课题采用转录组学、蛋白质组学和代谢组学技术的多组学联合分析技术,观察NOD2-RIPK2过表达和基因敲除对肺癌细胞mRNA、蛋白和代谢物水平的影响并进行数据分析,拟在整体上了解NOD2-RIPK2对肺癌发展的调控机制,并筛选可能的潜在信号通路和蛋白标靶。 方法: 1.在A549细胞中通过脂转的方式构建NOD2和RIPK2过表达细胞模型; 2.采用CRISPR-Cas9基因编辑技术在A549细胞中敲除NOD2和RIPK2; 3.采用基因组测序和Western Blot方法验证敲除组细胞模型,RT-qPCR和Western Blot方法验证过表达细胞模型; 4.采用二代测序技术分析NOD2、RIPK2过表达组和敲除组mRNA的差异; 5.采用TMT定量蛋白质组学技术分析NOD2、RIPK2过表达组和敲除组蛋白质表达差异; 6.将各比较组差异基因和差异蛋白进行亚细胞定位分析、GO和KEGG富集分析; 7.采用RT-qPCR和Western Blot方法验证筛选到的差异基因和蛋白; 8.整合转录组和蛋白质组数据进行GSEA分析,探讨NOD2-RIPK2下游调控信号通路; 9.采用RT-qPCR和Western Blot方法验证筛选到的信号通路; 10.采用高分辨非靶向代谢组学技术分析NOD2、RIPK2过表达组和敲除组代谢物的差异; 11.筛选各比较组差异代谢物,并进行KEGG通路分析; 12.整合三组学数据进行KEGG通路富集比较分析。 结果: 1.基因测序、RT-qPCR和Western Blot都显示,我们成功在A549细胞中构建了NOD2-OE、RIPK2-OE、NOD2-KO和RIPK2-KO模型; 2.转录组GO功能富集分析发现,过表达组和敲除组差异表达>2.0倍的基因,主要聚类在生物和细胞黏附、细胞信号受体结合、金属离子和跨膜受体结合、天然免疫应答、细胞因子和趋化因子活性等条目; 3.转录组KEGG通路富集分析发现,过表达组和敲除组差异表达>2.0倍的基因主要富集在细胞外基质受体相互作用、癌症通路、黏着斑、细胞因子-细胞因子受体相互作用、模式识别受体、趋化因子、病毒与细菌感染等信号通路; 4.蛋白组亚细胞定位分析发现过表达组和敲除组的差异表达>1.2倍的蛋白都主要聚集在细胞核; 5.蛋白组GO功能富集分析发现,过表达组和敲除组差异表达>1.2倍的蛋白,主要聚类在先天免疫反应、对外部刺激、压力的防御反应、抗原处理相关转运体结合、细胞信号受体活性、肽酶活性调节、细胞外基质与细胞外空间、生物和细胞黏附、细胞运动、上皮细胞分化、细胞骨架蛋白结合、调节吞噬、炎症反应等条目; 6.蛋白组KEGG通路富集分析发现过表达组和敲除组差异表达>1.2倍的蛋白主要富集的通路有补体与凝血级联、PPAR、细胞黏附、癌症相关通路等; 7.我们筛选了AQP3、SPDEF、FZD8、PDK4、CPS1、SLPI、FST、SERPINE1、PMEPA1、CXCL1、MUC5B、SMOC1、ID4、GPC6、RTN4RL2、CHRDL2这16个差异表达基因进行RT-qPCR验证,结果与转录组学结果一致,说明转录组学结果真实可靠; 8.我们又筛选了ALB、COTL1、ALDH3A1、IFIT3、KRT19这5个差异表达蛋白进行Western Blot验证,结果与蛋白质组学结果一致,说明蛋白质组学结果真实可靠; ***分析发现,IL6-JAK-STAT3和上皮间质转化(EMT)这两个基因集都表现出在NOD2-OE和RIPK2-OE细胞中整体上调,而在NOD2-KO和RIPK2-KO细胞中整体下调; ***-qPCR证明了IL6-JAK-STAT3通路中的关键基因如IL-6、IL-6R、JAK1、JAK2、STAT3在过表达组都有明显上调;而在敲除组中,这些关键基因都有明显的下调; *** Blot结果显示STAT3以及与炎症相关的一些蛋白,如P38 MAPK、P44/42MAPK、SRC等在过表达组中显著上调,在敲除组中显著下调;一些与增殖密切相关的蛋白,如AKT、Cyclin D1、Cyclin D3等蛋白,在过表达组中显著上调,在敲除组中显著下调; 12.代谢组学KEGG分析显示癌症中心碳代谢、蛋白质消化吸收、ABC转运体、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢等代谢途径与NOD2-RIPK2调节肺癌细胞代谢的机制关系密切; 13.转录组学、蛋白质组学、代谢组学

关键词： 小麦   黑麦   FISH   异染色体系   抗病性   遗传多样性  

摘要： 小麦(Triticum aestivum L.,AABBDD,2n=6x=42)作为世界上最重要的粮食作物之一,是人类主要的食物来源,为人类提供约20%的蛋白质和热量。黑麦(Secale cereale L.,RR,2n=2x=14)作为小麦的三级基因资源,是小麦的近源物种之一,携带有大量的有用基因。远缘杂交可以使不同种属之间的优良性状结合,扩大遗传变异,创制优良杂种后代。因此,为了弥补传统杂交育种中遗传资源不足的缺陷,利用远缘杂交技术将黑麦所携带的优势基因导入到普通小麦中,是提高小麦育种水平的有效育种途径之一。由于目前广泛推广的小麦品种大多为小麦-黑麦T1RS.1BL易位系,并且黑麦亲本几乎均为Petkus,来源单一,缺乏遗传多样性,因此随着病原菌新的生理小种的出现,T1RS.1BL易位系抗病基因的抗性逐渐减弱甚至丧失。为了对普通小麦品种进行改良,增加小麦的遗传多样性,本研究探究了不同黑麦间的亲缘关系,继续创制并鉴定黑麦来源不同的新小麦-黑麦易位系,并对它们的细胞遗传学特性及农艺性状、抗病性等性状进行了研究,进而为黑麦及小麦育种工程提供更多优良的种质资源和理论基础。本研究最终获得以下结果:1.对包括已测序的威宁黑麦在内的15种野生黑麦、杂草黑麦及栽培黑麦进行细胞学鉴定及探针信号位点及强度的聚类分析,结果表明,5种重复序列在这15种黑麦中75%的位点上并没有表现出很高的多态性,即变异率未超过60%,说明这些位点所处的染色体区段有着较为保守的序列,较为稳定,不会轻易发生变化;同时,还存在25%的位点上表现出较高的多态性,这些位点几乎都位于染色体的端部或亚端部,说明端部和亚端部有较大的变异。该结果可以初步揭示不同黑麦品种染色体区段的不同以及不同黑麦之间的亲缘关系;除此之外,证明了黑麦内部较高的遗传多样性,这为未来的黑麦育种以及进一步利用不同黑麦作为亲本进而培育新的优良小麦-黑麦易位系材料的应用提供了理论基础。2.在秦岭黑麦与川农25的杂交后代中,鉴定得到了3个6RS双端体附加系、3个6RL双端体附加系、2个6R纯合二体附加系及1个T6RS.6AL易位系117-6。对这些材料进行了条锈病及白粉病的抗性鉴定,结果发现这些材料均表现为高抗。与小麦亲本CN25相比,117-6的产量显著增高,实验证明在6R染色体上存在可以利用的抗病基因和增产因子,是小麦遗传改良的重要遗传资源。而这些新品系可作为小麦抗病高产遗传改良的桥梁亲本和育种资源。3.在白粒黑麦和绵阳11的杂交后代中,鉴定得到了一个T7BS.7RL易位系RT14-245。抗病性鉴定结果显示,RT14-245高抗条锈病、白粉病和赤霉病且抗病基因应位于7RL染色体臂上。RT14-245是一个抗病育种潜在的优良种质资源。4.为了对其7RL染色体臂上的抗病基因进行进一步的应用及对抗病基因进行初步定位,对RT14-245进行了辐射处理。在M及M中鉴定得到了7RL端部明显变小的T7BS.7RL缺失系、同时含有7BS.7RL-7DS和7RL-7DS.7DL的易位系以及只含有7RL-7DS.7DL的小片段易位系这3类纯合材料,有些材料还发生了小麦3B/4B易位。对纯合变异体进行了田间成株期的条锈病抗性鉴定,结果发现相对于辐射亲本,部分材料的条锈病抗性减弱。说明可能在辐射过程中染色体结构的变异,导致了抗病性的变化。这些新材料为7RL上抗条锈病基因的定位奠定了物质基础。5.为了确认白粒黑麦7RL染色体臂的导入对株高的影响,对RT14-245和M进行了株高及穗颈长的测定及分析。结果表明,7RL的导入显著增高了株高及穗颈长,并且株高和穗颈长呈极显著相关。6.对秦岭黑麦、威宁黑麦、***及***分别与川农25及川农27的杂交后代进行了鉴定,得到了不同黑麦来源的新的小麦-黑麦易位系,包括T1RS.1BL、T1RS.1AL、T6RS.6AL等纯合易位系材料,以及大量涉及1R-7R的杂合异染色体系。本研究将秦岭黑麦和威宁黑麦基因导入到小麦中,对中国本土黑麦资源进行了充分发掘和利用;将***和***的基因导入到小麦中,成功的实现了杂草黑麦基因的成功转移。除此之外,还从染色体层面及田间调查证明了抗病基因的遗传多样性。这些含有不同黑麦染色质的新型种质资源为将来的小麦抗病、高产育种提供了重要的育种材料。

关键词： 长链非编码RNA,NONHSAT070341   宫颈癌   增殖   迁移   侵袭  

摘要： 目的:1.研究长链非编码RNA(long noncoding RNA,LncRNA)NONHSAT070341在宫颈癌组织及HPV16阳性宫颈癌细胞系SiHa和Caski中的表达。2.对SiHa、Caski分别进行NONHSAT070341 siRNA敲降或质粒过表达干预,观察其对宫颈癌细胞生物学功能包括增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响。3.对SiHa、Caski分别进行NONHSAT070341 siRNA敲降或质粒过表达干预,检测HPV16 E7、pRb mRNA在宫颈癌细胞中的表达变化,探究NONHSAT070341在宫颈癌中的可能作用机制。方法:1.选择2021年6月-2022年6月就诊于山西医科大学第二医院妇产科行HPV分型检测显示为单纯HPV16阳性、经阴道镜检查且病理学确诊的处于不同宫颈病变阶段的患者包括低度鳞状上皮内病变(Low-grade Squamous Intraepithelial Lesion,LSIL)、高度鳞状上皮内病变(High-grade Squamous Intraepithelial Lesion,HSIL)和宫颈鳞癌,每组各30例,以HPV16阳性的正常宫颈组织作为对照,通过实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测不同宫颈组织中LncRNA NONHSAT070341的表达情况,分别检测SiHa、Caski和人永生化表皮细胞HaCaT中NONHSAT070341的表达情况。2.在SiHa、Caski细胞中瞬时转染三条小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)片段建立低表达NONHSAT070341细胞株(si-NONHSAT070341组),以转染siRNA的阴性对照作为对照组(si-NC组);瞬时转染过表达质粒至SiHa、Caski细胞中建立过表达NONHSAT070341细胞株(pEX-3-NONHSAT070341组),以转染pEX-3空载体为对照组(pEX-3-vector组)。采用RT-qPCR技术验证转染效率。3.转染si-NONHSAT070341及pEX-3-NONHSAT070341后,通过CCK8检测细胞增殖能力;平板克隆形成实验观察细胞集落形成能力;细胞周期实验测定SiHa、Caski细胞在各周期分布的比例;Wound-Healing实验评估细胞横向迁移能力;Transwell实验测定细胞纵向迁移及侵袭能力;采用流式细胞术分析细胞凋亡情况同时Western blot检测细胞凋亡关键蛋白Caspase3的表达情况。4.采用RT-qPCR检测高、低表达NONHSAT070341后HPV16 E7 mRNA及pRb mRNA的表达情况。结果:1.与HPV16阳性的正常宫颈组织相比,HSIL和宫颈癌组织中NONHSAT070341的相对表达量增加。与人永生化表皮细胞HaCaT比较,SiHa和Caski中NONHSAT070341的表达水平均显著升高。***-qPCR结果证实,三条NONHSAT070341 siRNA均可降低SiHa和Caski细胞中NONHSAT070341的表达,其中SiHa细胞以转染si-NONHSAT070341-1448对NONHSAT070341表达量下调最为显著,Caski细胞以转染si-NONHSAT070341-493对NONHSAT070341的表达量下调最为显著。故选择下调最为明显的siRNA进行后续功能学实验。功能学实验发现,与si-NC组相比,si-NONHSAT070341组宫颈癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力明显降低,细胞停滞在G1期,但增加了SiHa和Caski细胞的凋亡率,同时细胞凋亡关键蛋白Caspase3的相对表达量也随之增加。***-qPCR结果表明,NONHSAT070341过表达质粒可使SiHa和Caski细胞中NONHSAT070341的表达量升高。功能学实验表明,相较于pEX-3-vector组,pEX-3-NONHSAT070341组中宫颈癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力明显增强,细胞活跃在S期,SiHa和Caski细胞的凋亡率受到抑制,Caspase3蛋白的表达水平也随之降低。4.与si-NC组相比,SiHa和Caski细胞中si-NONHSAT070341组HPV16 E7 mRNA的相对表达量降低,pRb mRNA的表达水平升高;与pEX-3-vector组相比,pEX-3-NONHSAT070341组SiHa和Caski细胞中HPV16 E7 mRNA的相对表达量增加,而pRb mRNA的相对表达量降低。结论:1.宫颈癌的发生与LncRNA NONHSAT070341的高表达有关

关键词： 结直肠癌   SNORA71C   硫酸酯酶1   CHD3   TBP   TGF-β1/Smad通路  

摘要： 目的:结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)已成为一种全球性的恶性肿瘤,其发病率和死亡率正在逐年增加。国家癌症中心2022年统计数据显示,CRC在我国癌症中发病率位列第二,死亡率位列第四。近年来,多学科综合治疗(multiple department treatment,MDT)的普及使CRC的治疗效果得到了一些改善,但是,对于局部进展期或远处转移的结直肠癌患者,其五年生存率仍然仅为53%和14%。肿瘤的侵袭转移是导致CRC预后不良的首要原因,常规治疗手段无法改善进展期肿瘤患者的预后。因此,深入阐明CRC侵袭转移的分子机理,探索新的有效治疗靶点,对提高抗CRC的疗效意义重大。核仁小RNA(small nucleolarRNAs,snoRNAs)是一类短链非编码RNA(non coding RNA,ncRNAs),通常存在于真核生物细胞核中,根据结构及功能主要分为box C/D SNORD和box H/ACA SNORA两大类。snoRNAs的经典生物学功能是参与核糖体RNA(ribosomal RNA,r RNA)的转录后修饰进程。snoRNAs在恶性肿瘤中存在异常表达,能够参与恶性肿瘤的发生、进展、转移及耐药等生物学过程。如SNORA42、SNORD78和SNORA23等,均被报道在不同类型的肿瘤组织、细胞及患者体液中表达异常。因此,进一步探究snoRNAs与CRC进展转移的关系或可为进展期CRC的诊疗提供新的思路。硫酸酯酶1(sulfatase 1,SULF1)位于细胞表面,具有选择性去除细胞表面硫酸肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycans,HSPGs)的6-O-硫酸基团的功能,能够参与调节细胞间信号传导,从而影响多种生理及病理进程。在结直肠癌中,生物信息学分析及细胞功能实验证实SULF1能够影响肿瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,其高表达也会导致肿瘤免疫微环境的改变。随着研究不断深入,也发现SULF1可作为靶基因与ncRNAs及转录因子共同构建成调控网络,影响恶性肿瘤的进展及预后,这为探究ncRNAs与SULF1之间的调控作用提供了新的研究方向。本研究基于结直肠癌细胞系,以SNORA71C为切入点,考察SNORA71C调控SULF1对结直肠癌细胞生物学行为的影响,进一步明确SNORA71C可能通过结合CHD3以影响TBP对SULF1的转录进而调控结直肠癌生物学特性的分子机制。通过本研究,我们发现并证实了SNORA71C在调控结直肠癌生物学特性中的作用机制,有望为明确snoRNAs在CRC乃至其它恶性肿瘤中的作用机制提供新的思路,为逆转癌症患者的疾病进展及发现新的临床诊疗靶点提供相关理论支持。研究方法:*** RNA的筛选鉴定与相关生物信息学分析:基于高通量测序筛选出结直肠癌及配对癌旁组织中差异表达的SNORA71C与SULF1,利用q RT-PCR与原位杂交实验分别在结直肠癌细胞与组织中验证SNORA71C的表达水平;利用TCGA数据库,分析SNORA71C对结直肠癌患者预后的影响。进一步利用组织芯片的患者临床病理信息,采用Kaplan-Meier法分析SNORA71C表达水平对患者预后的影响,采用Fisher检验、Logistic回归分析与Cox回归模型考察SNORA71C与结直肠癌患者临床病理参数的关系。通过sno RNA-m RNA的共表达分析以及sno RNA的转录组测序,发现与SNORA71C具有显著相关性的SULF1。***71C调控SULF1介导TGF-β1/Smad通路:在筛选得到的CRC细胞系HCT116和SW480中转染SNORA71C的反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASO)以构建SNORA71C沉默模型,同种细胞系中转染SNORA71C过表达慢病毒以构建SNORA71C过表达模型。通过q RT-PCR实验检测转染效率。Western blot实验检测SNORA71C过表达细胞模型中SULF1蛋白水平变化。进一步采用Western blot实验检测SULF1相关TGF-β1/Smad通路的蛋白水平变化。3.干预SNORA71C对结直肠癌细胞生物学行为的影响:在结直肠癌细胞系HCT116和SW480中,采用CCK8和平板克隆实验检测干预SNORA71C后细胞增殖能力变化;采用流式细胞术检测细胞凋亡比例的变化;采用细胞划痕和Transwell实验检测干预SNORA71C后细胞迁移与侵袭能力的改变;Western bolt实验检测迁移与侵袭指标E-cadherin、Snail与Vimentin的蛋白水平变化。***71C通过CHD3/TBP/SULF1途径调控SULF1表达的机制研究:在HCT116细胞中利

关键词： 羽扇豆醇   鼻咽癌   放射   顺铂   凋亡  

摘要： 目的:探讨羽扇豆醇对人鼻咽癌CNE2细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡、周期及对放、化疗敏感性的影响,同时探讨其凋亡机制。 方法:选用人鼻咽癌低分化鳞状细胞株CNE2细胞进行实验。CCK-8法检测羽扇豆醇对CNE2细胞增殖的影响以及羽扇豆醇联合顺铂对CNE2细胞的增殖抑制作用有无增强;细胞划痕、Transwell实验、流式细胞术分别用于检测羽扇豆醇对CNE2细胞迁移、侵袭、凋亡及周期的影响;平板细胞克隆形成实验用于检测羽扇豆醇联合X线放射处理对CNE2细胞克隆形成能力的影响;Western bloting法检测羽扇豆醇对CNE2细胞凋亡信号通路中关键蛋白Bcl-2、Bax及Cleaved caspase-3的影响,进而探究羽扇豆醇的抗肿瘤机制。 结果:羽扇豆醇呈药物浓度和时间依赖性地抑制CNE2细胞的增殖,选取羽扇豆醇40、60、80μmol/L用于后续实验。羽扇豆醇显著降低了CNE2细胞的迁移、侵袭能力。羽扇豆醇处理后的CNE2细胞出现典型的凋亡特征,G1期延长,S期、G2期缩短。羽扇豆醇提高了顺铂或X线放射对CNE2细胞增殖及克隆形成的抑制能力,同时引起CNE2细胞中Bax、Cleaved caspase-3蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达下调(所有实验结果均P<0.05或P<0.0001,差异具有统计学意义)。 结论: 1、羽扇豆醇可显著抑制鼻咽癌CNE2细胞的增殖、迁移、侵袭能力,诱导CNE2细胞的凋亡,引起细胞周期阻滞在G1期; 2、羽扇豆醇可明显提高顺铂对鼻咽癌CNE2细胞的化疗敏感性及X射线对CNE2细胞的放疗敏感性。 3、羽扇豆醇诱导CNE2细胞凋亡的发生可能与调控凋亡信号通路中凋亡蛋白Bax、凋亡启动因子Cleaved caspase-3升高及抗凋亡蛋白Bcl-2降低有关。

关键词： 乳腺癌   eEF2蛋白   细胞生物学   分子机制  

摘要： 目的:　　1.探讨eEF2是否会影响乳腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡;2.探讨eEF2促进乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的具体分子机制。　　方法:　　1.通过Real-time PCR和Western-blot技术检测eEF2在不同乳腺癌细胞系(MCF-7、Bcap-37、MDA-MB-231、MDA-MB-453、MDA-MB-468)中的表达情况;2.对eEF2表达量较高的MCF-7和MDA-MB-453细胞系进行eEF2敲低慢病毒的转染，对eEF2表达量较低的MDA-MB-231细胞系进行eEF2过表达慢病毒转染，分别构建eEF2基因沉默和过表达的乳腺癌细胞系，将敲低组MCF-7细胞分为sheEF2-1、sheEF2-2、sheEF2-3组，感染无意义shRNA序列慢病毒载体的MCF-7细胞设为阴性对照组(Control组);将过表达组MDA-MB-231细胞分成空病毒组(NC)和eEF2过表达组(eEF2),通过Real-time PCR和Western-blot法验证MCF-7和MDA-MB-231各组细胞中eEF2的表达水平以确保模型构建成功;3.通过CCK8和平板克隆形成实验检测eEF2对乳腺癌细胞增殖能力的影响　　4.通过transwell迁移和侵袭实验检测eEF2对乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响;5.通过Western-blot技术检测eEF2对乳腺癌细胞凋亡相关标志蛋白(Bcl-2、Bax和Casepase3)的影响;6.将eEF2基因敲低的MCF-7细胞和对照组进行高通量转录组测序，对测序所得的差异基因开展GO功能富集分析和KEGG富集分析，探讨eEF2调控的下游分子网络和信号通路;7.通过Western-blot技术检测PI3K/AKT/NF-KB信号通路中关键蛋白（P-PI3K P-AKT、P-NF-KB、P-IKB）的表达水平;8.用PI3K抑制剂LY294002处理eEF2过表达稳转细胞MDA-MB-231,探究PI3K的抑制能否干扰eEF2过表达时对乳腺癌细胞的功能影响。　　结果:　　***-time PCR和Western-blot结果显示，eEF2在MCF-7和MDA-MB-453细胞系中表达相对较高，在MDA-MB-231细胞系中表达相对较低;***-8实验显示，当MCF-7,MDA-MB-453细胞中沉默eEF2表达，相对于Control组，eEF2基因敲低后细胞活力明显降低，当MDA-MB-231细胞中过表达eEF2,相对于NC组，eEF2组中细胞活力明显增强;4.平板克隆形成实验显示，相比于对照组，eEF2基因敲低后细胞形成的克隆团块明显少，eEF2基因过表达后细胞形成的克隆团块明显多;***实验显示，相比于对照组，eEF2基因敲低后细胞的侵袭迁移能力明显降低，eEF2基因过表达后细胞的侵袭和迁移能力明显增强;***-blot检测凋亡相关标志物结果显示，eEF2沉默时,抑制了乳腺癌细胞的凋亡，相关标志物Bcl-2表达增高，Bax、Cleaved-Casepase3蛋白表达降低;eEF2过表达时，促进了乳腺癌细胞的凋亡，相关标志物Bcl-2表达降低，Bax、Cleaved-Casepase3蛋白表达增高;7.转录组测序的得到的差异基因通过KEGG富集分析富集到了PI3K/AKT/NF-KB经典肿瘤信号通路;***-blot技术检测PI3K/AKT/NF-KB信号通路。结果表明，相比于对照组,eEF2基因敲低时P-PI3K、P-AKT、P-NF-KB、P-IKB蛋白质的表达下降，eEF2基因过表达时中P-PI3K、P-AKT、P-NF-KB、P-IKB蛋白质的表达增加;***3K抑制剂LY294002明显干扰了由eEF2基因过表达对乳腺癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的促进作用。　　结论:　　***2促进了乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移，抑制了凋亡。　　***2可通过PI3K/AKT/NF-KB信号通路促进乳腺癌细胞的生物学行为。

关键词： 骨髓间充质干细胞   正畸牙移动   周期牵张应力   乳酸   成骨分化   增殖   迁移  

摘要： 研究目的正畸牙齿移动(orthodontic tooth movement,OTM)依赖于机械力诱导的牙槽骨改建,其中牙槽骨骨髓间充质干细胞(alveolar bone marrow mesenchymal stem cells,ABMMSCs)可以响应机械力刺激,通过增殖、迁移及成骨分化参与骨改建,是OTM的重要效应细胞。上述细胞行为常伴随细胞活跃的能量代谢重编程以满足能量需求,包括成骨分化过程中葡萄糖无氧酵解途径的上调。而乳酸作为无氧糖酵解的终产物是否在机械力刺激下发生变化及其对ABMMSCs生物学特性的影响及机制都有待进一步阐明。研究方法1.分离培养大鼠ABMMSCs,通过结晶紫染色、茜素红染色和油红O染色验证细胞的克隆能力、成骨及成脂分化潜能,采用流式细胞技术鉴定细胞表面标记物CD31、CD44、CD45、CD90的表达。对细胞施加形变率10%、频率0.5 Hz的周期性牵张力,分别持续0、6、12、24 h,应用qRT-PCR和Western blot技术分别检测ABMMSCs中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase A,LDHA)在mRNA水平及蛋白水平上的变化,应用试剂盒测定细胞内外乳酸的变化。2.建立大鼠OTM模型,通过免疫组化检测0、3、7、14 d牙槽骨组织中LDHA的表达水平,并采用试剂盒测定牙槽骨中的乳酸水平。3.使用LDHA小分子抑制剂GNE-140抑制ABMMSCs中机械力诱导的乳酸产生。采用CCK-8和细胞周期实验检测细胞增殖能力的变化,通过Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡的变化,通过细胞划痕实验测定细胞迁移能力的变化,通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色和 ALP 活性以及通过 qRT-PCR 和 Western blot 检测ALP和RUNX2的表达,探究细胞成骨分化的变化。4.通过免疫组化检测OTM过程中牙槽骨内组蛋白乳酸化修饰水平的变化,采用免疫荧光和Western blot检测周期性牵张力及GNE-140作用下组蛋白乳酸化修饰水平。采用染色质免疫共沉淀测序技术检测乳酸化修饰的组蛋白在骨改建相关基因启动子区域的富集水平,采用qRT-PCR技术验证上述基因的变化。实验结果1.显微镜下观察到ABMMSCs呈三角形或梭形,具有克隆形成、成骨及成脂分化的潜能,表面抗原CD90和CD44呈阳性,CD31和CD45呈阴性。在周期性牵张力作用下,ABMMSCs的LDHA表达及胞内及胞外乳酸水平增加。2.在OTM中牙槽骨组织中LDHA的表达水平及乳酸水平都显著上调。***-140作用下ALP和RUNX2的表达水平下调,ALP染色及ALP活性显示成骨分化被抑制。此外,GNE-140显著抑制ABMMSCs的增殖,导致细胞周期阻滞,同时观察到细胞凋亡的增加及ABMMSCs迁移能力减弱。4.在机械力刺激下,牙槽骨及ABMMSCs中组蛋白乳酸化修饰水平明显上调。在GNE-140作用下,组蛋白乳酸化修饰水平降低,同时降低了乳酸化修饰的组蛋白在骨改建相关基因启动子区域的富集水平并下调了相关基因在mRNA水平上的表达。结论机械力刺激产生适宜浓度的乳酸并调控ABMMSCs的生物学特性,在OTM期间的牙槽骨改建中发挥重要作用,表明乳酸是OTM期间牙槽骨改建的重要调节因子,为临床上控制牙齿移动和提高正畸疗效稳定性提供了潜在治疗靶点。